专利名称：：基于酶与蛋白质交联的检测空气或水体中微生物含量的方法
技术领域：
：本发明属于微生物检测
技术领域：
，具体地说，本发明描述了一种基于酶与蛋白质交联、用于检测空气或水体中的微生物含量的检测方法。
背景技术：
：空气、水是维持人类生命不可或缺的物质，它们直接进入人体或与人接触。如果空气、水带有大量的病原微生物，将严重威胁人类的健康。因此通过检测空气和水中微生物的含量，对环境质量进行监控显得极为重要。空气中的微生物主要为细菌和真菌，病毒含量较少；由于空气中营养物质缺乏、水分不充足、温差大，且有较强的紫外线辐射，细菌和真菌在短时间内就会死亡，抵抗力较强的微生物则可以存活几天、几周甚至数月，总体含量通常为25005000cfu/m3，但不同的时空其微生物含量分布相差极大。水体中由于各水域中营养物质的组成、浓度、水温、溶解氧的差异及微生物的来源不同等原因，微生物的种类、数量相差也很大。目前检测空气和水体中微生物含量的方法主要有一、微菌落计数沉降计数法、滤膜法、撞击平皿法和吸收管法，具体是将一定量的样品(或样品稀释液)经膜过滤、撞击平皿法或吸收管法将微生物收集，再将收集到的微生物放在培养基上或放在浸行液体培养基的厚纸板上，在适宜温度条件下培养一段时间后计算菌落数，此法是最早期的用于微生物计数的方法，因其检测结果准确可靠，至今仍是较为普遍的微生物检测方法之一，但微菌落计数要求无菌操作，且因扩增培养时间长导致检测时间较长，至少需要10小时以上才能出检测结果；二、阻抗测定法，这种方法依据的原理是微生物在培养基中不断增殖的过程中，其代谢产物的增加会导致液体培养基中电阻的变化，使介质的导电性增强，即电阻减小，只有当微生物数目达到IO6-IO7个/毫升时，这种电阻的变化才能被记录到，电阻或导电性变化达到可检测的时刻，称为检出时间，此法难以测量电导变化的微生物，且检测仪器费用较高；三、ATP生物发光法，应用荧光素_荧光素酶制剂进行的，在活细胞中ATP含量近乎是恒定的，利用特殊的酶试剂水解掉细菌膜，使ATP释放，ATP与荧光素-荧光素酶制剂反应变成AMP和光，产生的光强度与ATP成正比，通过测定光强度可确定细菌浓度，此检测法快速，仅需十几秒便可出检测结果，但检测成本高，且易受干扰物的影响；四、过氧化物酶生物检测法，它是根据微生物会在新陈代谢时产生一种过氧化物酶，而过氧化物酶的产生与生物活性的高低成一定比例。所以样品中现存的酶的数量可以反应当前总的生物活性。通过检测反应物与酶反应释放氧气，并转换成数量读出(BMR)，此检测法快速灵敏，但仅局限于对好氧微生物的检测。
发明内容本发明的目的，就是提供一种操作简便、分析快速准确、灵敏度高成本较低、具备现场可操作性、基于酶与蛋白质交联的检测空气和水体中微生物含量的方法。本发明先在待测样品溶液中(若检测空气微生物则先将空气中的微生物收集于水相)加入酶和交联剂，通过交联剂将酶和微生物的表面蛋白质交联，膜过滤收集酶_微生物交联结合物，加入特异性底物进行颜色反应或是电化学反应，最后通过合适的方法检测信号，其检测值的大小与样品中微生物的含量直接对应，从而实现对微生物含量的快速检测。由于酶的催化效率极高，可以极大地放大反应效果，使测定方法达到很高的灵敏度，酶促反应的过程如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>无色的还原型染料_供氢体(DH2)，在结合在微生物表面蛋白上的酶的催化作用下，可生成有色的产物_氧化型染料(D)。本发明的基于酶与蛋白质交联的微生物定量检测方法，具体有如下步骤一、交联分别将酶和交联剂加入待测样品中，室温20_25°C静置交联；若是检测空气微生物，所述的待测样品则为使用现有技术将空气中的微生物收集于水相；所述的加入的酶分子数与样品中微生物数之比大于161；所述的交联剂加入的量依交联剂种类和交联方式按现有技术规范确定；所述的静置时间依交联剂的选择和交联方式按现有技术规范确定；二、分离采用0.22μm孔径微孔膜过滤法收集交联微生物，用洗膜缓冲液冲洗去除未交联的酶液；三、检测信号加入特异性底物显色液，显色或产生电化学信号；四、检测显色1分钟后加入终止液，之后用紫外分光光度计检测450nm吸光度(0D450)，与不含有微生物的对照样品比较，得出微生物浓度。所述的试剂及待测样品均需平衡至室温20-25°C。所述的酶为辣根过氧化物酶。所述的交联剂为戊二醛，或是4mg/ml的碳化二亚胺加6mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺。所述的显色液为以24.3ml0.lmol/L的柠檬酸与25.7ml0.2mol/L的磷酸氢二钠混合，再加入50ml水配制而成的9.9mlpH为5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，加入0.Iml1%的四甲基联苯胺TMB和10μ130%双氧水H2O2制成。所述的洗膜缓冲液为以28ml0.2MNaH2PCM(磷酸二氢钠)与72ml0.2MNa2HPCM(磷酸氢二钠)混合配制而成的PH=7.2的PBSbuffer(磷酸盐缓冲液)。所述的终止液为2M的H2SO4(硫酸)。本发明的特点是通过交联剂将酶与微生物表面的蛋白质结合，利用酶催反应的高效性极大地放大检测结果，使检测方法灵敏、快速；此外，上述方法可以是人工操作完成，也可由仪器自动完成，使操作更为简便、准确。具体实施例方式本发明对所有微生物都可以检测，以下实施例以大肠杆菌为例。实施例一1.试剂的准备(1)显色液取9.9mlpH为5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液(24.3ml0.lmol/L的柠檬酸与25.7ml0.2mol/L的磷酸氢二钠混合，再加入50ml水配制而成)，加入0.Iml的四甲基联苯胺(TMB)和10μ130%双氧水(H2O2)；(2)交联剂戊二醛；(3)酶液lmg/ml的辣根过氧化物酶(HRP)；(4)洗膜缓冲液ΡΗ=7.2的PBSbuffer(28ml0.2MNaH2P04与72ml0.2MNa2HPCM混合配制而成)；(5)终止液2M的H2SO4；(6)待测样品浓度分别为0、104cfu/ml、105cfu/ml、106cfu/ml的大肠杆菌Ε.coli；试验前，将所有试剂及样品平衡至室温20-25°C；2.交联吸取800μ1待测样品，分别加入1.5mlEP管中，然后分别加入100μ1酶液和600μ1交联剂，混合均勻，室温静置30分钟；3.分离0.22μm孔径微孔膜过滤收集交联菌，用缓冲液冲洗干净去除未交联酶液；4.显色每管加显色液800μ1；5.终止显色1分钟后每管加入终止液200μ1；6.检测用紫外分光光度计检测450nm吸光度(OD450)；7.结果分析与不含有微生物的对照样品比较，才有戊二醛作为交联剂的辣根过氧化物酶交联方法检测大肠杆菌的灵敏度可达104CfU/ml，检测结果见下面表1。表1用戊二醛作为交联剂检测各浓度大肠杆菌样品液检测结果E.coli菌浓度I0IO4IO5IO6cfu/mlOD4500.0542.2024.2757.360实施例二1.试剂的准备(1)显色液取9.9mlpH为5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液(24.3ml0.lmol/L的柠檬酸与25.7ml0.2mol/L的磷酸氢二钠混合，再加入50ml水配制而成)，加入0.Iml的四甲基联苯胺(TMB)和10μ130%双氧水(H2O2)；(2)交联剂4mg/ml的碳化二亚胺、6mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺；(3)酶液lmg/ml的辣根过氧化物酶(HRP)；(4)洗膜缓冲液ΡΗ=7.2的PBSbuffer(28ml0.2MNaH2P04与72ml0.2MNa2HPCM混合配制而成)；(5)终止液2M的H2SO4；(6)待测样品浓度分别为0、104cfu/ml、105cfu/ml、106cfu/ml的大肠杆菌Ε·coli(大肠杆菌)试验前，所有试剂及样品均需平衡至室温20_25°C；2.交联吸取800μ1待测样品，按顺序加入1.5mlEP管中，分别加入100μ1的碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温静置15min后加入100μ1酶液，室温静置60分钟；3.分离0.22μm孔径微孔膜过滤收集交联菌，用缓冲液冲洗干净去除未交联酶液；4.显色每管加显色液800μ1；5.终止显色1分钟后每管加入终止液200μ1；6.检测用紫外分光光度计检测450nm吸光度(OD450)；7.结果分析与不含有微生物的对照样品比较，才有碳化二亚胺作为交联剂的辣根过氧化物酶交联方法检测大肠杆菌的灵敏度可达104CfU/ml，检测结果见下面表2。表2用碳二业胺作为交联剂检测各浓度大肠杆菌样品液检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求一种基于酶与蛋白质交联的检测空气或水体中微生物含量的方法，其特征是先在待测样品溶液中加入酶和交联剂，通过交联剂将酶与微生物的表面蛋白质交联，膜过滤收集酶-微生物交联结合物，然后加入特异性底物产生检测信号，信号检测值的大小与样品中微生物的含量直接相关，从而实现对样品中微生物的快速定量检测；若检测空气微生物则先将空气中的微生物收集于水相。2.按照权利要求1所述的基于酶与蛋白质交联的检测空气或水体中微生物含量的方法，其特征是所述加入试剂的种类和步骤在待测样品中先加入酶和交联剂，充分交联；再膜过滤收集微生物交联产物，最后加入底物，检测相应的信号即可知样品中微生物的含量。3.按照权利要求1或2所述的基于酶与蛋白质交联的检测空气或水体中微生物含量的方法，其特征是步骤依次如下一、交联分别将酶和交联剂加入待测样品中，室温20-25°C静置交联；若是检测空气微生物，所述的待测样品则使用现有技术将空气中的微生物收集于水相；所述的加入的酶分子数与样品中微生物数之比大于161；所述的交联剂加入的量依交联剂种类和交联方式按现有技术规范确定；所述的静置时间依交联剂的选择和交联方式按现有技术规范确定；二、分离采用0.22μm孔径微孔膜过滤法收集交联微生物，用洗膜缓冲液冲洗去除未交联的酶液；三、检测信号加入特异性底物显色液，显色或产生电化学信号；四、检测显色3060秒之后用紫外分光光度计检测450nm吸光度，与不含有微生物的对照样品比较，得出微生物浓度；所述的试剂及待测样品均需平衡至室温20-25°C。4.根据权利要求3所述的基于酶与蛋白质交联的检测空气或水体中微生物含量的方法，其特征是所述的酶为辣根过氧化物酶。5.根据权利要求3所述的基于酶与蛋白质交联的检测空气或水体中微生物含量的方法，其特征是所述的交联剂为戊二醛，或是4mg/ml的碳化二亚胺加6mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺。6.根据权利要求3所述的基于酶与蛋白质交联的检测空气或水体中微生物含量的方法，其特征是所述的显色液为以24.3ml0.lmol/L的柠檬酸与25.7ml0.2mol/L的磷酸氢二钠混合，再加入50ml水配制而成的9.9mlpH为5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，加入0.Iml的四甲基联苯胺TMB和10μ130%双氧水H2O2制成。7.根据权利要求3所述的基于酶与蛋白质交联的检测空气或水体中微生物含量的方法，其特征是所述的洗膜缓冲液为以28ml0.2M磷酸二氢钠与72ml0.2M磷酸氢二钠混合配制而成的PH=7.2的磷酸盐缓冲液。8.根据权利要求3所述的基于酶与蛋白质交联的检测空气或水体中微生物含量的方法，其特征是所述的终止液为2M的硫酸。全文摘要一种基于酶与蛋白质交联的检测空气或水体中微生物含量的方法在待测样品溶液中(若检测空气微生物则先将空气中的微生物收集于水相)加入酶和交联剂，通过交联剂将酶和微生物的表面蛋白质交联，膜过滤收集酶-微生物交联结合物，加入特异性底物进行颜色反应或是电化学反应，最后通过合适的方法检测信号，其检测值的大小与样品中微生物的含量直接对应，从而实现对微生物含量的快速检测。由于酶的催化效率极高，可以极大地放大反应效果，使测定方法快速且达到很高的灵敏度，此外，上述方法可以是人工操作完成，也可由仪器自动完成，使操作更为简便、准确。文档编号G01N21/33GK101818190SQ20101010492公开日2010年9月1日申请日期2010年1月29日优先权日2010年1月29日发明者罗国湧,邢怡铭,郭永超,钟明,黄英敏申请人:广州市香港科大霍英东研究院;利民(番禺南沙)电器发展有限公司