专利名称：：一种农药生物活性测定方法
技术领域：
：本发明属于农药生物测定领域，具体涉及一种以卤虫(ArtemiaSalina)为模式生物的农药杀虫活性生物测定方法。
背景技术：
：生物活性筛选是农药研发的重要环节，直接关系到新农药开发的效率与成败。传\统的杀虫活性生物测定主要以粘虫、家蝇、赤拟谷盗、米象、蚜虫、玉米螟、小菜蛾、菜粉蝶幼虫等标准试虫为靶标生物。这些模式生物对环境条件的要求较高，试虫的培养和大量提供是一个相当专业且较为困难的工作。另外，上述供试生物个体较大、消耗大量试材和化合物样品、占用较大实验空间、劳动强度大，因此，应用传统生物测定技术进行杀虫活性筛选的效率较低。当前，新农药研发对于高通量生物活性筛选方法的需求越来越迫切。卤虫(ArtemiaSalina)又称盐水丰年虫，在分类学上属节肢动物门甲壳纲鳃足亚纲无甲目盐水丰年虫科，是一种广温耐高盐的水生生物。卤虫含有丰富的蛋白质、脂肪、不饱和脂肪酸、微量元素和核黄素等营养物质，广泛应用于水产养殖的优质饵料。由于卤虫具有对毒物敏感、个体微小、容易获得与培养等特点，因此，有资料报导可应用于海洋、江河中有毒化学物质的毒性检测，美国国家环保局(EPA)把卤虫列为排污的毒性试验生物。但是，利用卤虫在农药杀虫活性生物测定方面的应用较少，至今未见利用卤虫进行农药生物测定方法的专利公开。
发明内容本发明的目的就在于提供一种采用卤虫为对象的农药生物活性测定和筛选方法，可以用于对现有农药品种进行杀虫活性的测定，也可以用于农药抗药性研究以及化合物或农药对环境中水生生物的安全性检测，尤其适合对植物提取物样品进行杀虫活性的快速筛选。本发明采用的技术方案—种农药生物活性测定方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将待测供试样品物用蒸馏水溶解配制成母液；难溶于水的样品先加入少量丙酮溶解，再用人工海水逐步稀释得待测供试药液，对于测供试样品物为农药时待测供试药液浓度为0.0055mg/L，测供试样品物为植物提取物时待测供试药液浓度为101000mg/L;(2)移取卤虫液10uL，内含卤虫无节幼体3040头，于24孔培养板内，然后加入1.5mL待测供试药液，置于25t:的光照度2000Lx、光照周期12L12D的光照培养箱中培养；(3)培养48h后，于解剖镜下观察卤虫无节幼体死亡个体数，计算校正死亡率，评价待测样品的杀虫生物活性。所述供试样品是农药现有的化合物杀虫剂品种或植物提取物样品。人工海水的配制参考张福2002年公开的方法，其无机盐组分及配比见表1。引证文献张福.卤虫Na/Mg比值对卤虫发育生长的影响.海湖盐与化工，2002，32(2):16-19。本发明的优点为本发明提供的方法，该卤虫靶标对大部分农药活性敏感，来源广泛并容易大量饲养；测定成本低廉，方法简单方便；所需样品量微量，对于化合物样品，一次消耗量小于0.05毫克，对于植物提取物样品，一次消耗量小于1.5毫克，尤其适合微量样品的筛选或测定。具体实施例方式为了更好地说明本发明，下面通过实施例予以进一步阐述。实验材料现有杀虫剂品种，三唑磷、毒死蜱、氟铃脲、阿维菌素、哒螨灵原药均为市售购得；竹叶提取物样品，将供试不同竹种的竹叶自然风干，粉碎成末，分别称取25g竹粉于索式提取器内，丙酮浸泡过夜。在水浴温度65t:，液料比10:l的比例下提取89h，至提取液无色。然后将提取液减压浓縮至干，4t:冷藏备用。不同规格的多孔培养板为市售产品。卤虫来源市购卤虫卵，称取卤虫卵O.OlOg于100mL量筒中，加入人工海水90mL，用NaHC03调节pH至8.08.5，置于25"恒温水浴锅内，用一小型充气泵由量筒底部缓缓充气，使虫卵保持悬浮状态，光照(2000Lx)孵化。24h后，得到孵出约4h的I期卤虫无节幼体，利用卤虫的趋光性，吸管收集，备用。试验方法通过环境因子对卤虫生物测定方法影响的研究结果表明，以卤虫作为杀虫活性生物测定的模式生物，其培养液中无机盐的含量不能低于5%。，pH值应控制在7左右，培养温度不宜超过35。C，测定过程中不宜24h持续光照。供试样品药液的配制将供试农药原药或竹叶提取物用少量丙酮溶解后，用蒸馏水配制成10g/L的母液，再用人工海水(pH保持中性)逐步稀释至供试浓度。农药原药待测供试药液浓度为0.0055mg/L，竹叶提取物待测供试药液浓度为101000mg/L;移取卤虫液10uL(无节幼体3040头)于24孔培养板内，加入1.5mL供试样品药液，同时设立相应对照。置于25t:、光照周期12L12D的培养箱中(2000Lx)培养，试验期间无需投放饵料。培养48h后，体视显微镜下观察卤虫死亡个体数及试虫总数，计算卤虫无节幼体的死亡率、校正死亡率或者存活率、校正存活率。传统蚜虫浸渍法进行供试竹叶提取物杀虫活性筛选，并将结果与该发明方法筛选的结果进行比较，验证该发明方法的可靠性。蚜虫浸渍法如下将完整、生长良好的无虫烟叶叶片，放入待测药液(提取物质量浓度为10g/L)中浸渍35秒后取出，吸去多余的药液，阴干，并将湿润的棉条包裹在叶柄处，以保持叶片湿度，减少水分散失，放在培养皿中备用。同样的办法将带虫叶片放在待测药液中浸渍35秒后取出，吸去多余的药液，然后用零号毛笔挑取大小一致、行动活泼的无翅蚜，转移到上述处理备用烟叶叶片上，每片40头，罩上纱布，盖上皿盖。每个处理重复4次，同时设立相同浓度丙酮对照及自来水对照。在温度25°C、相对湿度85%左右的培养箱中培养，分别于24h，48h和72h检查死亡蚜虫个体，计算校正死亡率。按上述试验方法，分别对三唑磷、毒死蜱、氟铃脲、阿维菌素、哒螨灵原药进行了杀虫活性生物测定，结果见表2。应用该发明方法对12种竹叶提取物进行了杀虫活性筛选，结果见表3。应用传统蚜虫浸渍法对上述12种竹叶提取物杀虫活性的筛选结果见表4。以上试验结果表明，卤虫不仅可以有效地检测现有农药品种在不同剂量下的杀虫活性，同时也能快速高效地进行植物提取物的杀虫活性筛选，并与传统蚜虫浸渍法进行杀虫活性筛选的结果是一致的。对卤虫活性高的提取物对蚜虫也表现出较好的生物活性，对卤虫活性低的，对蚜虫效果也比较差。由于卤虫相对于蚜虫对杀虫活性物质更加敏感，因此，从上述结果中可见植物提取物对卤虫的杀虫活性明显高于蚜虫。表格表1人工海水无机盐成份表(lOOOmL)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2应用该发明方法对供试农药杀虫活性的测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注1.测定时间为48h。表3应用该发明方法对供试竹叶提取物杀虫活性筛选结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求一种农药生物活性测定方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将待测供试样品物用蒸馏水溶解配制成母液；难溶于水的样品先加入少量丙酮溶解，再用人工海水逐步稀释得待测供试药液，对于测供试样品物为农药时待测供试药液浓度为0.005～5mg/L，测供试样品物为植物提取物时待测供试药液浓度为10～1000mg/L；(2)移取卤虫液10uL，内含卤虫无节幼体30～40头，于24孔培养板内，然后加入1.5mL待测供试药液，置于25℃的光照度2000Lx、光照周期12L～12D的光照培养箱中培养；(3)培养48h后，于解剖镜下观察卤虫无节幼体死亡个体数，计算校正死亡率，评价待测样品的杀虫生物活性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述供试样品是农药现有的化合物杀虫剂品种或植物提取物样品。3.根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述供试样品是三唑磷、毒死蜱、氟铃脲、阿维菌素或哒螨灵原药。全文摘要本发明公开了一种农药生物活性测定方法，包括以下步骤(1)将供试样品(农药原药或植物提取物)用蒸馏水配制成10g/L的母液，难溶于水的样品先加入少量丙酮溶解，再用人工海水逐步稀释至供试浓度。(2)移取卤虫液10uL，于24孔培养板内，然后加入1.5mL待测供试农药药液，置于25℃的光照培养箱中培养，试验期间无需投放饵料。每个处理重复4次，同时设立含一定量丙酮的人工海水对照。(3)培养48h后，于解剖镜下观察卤虫无节幼体死亡个体数，计算校正死亡率，评价待测样品的杀虫生物活性。本发明提供的方法，该靶标对大部分农药活性敏感，来源广泛并容易大量饲养；测定成本低廉，方法简单方便；所需样品量微量，尤其适合微量样品的筛选或测定。文档编号G01N33/00GK101788545SQ20101010790公开日2010年7月28日申请日期2010年2月4日优先权日2010年2月4日发明者吴祥为,唐俊,姚曦,岳永德,操海群,汤锋,王进,花日茂申请人:国际竹藤网络中心