用于治疗传染病和肿瘤的方法

专利名称：用于治疗传染病和肿瘤的方法
技术领域：
本申请涉及拮抗剂的应用，具体的说，涉及用于治疗持续感染和肿瘤的PD-I拮抗物的应用，本发明还涉及用于确定PD-I拮抗剂有效剂量的方法。
背景技术：
宿主免疫应答的免疫抑制在持续感染和肿瘤免疫抑制过程中起着重要的作用。持续感染是一种传染病，这种传染病的病毒不明确，但是一直存在于受感染个体的特定细胞中。持续感染通常包括潜伏阶段和生产性感染阶段，在生产性感染阶段不会快速的致死诉诸细胞或者对宿主细胞产生过度损害。这里有三种持久性病毒-宿主相互作用潜伏期、 慢性感染和慢感染。潜伏性感染的特点在于初次感染之后持续存在的感染性病毒，并且可能包括慢性或者循环性疾病。慢感染的特点在于进行性疾病之后漫长的潜伏期。与潜伏的和慢性感染不同，慢感染可能不会从机型的病毒复制开始。在持续感染期间，病毒基因组或者被稳定的整合到细胞DNA中，或者被维持在附加体上。某些病毒会产生持续感染，所述病毒例如人类T细胞白血病病毒、埃-巴二氏病毒、细胞肥大病毒、疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、家畜囊虫病、乳多空病毒、嗜异性鼠白血病病毒相关病毒(Xenotropic murine leukemia virus-related virus, XMRV)、朊病毒、肝炎病毒、腺病毒、微细小病毒和乳头状瘤病毒。用于维持持续感染的机制包括病毒和细胞基因表达的调节以及宿主免疫应答反应的修饰。通过各式各样的刺激可以使潜伏性感染再激活。所述刺激包括细胞生理学方面得变化、另一种病毒的过度感染和身体紧张或外伤。宿主免疫抑制反映常常与许多持续性病毒感染的再活化有关。许多研究表明在诊断出癌症的病人体内缺乏免疫反应。已经识别出许多与具体的癌症相关的肿瘤抗原。根据多重的实体肿瘤已经定义了许多肿瘤抗原通过免疫性定义的 MAGE 1、2、3 ；MART-I/ 黑素-A、gplOO、癌胚抗原(CEA)、HER_2、粘蛋白(即，MUC-1)、前列腺-特异性抗原(PSA)、和前列腺酸性磷酸酶(PAP)。此外，病毒蛋白质，例如乙型肝炎病毒 (HBV)、埃-巴二氏病毒蛋白(EBV)和人类乳头瘤(HPV)病毒蛋白已经被证明分别在肝细胞性肝癌、淋巴腺瘤、和颈部癌的发展过程中是十分重要的。然而，由于诊断出患有癌症的病人的免疫抑制作用，这些病人天生的免疫系统通常不能应答肿瘤抗原。被动免疫疗法和主动免疫疗法都已经被建议用于肿瘤的治疗过程中。被动免疫性向所关心的主体提供了免疫反应的一种组分，例如抗体或细胞毒性T细胞。自动免疫疗法利用一种治疗剂来活化内源性免疫反应，所述治疗剂例如细胞因子、抗体或化合物，其中， 所述免疫系统开始将肿瘤识别为外源物质。被动免疫疗法和主动免疫疗法二者的引入已经在特定的癌症类型的治疗方面取得了成功。总的来说，这里存在一种需要，来提供安全并且有效的治疗疾病的治疗方法，所述疾病例如，自身免疫性疾病、炎症性紊乱、变应性、移植排异反应、癌症、免疫缺陷、及其他与免疫系统有关的紊乱。这里还存在一种需要，来提供确定一种治疗剂的某一特定剂量是否能够有效治疗主体的方法，所述治疗剂例如，PD-I拮抗剂。

发明内容
PD-I拮抗剂降低了 PD-I的表达和/或活性。患有传染病的患者，例如患有持续感染的患者可以使用程序性死亡-1多肽(PD-I)拮抗剂来治疗。患有肿瘤的患者也可以使用程序性死亡-1多肽(PD-I)拮抗剂来治疗。另外，该患者可以通过移植治疗有效量的活化的T细胞来治疗，所述活化的T细胞能够识别与治疗有效量的程序性死亡-1多肽(PD-I) 拮抗剂结合的所关心的抗原。免疫反应可以在哺乳动物中测定。在几个实施方案中，这里公开的治疗方法包括B 细胞的测定。在一些实施方案中，该方法包括测定来自主体的样品中记忆B细胞的增殖作用。在一些实施方案中，这里公开了用于测定PD-I拮抗剂在给药PD-I拮抗剂的主体体内功效的方法。这些方法包括测定来自给药PD-I拮抗剂的主体的样品中记忆B细胞的增殖作用，其中，与参照相比，来自样品中的记忆B细胞增殖作用的增加表示PD-I拮抗剂能够有效的治疗主体。这里还公开了用于确定对治疗主体有效的PD-I拮抗剂剂量的方法。这些方法包括对主体给药第一剂量的PD-I拮抗剂；确定来自主体的第一样品中记忆B细胞的增殖作用。与参照相比，来自第一样品的记忆B细胞增殖作用的增加表示第一剂量的PD-I拮抗剂能够有效的治疗主体。与参照相比，记忆B细胞增殖作用不存在显著的改变表示第一剂量的PD-I拮抗剂不足以治疗主体。根据下面对几个实施方案的详细说明，并参考附图，前述的和其他的特点和优势会变得更加显而易见。


图IA是一种条形图，显示了程序性死亡-1 (PD-I) mRNA在DbGP33_41和/或 DbGP276-286特异性T细胞中的水平，所述DbGP33_41和/或DbGP276_286特异性T细胞来自未实验的转基因老鼠，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)阿姆斯特朗免疫(感染后大约30天)感染的老鼠或⑶4-衰竭的LCMV-C1-13感染的老鼠(感染后大约30天)，通过基因矩阵分析来调节。图IB是一系列流式细胞计量术实验图，显示了在LCMV阿姆斯特朗免疫和CD4衰竭LCMV-C1-13感染的老鼠体内感染大约60天之后在⑶8+四聚体T细胞上程序性死亡多肽PD-I表面表达。在用LCMV-C1-13病毒进行慢性感染(标记为〃慢性的〃)大约60天之后，无反应性的CD8+T细胞在该细胞表面表达高水平的程序性死亡多肽(PD-I)，但是在清除急性LCMV阿姆斯特朗感染之后(标记为“免疫”)，病毒-特异性⑶8+T细胞不表达程序性死亡多肽(PD-I)。图IC是一系列流式细胞计量术实验图，显示了来自长期感染和未感染的老鼠体内的脾细胞中PD-Ll的存在。这一结果证明PD-Ll在被病毒感染的脾细胞上表达量是最高的。图2A是一系列散布图，显示了与未治疗的参照相比，当从感染后第23-37天开始对C1-13感染的老鼠进行治疗时，DbNP396-404特异性和DbGP33_41特异性CD8+T细胞存在大约2倍的增加。为了确定在功能方面的变化，作为对8种不同的LCMV抗原决定簇的响应，测定IFN-Y和TNF-α的产量。图2Β是一种散布图，显示了当测定所有已知的⑶8+Τ 细胞特异性时，LCMV特异性CD8+T细胞的总数存在2. 3倍的增加。图2C是一系列流式细胞计图，显示了响应于8种不同的LCMV抗原决定簇时IFN-γ和TNF-α的产量。图2D是一种散布图，显示了受治疗的小鼠体内更多的病毒特异性CD8+T细胞能够生产TNF-α。图 2E是一系列直方图，显示了 PD-Ll阻断剂也会在脾、肝、肺和血清中导致增加的病毒控制。图3A显示，相对于参照(标记为“untx”)，从感染后第46天到60天，在⑶4_衰竭C1-13感染的老鼠体内，DbGP276-286特异性CD8+T细胞(标记为GP33和GP276)的数目增加。所述老鼠用抗-PD-L1(标记为“PD-L1")处理。这一结果说明，用抗-PD-Ll (标记为〃 PD-L1")处理后的老鼠比未被处理的老鼠多大约7倍的DbGP276-286特异性脾 ⑶8+T细胞和大约4倍的DbGP33-41特异性脾⑶8+T细胞。图是一系列流式细胞计实验图像，显示了与未被处理的参照(标记为“untx”)相比，从感染后第46天到60天，在用抗-PD-L1(标记为“PD-L1")处理过的⑶4-衰竭的C1-13感染后的老鼠的脾脏中， DbGP33-41和DbGP276-286特异性CD8+T细胞出现的频率增加。图3C是一系列流式细胞计实验图像，显示了通过5-溴脱氧尿核苷结合和Ki67表达测定的抗PD-Ll-处理后的小鼠体内DbGP276-286特异性⑶8+T细胞增加的增殖。图3D显示了具有高⑶8+T细胞扩张水平的小鼠，通过比较外周血液单核细胞(PBMC)中DbGP276特异性⑶8+T细胞和脾中的 DbGP276-286特异性⑶8+T细胞显示了在外周血液单核细胞(PBMC)中可评估的反应。图4A是一系列图表显示了与参照相比，在抗-PD-Ll-治疗后的老鼠体内能够产生 IFN- γ的DbGP276486和DbGP33_41特异性CD8+T细胞的增加。在抗-PD-Ll-治疗后的老鼠体内还检测出较高出现频度的DbNP396-404、KbNP205-212、DbNP166-175和DbGP92_101特异性CD8+T细胞。图4B表明了在抗-PD-Ll-治疗后的老鼠体内，50%的DbGP276486特异性 ⑶8+T细胞能够产生IFN-γ，与此相比，在参照老鼠体内只有20%的DbGP276-286特异性 ⑶8+T细胞能够产生IFN- γ。图4C是一系列流式细胞计实验图像，表明了相对于未处理过的慢性感染后的老鼠，抗-PD-Ll-处理的慢性感染后的老鼠能够产生较高水平的TNF-α， 但是相对于用LCMV阿姆斯特朗病毒感染后的免疫老鼠，抗-PD-Ll-处理的慢性感染后的老鼠只能产生的较低水平的TNF-α。图4D是使用51Cr释放试验测定的结果，显示了与未处理的感染的老鼠相比，用抗-PD-Ll处理LCMV-C1-13感染的老鼠后，能够更新病毒特异性T 细胞的体外溶解活性。图4E是一系列图标，表明在经过抗-PD-Ll-处理的LCMV-C1-13感染老鼠的各个器官中病毒滴定度的减少。与未经处理的老鼠相比，在用抗-PD-Ll治疗两星期后，在脾脏中，病毒滴定度减少了大约3倍，在肝脏中，病毒滴定度减少了 4倍，在肺中，病毒滴定度减少了 2倍，在血清中，病毒滴定度减少了 2倍。图5A是一系列流式细胞计实验图像，显示了使用10种艾滋病病毒四聚物进行的 PD-I表面表达，所述艾滋病病毒四聚物对起支配作用的抗原决定簇具有特异性，所述起支配作用的抗原决定簇靶向慢性分化体C艾滋病病毒感染。所述百分比表示的是PD-I+四聚体细胞百分比。图5B是一系列图表显示了在未经抗逆转录病毒治疗的个体中，与总CD8+T 细胞群体相比，艾滋病病毒-特异性⑶8+T细胞上PD-I的百分比和MFI被显著的上调了 (P < 0. 0001)，并且，相对于艾滋病病毒-血清反应阴性的对照物，艾滋病病毒-感染的总 CD8+T细胞群种上的PD-I增加(ρ分别为p = 0. 0033和ρ < 0. 0001)。从65个艾滋病病毒-感染的个体和11个艾滋病病毒血清反应阴性对照物处获得120种艾滋病病毒四聚物着色体，对这些着色体进校分析。图5C显示了四聚体+细胞上PD-I+表达的中值百分比和 MFL·图5D描绘了进行多重可检测反应的个体内不同抗原决定簇特异性群体上PD-I+细胞百分比的变化。横条信号表明各个个体内PD-I+艾滋病病毒四聚体细胞的中值百分比。图6Α是一系列图表，表明在通过四聚体染色剂测定之后，艾滋病病毒-特异性 CD8+T细胞的数目和血浆病毒负载量之间没有关系，而在四聚体细胞上PD-I的百分比和 MFI都与血浆病毒负载量成正比(ρ分别为ρ = 0. 0013和ρ < 0. 0001)。图6Β是一系列图表，表示艾滋病病毒四聚体细胞和CD4计数之间没有关系，而四聚体细胞上PD-I的百分比和MFI都与CD4计数成反比(ρ分别为ρ = 0. 0046和ρ = 0. 0150)。图6C表明在总CD8+T 细胞群种上PD-I的百分比和MFI与血浆病毒负载量正向相关(ρ分别为ρ = 0. 0021和ρ < 0. 0001)。图6D描述了在总⑶8+Τ细胞群种上PD-I的百分比和MFI与⑶4计数反向相关(P 分别为 ρ = 0. 0049 和 ρ = 0. 0006)。图7Α是一系列流式细胞计实验图像，显示了从主体SK222获得的B*4201TL9_特异性⑶8+T细胞的代表性的表型染色，在所述主体SK222中，98%的B*4201 TL9-特异性 ⑶8+T细胞是PD-1+。图7B表示了人的表型数据概要，在这些人中，95%以上的艾滋病病毒-特异性⑶8+T细胞是PD-1+。对于每个指定的表型标记物，分析7到19个样品。所述横条表明四聚体+PD-I+细胞的中值百分比，所述细胞对指定的标记物是阳性的。图8A是一系列流式细胞计实验图像，表示了 a B*4201阳性主体的代表性的增值实验数据。在用肽刺激6天之后，在有抗-PD-Ll阻断抗体参与的情况下，B*4201 TL9-特异性⑶8+T细胞的百分比从5. 7%增加到12. 4%。图8B是一种线状图，描述了概括性的增殖试验数据，该数据显示在有抗-PD-Ll阻断抗体参与的情况下，艾滋病病毒-特异性CD8+T 细胞的增值作用有显著的增加(n = 28，ρ = 0.0006，对偶T检验)。图8C是一种条形图， 显示了各个病人身上PD-1/PD-L1阻断剂对艾滋病病毒-特异性CD8+T细胞增殖作用的区别效应。白色信号棒显示了在肽单独存在的情况下四聚体+细胞的成倍增加，黑色信号棒显示了在肽和抗-PD-Ll阻断抗体存在的情况下四聚体+细胞的成倍增加。对一个以上抗原决定簇进行CFSE试验的个体分别用星号、正方形或三角形符号表示。图9A-9D是一系列图和图表显示了在慢性感染的老鼠体内，与PD-Ll阻断剂结合的治疗性疫苗对抗原-特异性CD8-T细胞出现率和病毒滴定度的协同效应。图9Α是实验方案的示意图显示了在感染后第4周对LCMV克隆-13 (CL-13)-感染的老鼠接种野生型牛痘病毒疫苗(VV/WT)或表达LCMV GP33-41单抗原决定簇的牛痘病毒疫苗(VV/GP33)。同时，每隔两天用或者不用抗PD-Ll处理老鼠5次。图9Β是一系列流式细胞计实验图像，显示了治疗后1星期GP33-特异性⑶8-T细胞和GP276-特异性⑶8-T细胞在PBMC中的频率。 数目代表每个CD8-T细胞中四聚体-阳性细胞的频率。数据显示的是三个实验的数据。图 9C-9D显示了治疗之后GP33-特异性CD8-T细胞和GP276-特异性CD8-T细胞在血液中的出现频率(图9C)和病毒滴定度(图9D)。在指定的时间点，分别用四聚体染色剂和噬菌斑试验来检测血液中四聚体-阳性CD8-T细胞数目和病毒滴定度的变化。同时显示了用VV/WT 或VV/GP33(直线)感染并用抗-PD-Ll处理(阴影区)之后，个体老鼠(上面的四组)和多种老鼠(下面一组)中四聚体-阳性CD8-T细胞的数目和病毒滴定度。虚线表示了病毒检测限制，从三组实验中取平均值作为实验结果。图10A-10D是一种图表和数字图像，显示了小鼠不同的组织中增加的抗原特异性 CD8-T细胞和提高的病毒控制，所述小鼠用结合有PD-Ll阻断剂的治疗性疫苗处理。图IOA 是一系列流式细胞计实验图像显示了治疗4星期后GP33-特异性⑶8-T细胞在不同的组织中的出现率。数字代表了每CD8-T细胞中GP33四聚体-阳性细胞的出现率。所述数据代表了两个实验的实验数据。图IOB显示了治疗4星期后GP33-特异性CD8-T细胞在不同的组织中的数目。图IOC是一系列条形图显示了治疗后2周(黑色柱)和4周(空白柱)后在指定的组织中的病毒滴定度。虚线表示病毒检测限制。每组的老鼠数η = 6。从两组实验数据中取平均值作为结果。图IOD是治疗两周后，带有LCMV抗原(红色)的脾免疫着色剂数字图像。放大倍数，X20。图11A-11D表示了通过治疗性疫苗结合PD-Ll阻断剂造成的耗尽⑶8_Τ细胞的提高的功能恢复。图IlA是一系列流式细胞计试验图像，显示了接种疫苗的老鼠在治疗4星期后皮细胞中IFN-γ的产生和脱粒。使用指定的多肽，在α CD107/ab抗体存在的情况下刺激脾细胞，然后为了 IFN-Y进行共染色。所示附图针对CD8-T细胞，并且代表了两个相互独立的试验。图IlB显示了每个⑶8-T细胞中IFN-Y+⑶107+细胞的百分比，这里的⑶-8细胞对图IlA中所示的LCMV肽具有特异性，所述IFN-ZCD107+细胞的百分比是从多个小鼠 (对于每个反应η = 6)中概况所得的。所得结果为两个实验所共有。图IlC显示了 CD8-T 细胞中TNF-α的生产，其中，所述⑶8-T细胞能够在接种疫苗的老鼠体内产生IFN-Y。在用 GP33-41或者GP276-286肽刺激脾细胞之后，产生IFN- γ的⑶8-Τ细胞是门控的，并且使用 IFN-y (X轴)对TNF-a (Y轴)绘制曲线。在曲线上较高或者较低的数值分别表示TNF-α + 细胞相对于IFN- y +细胞的频率和IFN- y +的平均荧光强度(MFI)。数据代表了两个相互独立的试验。图IlD显示了用于图11(所示6 33-41或者6 276-286肽的每个0^-^ +细胞中TNF-α +细胞的百分比，该百分比是从多个小鼠(对于每个反应n = 6)中概况得到的。图12Α-12Β显示了与PD-Ll阻断剂结合的治疗性疫苗的作用能够改变慢性感染的老鼠体内抗原特异性CD8-T细胞表型。图12Α表示了 GP33四聚体特异性CD8-T细胞在PBMC 中治疗后指定的时间点的表型。针对GP33+CD8-T细胞绘制柱状图。图中的百分数表示了能够高水平的表达CD27或者CD127的群体的出现频率。丝氨酸蛋白酶B在柱状图上的数值代表了表达的平均荧光强度(MFI)。这些数据代表了三个不同的试验。图12Β显示了在治疗四周之后不同组织中GP33四聚体特异性⑶8-Τ细胞的表型改变。针对GP33+⑶8-Τ细胞绘制柱状图。图中的百分数表示了能够高水平的表达CD127或者PD-I的群体的出现频率。 丝氨酸蛋白酶B和Bcl-2在柱状图上的数值代表了表达的平均荧光强度(MFI)。这些数据代表了两个不同的试验。
图13A-13E显示了与PD-Ll阻断剂相结合的治疗性疫苗在恢复“无帮助性”耗尽的CD8 T细胞功能恢复方面的协同效应。图13A是方案的示意图。使小鼠的CD4 T细胞衰竭，然后用LCMV克隆-13感染。在感染七星期后，一些老鼠用野生型的疫苗性病毒(VV/WT) 或者LCMV GP33-41抗原决定簇表达性疫苗病毒(VV/GP33)接种疫苗。同时，使用α PD-Ll 或其同型体每三天治疗小鼠5次。在最初的抗体治疗5周之后，杀死老鼠进行分析。图13Β 是一系列流式细胞计图和一种柱状图，表示了治疗四星期后GP33-特异性CD8-T细胞在指定的组织中的出现频率。数值代表了每个CD-T细胞中GP33四聚体-阳性细胞的出现频率。另外还概括了治疗两星期之后在不同组织的CD8-T细胞中GP33-特异性细胞的出现频率。图13C是一系列流式细胞计图，表示了试验所得结果。其中在aCD107a/b抗体存在的情况下用GP33肽刺激脾细胞，并随后为了 IFN-Y进行共染色。针对CD8-T细胞绘图。概括多个小鼠的对GP33肽具有特异性的⑶8-T细胞中IFN- Y+⑶107+细胞的百分率。图13D 显示了在用GP33肽刺激之后每个Db-限制性GP33-41四聚体阳性细胞中IFN-Y +细胞的百分比，该百分比从多个老鼠中概括得出。图13E表示了在治疗两星期后在指定的组织中的病毒滴定度柱状图。所有的制图都代表了两个试验并且所概括的结果味两个实现所共有 (n = 6只老鼠/组)。图14Α-14Β显示了在转移到天然携带的老鼠体内之后，PD1/PD-L1信号途径阻断剂能够增加抗原特异性T细胞的总数。全脾细胞被用于转移到经过或者没有经过抗PD-Ll 治疗的天然携带的老鼠体内。图14Α代表了⑶8+Τ细胞特点的时间-点中建立的一组独立的流式细胞计图形，图14Β表示了两个独立的试验中，Db GP33-特异性CD8 T细胞在外周血液中扩增的动力学(n = 4只动物每组)。图15Α-15Ε显示了在经过可应用的T细胞免疫治疗之后，PD1/PD-L1信号途径阻断剂能够提高抗原特异性CD8 T细胞中细胞因子的产生。在转移后第17天分离脾细胞并分析使用抗原性肽刺激后的细胞因子表达作用。图15Α显示了在用定义的CD8抗原决定簇或者无肽参照物刺激5小时之后通过细胞内细胞因子染色评价的IFNy的表达作用。图15Β 和图15D分别显示了 TNFa或者107ab和IFNy的二重表达作用(四角星代表⑶8门百分比)。图15C和图15E显示了生产IFNy同时生产TNF α或者107ab的细胞的百分比(η = 3只动物/组)。图16Α-图16Β显示了在LCMV克隆-13感染的小鼠体内抗体分泌细胞增加的水平。 通过ELISP0T和⑶138染色对患有慢性LCMV感染的小鼠进行a PD-Ll治疗，之后测定总抗体分泌细胞的水平。图16A显示了脾抗体分泌细胞总量，这是从三个独立的试验中概括所得的。图16B显示了脾脏中抗体分泌细胞(ASC)的增加可以通过标记物⑶138来测定。如一个代表性的图中所示，抗体分泌细胞是CD138+和B220低/中值(淋巴细胞上的门阀)。图17显示，用抗-PD-Ll治疗慢性LCMV感染的老鼠不会导致骨髓抗体分泌细胞水平的提高。在用ELISP0T计算在进行(a )PD-Ll治疗14天之后，患有慢性LCMV感染的小鼠体内脾脏和骨髓中抗原分泌细胞的总数。线条表示了试验组的几何平均数。图18显示了共同给药a PD-Ll和a CTLA-4会导致脾细胞中抗体分泌细胞的协同增加。对慢性LCMV感染的小鼠给药aPD-Ll、a CTLA-4、或者二者一起给药14天，通过 ELISP0T计算脾细胞中抗体分泌细胞的总数。线条表示了治疗组的几何平均数。图19A-19B显示了提高的B细胞和⑶4 T细胞增殖作用和a PD-Ll治疗的小鼠体内生发中心活性。图19A是⑶4 T细胞和B细胞的流式细胞分析图，显示了 aPD-Ll治疗之后提高的Ki-67水平。如上面各栏所述，结果真对⑶4或B细胞。图19B显示了表达PNA 的B增加的出现频率和高水平的FAS，这一结果表明α PD-Ll治疗的小鼠体内生发中心活性被提高。制图是概括了两个分别的试验结果的图像。图20A-20C表示了⑶8和⑶4细胞子集中的PD-I表达。图20Α是一系列流式细胞计实验图，显示了血液中CD8+/CD3+淋巴细胞之间PD-I和各种表型的标记物之间的共表达。图20Β显示了各种表达PD-I的⑶8+/⑶3+和(D)⑶4+/⑶3+细胞子集的百分比。柱状图表示了 PD-I在含有阳性(空心圆)和阴性(实心三角形)指定的标记物中的平均百分比。图20C代表了来自一个子集的表达PD-I的⑶4+Τ细胞的表型试验数据。图21Α-Β显示了 PD-I在对慢性感染有特异性的⑶8 T细胞中更好的表达。图21Α 是一系列流式细胞计实验图像，显示了 K3Stein棒状病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、流行性感冒和牛痘病毒-特异性CD8 T细胞的代表性PD-I染色。并标明了在四聚体+细胞之间 PD-I表达的荧光强度几何平均数(GMFI)。图21B显示了来自健康志愿者(n = 35)中EBV、 CMV、流行性感冒和牛痘病毒-特异性⑶8 T细胞上PD-I的概括信息。图22A-C显示了，抗-PD-Ll阻断剂能够增加对慢性感染有特异性的⑶8 T细胞体外增殖作用。图22Α是一系列流式细胞计实验图像，显示了用CFSE标记淋巴细胞，然后在指定的情况下培养6天。所述图像显示了来自EBV和CMV阳性主体典型的染色。图22Β是一种棒状图，显示了在用抗-PD-Ll阻断抗体阻断之后的EBV、CMV、流行性感冒和牛痘病毒抗原-特异性反应。所述棒状信号显示了与单独使用肽相比，在肽和抗-PD-Ll阻断抗体参与的情况下四聚体+细胞的成倍增加。图22C显示了抗PD-Ll抗体阻断剂之后四聚体+细胞成倍增加和PD-I表达(培养之前)之间的关系。图2!3B-23C显示了在患有慢性HCV传染病的人体内，丙型肝炎病毒(HCV)特异性 ⑶8+T细胞能够表达PD-I。图23A是5个患有慢性HCV传染病的病人代表性的制图，显示了 HCV特异性⑶8+T细胞上PD-I的表达。黑体的数值表示了在HCV特异性⑶8+T细胞(Y 轴)上PD-I表达的出现率(X轴)。图中斜体的数字表示了四聚体阳性细胞在总CD8+T细胞之中的出现率。在Y轴上，1073和1406能够识别四聚体HCV抗原决定簇特异性。通过 “Pt”，随后通过病人数目识别病人。细胞聚集在⑶8+淋巴细胞上。绘图以对数刻度来绘制。图2 表示了 PD-I在来自健康供体(⑶8健康的)的⑶8+T细胞上的表达、来自感染 HCV病人(CD8 HCV)的CD8+T细胞上的表达和在CD8+HCV特异性T细胞(HCV tet+)上表达的比较。图23C显示了，与PD-I在对HCV具有特异性的⑶8+T细胞(HCV tet+)上的表达相比，在来自HCV感染的供体(HCV+)和健康供体(健康的)中对流行性感冒病毒具有特异性的⑶8+T细胞(Flu tet+)上PD-I的表达。使用未配对的T检验法比较同一病人体内总 ⑶8+T细胞相对于HCV特异性⑶8+T细胞上PD-I的表达。图24A-24D显示了肝中PD-I表达⑶8+T细胞的出现率大于外周血液中的出现率。 图24A是来自5位患有慢性HCV传染病的病人的绘图，显示了与来自肝脏中的总CD8+T细胞中的表达相比，PD-I在来自外周血液的总CD8+T细胞中的表达。绘图中黑体的数字显示了淋巴细胞门的总CD8+T细胞中能够表达PD-I的细胞的出现率。制图以对数比例绘制。图 24B显示了 PD-I在来自外周血液中⑶8+T细胞上的表达与在来自HCV慢性感染患者肝脏中⑶8+T细胞上的表达的比较。使用配对T检测法比较PD-I在同一病人体内表达的差异。图MC比较了与来自肝脏的⑶8+效应因子记忆(TEM)细胞中PD-I表达相比，PD-I在来自外周血液的⑶8+效应因子记忆(TEM)细胞中的表达。记忆子集可以通过⑶62L和⑶45RA 的差异表达来识别。在图上部的黑体数字表示了细胞在每个象限的出现率。细胞被聚集在 ⑶8+淋巴细胞上，所述TEM子集被控制(装箱)且PD-I的表达显示在下面的直方图中。虚线显示了 PD-I在原态⑶8+T细胞(用作阴性群体)上的表达。直方图中的数字代表了表达 PD-I细胞的出现率。在直方图的下面，概括了十位患有慢性HCV传染病的病人体内CD8+TEM 细胞上PD-I表达出现率的比较。使用配对T检验法比较在同一病人体内，在来自周围血液中的⑶8+TEM上与在来自肝脏中的⑶8+TEM上PD-I表达的区别。图24D是代表两位患有慢性HCV传染病病人的绘图，显示了在来自周围血液的总CD8+T细胞中与在来自肝脏的总 ⑶8+T细胞中，⑶127表达的区别。黑体数字显示了总⑶8+T细胞上⑶127表达的出现率。 细胞聚集在⑶8+淋巴细胞上。绘图以对数比例绘制。⑶127在来自外周血液中的总⑶8+T 细胞上的表达与在来自肝脏的总CD8+T细胞上的表达的比较概括显示在下面的FACS图中。 使用配对T检验法用于统计分析。图25显示了肝脏中的HCV特异性⑶8+T细胞表达一种耗尽的表型。表现了两个患有慢性HCV传染病的病人的外周血液和肝脏中，HCV特异性CD8+T细胞上PD-I和CD127 表达的代表性制图。第一排图代表了 HCV四聚体阳性群体(方框)。方框上的数字代表了四聚体阳性细胞在CD3+淋巴细胞中的出现率。HCV四聚体的抗原决定簇特异性表示在Y轴上(107 。第二和第三排图显示了来自两位患有慢性HCV传染病的病人的外周血液和肝脏中的HCV特异性⑶8+T细胞上PD-I和⑶127的表达。黑体数字表示了 HCV特异性⑶8+T 细胞上PD-I或⑶127表达的频率。绘图以对数刻度绘制，并聚集在⑶3+⑶8+淋巴细胞上。 在FACS绘图下边，显示了在来自外周血液中的总⑶8+T细胞和⑶8+HCV特异性T细胞上， 相对于来自肝脏(HCV tet+肝)的HCV特异性⑶8+T细胞中PD-I表达(左侧)与⑶127 表达(右侧)的比较。在同一病人内部，使用配对T检测法比较表达作用。图沈显示了 PD-1/PD-L1途径阻断剂能够增加抗原刺激的HCV-特异性T细胞的扩增。在有IL-2和抗PD-Ll抗体(上组)或抗PD-I抗体(下组)参与的情况下，使用同源肽抗原刺激来自两种分离的人白细胞抗原(HLA) -A2病人的CFSE标记的PBMC 6天。同样显示未经刺激的参照物。在每个象限中显示出增殖的CFSE低-和CFSE高-HCV-特异性人类白细胞抗原(HLA)-A2+⑶8+T细胞的百分比。图27A-27D显示了在猿免疫缺陷病毒(SIV)特异性CD8 T细胞上，在SIV239感染之后，提高的PD-I的表达。图27A显示了来自正常猕猴的总⑶8 T细胞上PD-I的表达。 图27B显示了 SIV239感染的猕猴体内，总⑶8 T细胞上和SIV gag-特异性⑶8 T细胞上 PD-I的表达。在SIV感染12星期后对PBMC进行分析。图27C提供了正常猕猴和SIV-感染猕猴中总⑶8 T细胞和SIV-特异性⑶8 T细胞上PD-I阳性细胞的概括信息。表示了感染12周之后SIV-感染的猕猴的数据。图27D(最后一组)提供了正常猕猴和SIV-感染猕猴中总⑶8 T细胞和SIV-特异性⑶8 T细胞上PD-I表达的平均荧光强度(MFI)的概括信肩、ο图观々_288分别是图和图表，显示了 PD-I体外阻断剂能够提高SIV-特异性⑶8 T 细胞的扩增。来自Mamu A*01阳性猕猴的PBMC感染SHIV89. 6P，用PllC肽(0. 1毫克/毫升)在存在或者不存在抗PD-I阻断抗体(10毫克/毫升)的情况下几次该猕猴六天。在刺激三天之后，加入IL_2(50单位/毫升)。在刺激作用快结束的时候对细胞表面进行CD3、 CD8和feig-CM9四聚体染色。使用未刺激的细胞(nostim)作为阴性参照。根据散射作用将细胞集合在淋巴细胞上，然后在⑶3上分析⑶8和四聚体的表达。图28A是一种代表性的FACS图。图上的数字代表了四聚体阳性细胞相对于总⑶8 T细胞的出现率。图28B提供了来自6只猕猴的概括性数据。使用感染12周之后获得的细胞进行分析。计算四聚体阳性细胞在PllC刺激的培养物和未刺激的细胞中的出现率之比，作为增加倍数。图四显示了 LCMV感染之后，PD-Ll、PD_L2和PD-I在不同的细胞型上的表达动力学。用2 IOfiPfu的克隆-13 (CL-13)感染老鼠。在感染后指定的时间点，PD-L1、PD-L2、和 PD-I在不同细胞型上的表达作为一种直方图被现实。PD-I在指定的细胞型上表达的平均荧光强度(MFI)被显示。图30a-30c是FACS图，显示了慢性SIV感染过程中体内PD-1阻断剂增加 feig-CM9-特异性CD8 T细胞并使其在血液和肠道中具有更好的功能性数量。图30a是短尾猿RRklO代表性的FACS图。图30b和30c是FACS图，显示了血液(图30b)和肠道(大肠黏膜组织)(图30c)中feig-CM9-四聚体阳性⑶8 T细胞的数量和表型。代表性的FACS图显示在左侧，所有Mamu A*01-阳性动物的概括显示在右侧。FACS图上的数字代表四聚体阳性细胞占总CD8 T细胞的百分比。箭头和垂直线表示了抗-PD-I抗体治疗或者参照抗体治疗。图31a_31b显示了慢性SIV感染过程中体内PD-I阻断剂增加多功能病毒特异性 ⑶8 T细胞。图31a显示了 kg-特异性细胞因子-分泌⑶8 T细胞占总⑶8 T细胞的百分比。代表性的FACS图显示在左侧，该组的概括显示在右侧。箭头和垂直线表示了抗-PD-I 抗体治疗或者参照抗体治疗。线代表抗-PD-I抗体治疗的短尾猿，且红线代表参照-抗体-治疗的短尾猿。图31b显示了细胞因子共表达亚组，表示为总细胞银子阳性细胞的百分比。这里显示了每组的平均百分数。图3h_32b显示了在慢性SIV传染病期间体内PD-I阻断剂提高SIV-特异性体液免疫。图32a显示了在SIV感染之后和体内PD-I阻断剂之前，血液中PD-I记忆 (⑶20+CD27+⑶2Γ)和天然(⑶20+CD27TD21+)B细胞中的表达。图32b显示了加入阻断剂之后抗-SIV Env-结合抗体在血清中的滴定度。图32c显示了在加入阻断剂之后，Ki67在记忆和天然B细胞中的表达(增殖作用标志)。FACS图上的数字代表Ki67-阳性细胞占相对总细胞量的百分比。在SIV感染22周之后，同时使用抗-PD-I抗体和抗病毒性治疗剂治疗短尾猿fcifll和RJdl 1。图33a_3;3e显示了体内PD-I阻断剂降低了血浆病毒血症并延长感染SIV的短尾猿的存活时间。在传染病早期慢性阶段使用抗-PD-I抗体治疗短尾猿中的血浆病毒载量 (图33a)，在感染病晚期慢性阶段使用抗-PD-I抗体治疗短尾猿(图33b)，和在SIV传染病的早期/晚期慢性阶段用参照抗体治疗短尾猿(图33c)。型号代表动物死亡。图33d显示了第0天到第观天(早期慢性研究)或第0天到第21天(晚期慢性研究)之间血浆病毒载量降低的倍数。图3 显示了用PD-I阻断剂治疗之后SIV-感染的短尾猴的存活量。序列表在所附序列表上列出的核酸和氨基酸顺序使用标准核苷酸碱基标准缩写字体来显示，氨基酸使用37 C.F.R. 1.822.规定的三个字母代码来表示。核酸序列只显示了其中一条核酸链，其互补链作为所显示链相对应的核酸链应该被理解为也被包括在本发明中。在所附序列表中SEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQID
具体实施例方式本发明的公开涉及PD-I拮抗剂在诱导免疫反应方面的应用，所述免疫反应例如对肿瘤或对持久性病毒感染的免疫反应。本发明的公开还涉及确定对治疗主体有效的PD-I 拮抗剂剂量的方法。术语除非另有说明，这里使用的技术术语是根据其传统用法来使用的。在分子生物学领域普通术语的定义可以在在下列文献中找到由牛津大学出版社与1994年出版的 Benjamin Lewin所著的“基因V”(国际标准图书编号0-19-854287-9)；由Blackwell科学股份有限公司于1994年出版的Kendrew等人(编辑)的“分子生物学百科全书”(国际标准书号0-632-02182-9)；和由VCH出版股份有限公司于1995年出版的Robert A. Meyers (编辑)的“分子生物学和生物工艺学综合性实验参考”(国际标准书号1-56081-569-8)。为了帮助这里公开的各种各样的实施方案的理解，本发明提供了关于下列专用名词的解释变化与某一参数的参照值相比，该参数发生统计学上显著的改变。在一个实施例中，“增加”是某一参数统计学上显著的提升，例如记忆B细胞与参照相比数量增加或者发生增殖作用。合适的统计分析方法在本领域内是已知的，并且包括但不局限于，T检验和 ANOVA实验。在一些实施例中，具有的ρ值小于等于0.05.在其他的实施例中，显著的变化， 例如显著的增加或者减少，是与两个标准偏差的平均值或者更大值。“不存在显著的变化” 是指使用合适的统计学实验所得的数值的改变没有达到统计学的显著性。在一些实施例中，P值大于0.05。在其他的实施例中，“不存在显示的变化”是指所得的增加或者减少少于两个标准偏差的平均值。在一些实施方案中，“增加”或者“提升”，例如记忆B细胞的增殖作用的增加，是大约20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%的增加或者是2-倍、 3-倍、4-倍或者5-倍的增加。在一个实施例中，“减少”或者“降低”是指某一参数统计学上显著的降低，例如，与参照相比，记忆B细胞的数量或者增殖作用显著的降低。合适的统计分析方法在本领域内是已知的，并且包括但不局限于，T检验和ANOVA实验。在一些实施
NO 1是人PD-I的示范性的氨基酸顺序。
NO 2是老鼠PD-I的示范性的氨基酸顺序。
NO 3是人PD-Ll的示范性的氨基酸顺序。
NO 4是人PD-L2的示范性的氨基酸顺序。
NO 5-12是人骨架结构区的示范性的氨基酸顺序。
NOs 13-35是人PD-I的示范性的氨基酸顺序。
NOs 36-43是主要的组织适合性肽的示范性的氨基酸顺序。
NO 44和SEQ ID NO 45是T细胞抗原决定簇氨基酸顺序。
NO 46是人PD-L2变体的示范性的氨基酸顺序。
NOs :47-52是抗原肽的示范性的氨基酸顺序。
Nos :53-56是引物的核苷酸序列。方案中，“减少”，例如记忆B细胞的增殖作用的减少，是大约20%,30%,40%,50%,60%, 70% ,80^^90%的减少或者是2-倍、3-倍、4-倍或者5-倍的减少。反义、正义和反基因DNA具有两个逆平行链，一个是5' -3'链，该链通常被叫做正链，另一个是3' -5'链，该链被认为是负链。由于RNA聚合酶以5' -3'的方向添加核酸，因此负链的DNA在RNA转录期间作为模板。如此，RNA转录产物所具有的序列与负链序列互补，与正链序列一致(只有尿嘧啶(U)被胸腺嘧啶(T)取代)。反义分子是能够与RNA或DNA正链特异性杂交或者互补的分子。正义分子是能够与DNA的负链特异性杂交或者互补的分子。反基因分子是指向DNA靶点的反义分子或者正义分子。反义RNA(asRNA)是一种RNA分子，该分子与正义(编码的)核酸分子互补。扩增当被用于涉及核酸时，扩增是指能够增加样品或者样本中核酸分子拷贝数目的方法。聚合酶链式反应是扩增技术的一个例子。在此反应中，从主体中收集生物样品， 在能够允许样品中引物与核酸模板杂交的条件下使收集的生物样品与一对低聚核苷酸引物相接触。在合适的条件下，引物延长，从模板上分开，然后重新退火、延伸、和分离，从而扩增核酸的拷贝数目。体外扩增的产物可以通过电泳、限制性核酸内切酶裂解方式、低聚核苷酸杂交或结扎、和/或核酸测序，使用标准技术进行定性。体外扩增技术的其他例子包括链位移扩增(参见美国专利第5，744，311号)；无转录作用等温扩增(参见美国专利第 6，033，881号)；修补链式反应扩增(参见WO 90/01069)；连接酶连锁反应扩增(参见欧洲专利第EP-A-320 308号)；间隙填充连接酶连锁反应扩增(参见美国专利第5，427，930 号)；偶联的连接酶检测和聚合酶链反应(参见美国专利第6，027，889号)；和NASBA RNA 无转录扩增(参见美国专利第6，025，134号)。抗体抗体是一种多肽配位体，包括至少一种轻链或者重链免疫球蛋白可变区，所述可变区能够特异性识别和结合一种抗原决定簇(例如，一种抗原，例如肿瘤或者病毒抗原，或者他的片段)。抗体包括完整的免疫球蛋白及其本领域内已知的变体和部分，例如 Fab'片段、F(ab)' 2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)、和二硫化物稳定的Fv蛋白质(“dsFv”)。 单链Fv蛋白("scFv")是一种融合蛋白，该融合蛋白中的免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白重链可变区通过一种连接体结合，而在二硫化物稳定的Fv蛋白质(“dsFv")中， 通过引入二硫键使链发生突变，从而稳定链的结合。本术语还包括抗体的基因工程形式，例如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、杂共轭配对抗体(例如，双特异性抗体)。参见，Pierce Catalog and Handbook (Pierce 目录和手册)，1994-1995 (Pierce 化学公司，Rockford，IL)； Kuby, J.等人所著的Immunology (免疫学)，第三版，W. H. Freeman & Co.公司，纽约，1997。—般的，免疫球蛋白具有重链和轻链。每种重链和轻链都包含一种恒定区域和一种可变区域(这里“区域”也可以叫做“区”)。在结合时，重链和轻链可变区特异性的结合抗原。轻链和重链可变区包括一种骨架结构区域，该骨架结构区域由三个高超变区所中断， 所述高超变区也叫做“互补性-决定区域”或“⑶Rs”。骨架结构区域和⑶Rs的范围已经被定义了(参见，Kabat等人的所著的“具有免疫重要性的蛋白质序列”，美国健康和公共事业部，1991，该文献通过引证在此全部并入本文)。Kabat数据库是在线维持的。在同一个物种中，不同轻链或重链的骨架结构区域序列是相对保守的。抗体的骨架结构区域是构建轻链和重链的结合的骨架结构区域，该骨架结构区域能够用来定位和校准三维空间上的CDRs。所述⑶R主要负责结合抗原的抗原决定簇。每个链的⑶R—般被命名为⑶R1、⑶R2、和⑶R3，从N末端开始顺序编号，也可以通过特定的⑶R所在的链一般性的识别出来。因此，VHCDR3(⑶R3的重链可变区)位于发现它的抗体的重链可变区上，其中，VL CDRl (CDR1的轻链可变区)位于发现它的抗体的轻链可变区上。“VH”或者“VH”涉及免疫球蛋白重链的可变区，其包括Fv、单链Fv蛋白 ("scFv" )、二硫化物稳定的Fv蛋白质(“dsFv")或Fab的免疫球蛋白重链可变区。 “VL”或者“VL”涉及免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、单链Fv蛋白(“scFv" )、二硫化物稳定的Fv蛋白质(“dsFv")或Fab的免疫球蛋白轻链可变区。“单克隆抗体”是通过B-淋巴细胞单个克隆或者是通过细胞产生的抗体，在所述细胞中，单个抗体的轻链和重链基因已经被转染了。单克隆抗体可以根据本领域内已知的方法进行制备，所述方法例如使骨髓瘤细胞与免疫脾细胞相融合来制备杂交的抗体形成的细胞。单克隆抗体包括人源化的单克隆抗体。“人源化的免疫球蛋白"是指一种免疫球蛋白，这种免疫球蛋白包括人免疫球蛋白骨架结构区域和一种或一种以上非人源免疫球蛋白(例如老鼠的免疫球蛋白、鼠的免疫球蛋白或合成的免疫球蛋白)的CDR的。提供CDR的非人源免疫球蛋白被命名为“供体”， 提供骨架结构的人源免疫球蛋白被命名为“受体”。在一个实施方案中，所有的CDR都来源于人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白，恒定区不是必须的，但如果存在的话，他们必须基本上与人源免疫球蛋白恒定区一致，那就是说，至少有大约85-90%的一致性，例如，至少大约95%或更多的一致性。从此，人源化免疫球蛋白的所有部分，可能除了某些CDR，都与天然的人源免疫球蛋白序列的相应部分基本上一致。人源化抗体是一种抗体，这种抗体包括一种人源化的免疫球蛋白轻链和一种人源化的免疫球蛋白重链。人源化抗体与作为供体抗体提供CDR的抗体结合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体骨架结构具有有限个取代，所述取代由选自供体骨架结构的氨基酸进行。人源化单克隆抗体或其他单克隆抗体还可以具有其他的保守氨基酸取代作用，这些取代作用基本上不影响抗原结合或免疫球蛋白的其他功能。人源化的免疫球蛋白可以通过遗传工程构建(例如，参见美国专利第 5，585，089 号)。“中和抗体”是能够干扰多肽，例如PD-I多肽任何一种生物学活性的抗体。例如， 中和抗体可以干扰PD-I多肽从而降低免疫反应，所述免疫反应例如T细胞的细胞毒性。在几个实施例中，中和抗体可以减少PD-I多肽的能力从而将免疫反应降低大约50%、大约 70%、大约90%或更多。可以使用任意标准试验来测定免疫应答，包括这里所描述的实验， 从而确定可能的中和抗体。抗原是指一种能够刺激动物体内产生抗体或者T细胞反应的化合物、组合物、或物质，包括能够注射入动物体内或者被动物体吸收的成分。抗原能够与特定的体液产生的或者细胞免疫产品发生反应，所述产品包括由异源免疫原诱导产生的抗原。术语“抗原”包括所有涉及到的抗原的抗原决定簇。“抗原决定簇(Epitope)”或“抗原决定簇(antigenic determinant) ”涉及抗原上的一种位点，在此位点上B细胞或者T细胞进行应答。在一个实施方案中，当抗原决定簇与一种主要组织相容性复合体(MHC)分子相连接而存在时，T细胞对抗原决定簇作出反应。抗原决定簇可以从邻接的氨基酸或通过蛋白质的三级折叠连接的非邻接氨基酸形成。由邻接的氨基酸形成的抗原决定簇一般在暴露于变性溶剂之后能够被保持，而由三级折叠形成的抗原决定簇在用变性溶剂处理之后会失去治疗作用。一种抗原决定簇一般包括至少3个氨基酸或者更多，至少5个氨基酸、大约9个氨基酸，或者大约 8-10个氨基酸，这些氨基酸以一种独特的空间构造存在。决定抗原决定簇空间构造的方法包括，例如，X-射线晶体衍射法和2-维核磁共振。抗原可以是一种组织特异性抗原，或一种疾病特异性抗原。这些术语并不是专有的，例如，组织特异性抗原还可以是一种疾病特异性抗原。组织特异性抗原可以再有限数目的组织中可以表达，例如，单个组织。具体的，组织特异性抗原的非限制性例子是前列腺特异性抗原、子宫特异性抗原、和/或睾丸特异性抗原。组织特异性抗原可以再一个以上组织中表达，例如，但不仅限于，一种抗原可以再超过一个生殖腺组织中表达，例如，在前列腺组织和子宫组织中表达。疾病特异性抗原在疾病过程中偶然被表达。疾病特异性抗原非极限性的实施例是能够与肿瘤形成相关的抗原或者能够预言肿瘤形成的抗原。疾病特异性抗原是可以通过T细胞或B细胞识别的抗原。抗原-呈递细胞(APC):是指可以将结合有主要组织相容性复合体(MHC) I类分子或II类分子的抗原呈递到T细胞的细胞。抗原-呈递细胞(APC)包括，但是不局限于，单核细胞、巨噬细胞、树状细胞、非胸腺依赖性细胞(B细胞)、T细胞和郎格罕氏细胞。一种T 细胞可以将抗原呈递到其他的T细胞(包括⑶4+和/或⑶8+Τ细胞)上，这种T细胞就是一种抗原呈递T细胞(T-APC)。B细胞淋巴细胞的亚群，S卩，白血细胞(白细胞)。成熟的B细胞分化成血浆细胞，产生抗体和记忆B细胞。“B细胞原始粒子”是能够发展成为成熟B细胞的细胞。B细胞原始粒子包括干细胞、早期前-B细胞、晚期前-B细胞、大前体B细胞、小前体B细胞、和不成熟B细胞和过渡期B细胞。通常，早期前-B细胞(早期前B细胞表达，例如⑶43或者 Β220)经历免疫球蛋白重链重排变成不成熟的B细胞。不成熟的B细胞包括Tl和Τ2 B细胞。例如，在老鼠中，不成熟的B细胞包括Tl B细胞，即AA41hira231()细胞。老鼠不成熟B 细胞的其他实施例是T2B细胞，即AA41hiCD23hi细胞。在人体中，不成熟B细胞(例如，不成熟外周过渡性 B 细胞)包括 CD38hi, IgD+，CDlO+, CDMhi，CD4410，CD2310 和 CDll0 细胞。因此， 不成熟B细胞包括B220(CD45R)表达细胞，其中，轻链和重链免疫球蛋白细胞基因倍重排。 在一个实施方案中，不成熟的B细胞表达⑶45R，class II，IgM，⑶19和⑶40。不成熟B细胞不显示替代轻链表达，但却表达Ig α β和RAG。不成熟B细胞可以发展为成熟的B细胞， 成熟B细胞可以产生免疫球蛋白(例如，IgA、IgG或者IgM)。成熟B细胞具有获得的表面 IgM和IgD，能够对抗原发生反应，并且表达特征标记物，例如⑶21和⑶23 (⑶23htD21hi细胞)。B细胞可以被试剂活化，例如，被脂多糖(LPQ或者IL-4和抗IgM的抗体活化。B细胞和B细胞原始粒子常见的生物来源包括骨髓、外周血、脾脏和淋巴结。最初与抗原相遇的B细胞叫做“天然"B细胞。这种细胞在其细胞表面具有IgM和 IgD0在一种B细胞原始粒子(例如，前定向小淋巴细胞)被抗原激活之后，该B细胞原始粒子分化成母细胞，母细胞分化成不成熟血浆细胞，不成熟血浆细胞可分化成成熟血浆细胞或者记忆B细胞。作为对特定抗原的反应，成熟血浆细胞分泌免疫球蛋白。记忆B细胞是经过细胞同型转换和体细胞超突变的B细胞，所述体细胞超突变通常在次级免疫反应(在首次抗原暴露之后的抗原暴露)过程中发生，但也可以在初级抗原反应中检测到。记忆B细胞的发展发生在淋巴滤泡(lymphoid follicles)的生发中心(GC)，在淋巴滤泡(lymphoid follicles)的生发中心(GC)，抗原产生的淋巴细胞进行超突变和亲和筛选，前提是在辅助性T细胞的影响下。记忆B细胞通常表达⑶27。一般的，记忆B细胞还能在其细胞表面表达高亲和性抗原特异性免疫球蛋白(B细胞受体)。因此，记忆B细胞可以是⑶20+⑶27+，并且包括 CD20int/CD2l7CD27+(静态记忆)、CD20hi/CD2l7CD27+(活化的记忆)。CD20hi/CD2l7 CD27—细胞是独特的“非常规或者组织记忆”B细胞。结合亲和性抗体对抗原的亲和性。在一个实施方案中，通过Frankel et al., Mol. Immunol. ,16 101-106，1979中描述的katchard方法的改良计算亲和性。在另一个实施方案中，结合亲和性通过抗原/抗体解离速度测定结合亲和性。在依旧另一个实施方案中，通过竞争性放射免疫试验测定高结合亲和性。在几个实施例中，高结合亲和性是至少大约1x10_8M。在另一个实施方案中，高结合亲和性是至少大约1. &10_8Μ、至少大约2. 0Χ1(Γ8Μ、 至少大约2.切10_8]\1、至少大约3. 0χ10_8Μ、至少大约3.切10_8]\1、至少大约4. 0χ10_8Μ、至少大约4. hl(T8M、或者至少大约5. OxlO—M。结合或稳定的结合(低聚核苷酸)如果足够量的低聚核苷酸形成碱基对或者与其靶分子核酸杂交，该低聚核苷酸就会结合或者稳定的结合到靶分子核酸上，从而允许检测结合。可以通过靶分子低聚核苷酸复合物的物理或者功能性质检测结合。在靶分子和低聚核苷酸之间的结合可以通过本领域内已知的任何方法来检测，这些方法包括功能性结合实验和物理结合实验。例如，可以通过确定结合在生物合成过程中是否具有可探测到的效果来从功能角度检测结合，所述生物合成过程例如基因表达、DNA复制、转录、翻译等等。检测DNA或RNA的互补链结合的物理方法在本领域内是已知的，包括，例如脱氧核糖核酸酶I (DNase I)或化学足迹实验法、凝胶位移和亲合裂解试验、RNA分子印迹技术 (Northern blotting)、点印迹技术和光吸收检测方法。例如，一个方法包括在220纳米到 300纳米条件下，在温度缓慢增加时观察包含低聚核苷酸(或其类似物)和靶分子核酸的溶液光吸收的变化，由于该方法简单可靠，在本领域内被广泛应用。如果低聚核苷酸或类似物已经与它的靶分子结合了，在某一特定的温度下，该溶液的吸光度会有一个突增，这是由于低聚核苷酸(或类似物)与他的靶分子分离或熔融而造成的。低聚物及其靶分子核酸之间的结合通常通过温度(Tm)来定性，在此温度(Tm)下， 50%的低聚物从其靶分子上熔化。较高的(Tm)相对于较低的(Tm)来讲，意味着更强或者更稳定的复合物。癌症或肿瘤是指一种恶性的赘生物，该赘生物已经经历了特有的退行性变化同时伴有分化能力损失、发育增长率损失、侵入周围组织、并能够转移。生殖性癌症是指其最初起源在生殖组织中的癌症，所述生殖组织例如子宫、睾丸、卵巢、前列腺、输卵管或阴茎。 例如，前列腺癌是一种恶性赘生物，发生在前列腺组织并从前列腺组织中扩散，并且，子宫癌是发生在子宫组织中或者从子宫组织中扩散开来的恶性赘生物，睾丸癌是发生在睾丸中的恶性赘生物。切缘癌是指在对患有癌症的患者进行任何能够减少或消除甲状腺癌的治疗之后仍然残留在患者体内的癌症。转移癌是指除了原始(最初)癌症起源位点之外，从该转移性癌起源位点转移出的在患者体内一个或者一个以上位点的癌症。⑶观(分化群28)在T细胞上表达的细胞之一，能够提供共刺激性信号，共刺激性信号是T细胞活化所必须的。⑶观是87. 1(⑶80)和B7.2(⑶86)的受体。当被toll样受体配位体活化时，在抗原呈递细胞(APCs)中B7. 1的表达被上调。在抗原呈递细胞(APCs) 中B7. 2的表达是持续性的。⑶观是唯一能够在天然T细胞上持续性表达的B7受体。
化学疗法；化学治疗剂如这里使用的，化学疗法或化学治疗剂是指任何能够有效治疗以非正常细胞生长为特征的疾病的化学试剂。这些疾病包括肿瘤、赘生物和癌症，以及以增生性生长为特征的疾病，例如，牛皮癣。在一个实施方案中，化学治疗剂是在治疗赘生物的过程中使用的试剂，所述被治疗的赘生物例如实体肿瘤。在一个实施方案中，化学治疗剂是一种放射性分子。本领域普通技术人员可以很容易的识别有效的化学治疗剂(例如，参见 Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, (Slapak 禾口 Kufe 所著的"癌症治疗原理”)Chapter 86 in Harrison' s Principles of Internal Medicine(内科医学的哈里森原理第 86 章)第 14 版；Perry et al.，Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed. , 2000 Churchill Livingstone, 丘吉尔禾U文斯顿有限公司2000年出版的Perry等人编写的“化学疗法”第2版第17章，阿贝洛夫临床肿瘤学)；Baltzer L, Berkery R(eds) Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis,Mosby-Year Book，1995 (Mosby 年鉴 1995 年，圣路易斯出版的 Baltzer L,Berkery R 编辑的“肿瘤学化学疗法口袋指南”第2版)；Fischer DS, Knobf MF, Durivage HJ(eds) The Cancer Chemotherapy Handbook,4th ed. St. Louis,Mosby-Year Book,1993) (Mosby年鉴1993年，圣路易斯出版的Fischer DS,Knobf MF,Durivage HJ编辑的“癌症化学疗法手册”第4版))。这里所公开的免疫原多肽可以用于与其他的化学治疗剂相结合使用。⑶观细胞表面抗原还被叫做T90/44抗原或者在T细胞上表达的Tp44。⑶观是在T细胞上作用的共刺激性蛋白质的受体。CD^的天然配位体是大小为44-54kDa的糖蛋白，叫做B7-1或者⑶80。还存在一种相关分子，B7-2。B7-1在活化的B细胞和其他抗原呈递细胞上表达。它可以被巨噬细胞，角质形成细胞，T细胞，B细胞，外周血树突状细胞和朗格汉斯细胞表达。B7-2可以在血液树突状细胞和朗格汉斯细胞、B细胞、巨噬细胞、枯否细胞、活化的单核细胞核和天然致死细胞克隆株中发现。B7和CD^在T细胞上的结合能够传递一种共刺激信号，这种共刺激信号激发T细胞增殖作用。参照水平(免疫参数)一种免疫参数的基线水平。在一些实施方案中，参照水平是不存在治疗剂的情况下，免疫系统某一成分的水平，例如，记忆B细胞或者增殖性记忆B 细胞的水平。通过测定来自尚未用所关心的试剂处理的主体的样品来确定参照水平，或者通过测定来自用参照试剂处理过的主体的样品来确定参照水平。所述参照水平还可以是一种标准值，例如，在一段时间内测定的大量样品的平均值中确定的值。所述参照水平还可以在来自经过特定剂量的治疗剂处理之后的主体的样品中测定，其中，对于正在进行评价的主体不能给药所述剂量。参照可以从进行评价的主体中获得，也可以从不同的主体中获得。参照水平(多肽或者核酸)是指在某一条件下和/或特定的基因背景中，自然存在的正常的分子水平，例如多肽或者核酸的水平。在某些实施方案中，分子的参照水平可以在没有直接或者间接经历过治疗细胞或者物种中测定。在某些实施例中，参照水平可以是在没有与试剂接触的细胞中的水平，所述试剂例如PD-I拮抗剂。在其他的实施例中，参照水平可以是在没有给药PD-I拮抗剂的主体中的水平。DNA (脱氧核糖核酸)脱氧核糖核酸(DNA)是一种长链聚合物，该聚合物包括绝大多数活体生物的遗传物质(一些病毒的基因包括在核糖核酸(RNA)中)。DNA聚合物中的重复单位是四个不同的核苷酸，每个都包括四个碱基之一，所述碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、 胞嘧啶和胸腺嘧啶，这些碱基与脱氧核糖结合，在此脱氧核糖上附着有磷酸基。三个一组的核苷酸(被称为“密码子”)能够编码多肽中的每个氨基酸，或者停止信号。术语“密码子” 也可以被用来指mRNA中的三个核苷酸的相应(互补)序列，所述mRNA是由该DNA序列转录得到的。除非另有规定，所有DNA分子表示的分子都包括该DNA分子的反向互补序列。除非上下文中明确要求是单链分子，DNA分子尽管只用单链表示，但是其意味着包含双链DNA 分子的两条链。检测(detecting)或者测定(Detection)(细胞或者生物分子)是指在研究中定性或者定量确定生物分子或者特定的细胞型的存在，例如，记忆B细胞的存在。例如， 定性或者定量确定在来自主体的样品中存在记忆B细胞，或者检测记忆B细胞的增殖作用。通常，生物分子的测定，例如蛋白质、核酸的测定或者检测特定的细胞型或者细胞增殖作用，需要进行生物学实验，并不是简单的观察。例如，使用抗体或者核酸探针(都被标记过)的实验可以分别用于检测蛋白质或者细胞。使用PD-I拮抗剂治疗的功效的诊断 (diagnosing)或者诊断(diagnosis)包括检测细胞或者生物分子中显著的改变，例如，记忆B细胞的增殖作用。编码多核苷酸被认为能够编码一种多肽，如果在其天然状态或者使用本领域已知的方法进行处理之后，该多肽可以进行转录和/或翻译，从而产生mRNA和/或多肽或其片段。反义链是指这种核酸的互补序列，其编码的序列可以由此推断。表达是指一种过程，在此过程中，基因编码的信息被转入构建物结构中，此过程存在于细胞中并在细胞中进行操作。表达的基因包括那些被转录为mRNA并随后被翻译成蛋白质的基因，还包括那些被转录为RNA但不被翻译为蛋白质(例如siRNA、转移核糖核酸和核糖体RNA)的基因。因此，靶分子序列，例如基因或基因启动区的表达可以导致mRNA、蛋白质或者二者的表达，靶分子序列的表达可以被抑制或提高(减少或增加)。表达控制序列是指一种核酸序列，能够调节与其可操作的连接的异源核酸序列的表达。当表达控制序列控制和调节一种核酸序列的转录以及在合适的情况下控制和调节其翻译过程时，表达控制序列可操作的与该核酸序列相连。因此，表达控制序列可以包括适当的启动子、增强子、转录终止子、位于蛋白质编码基因前面的起始密码子(即，ATG)、拼接信号、保持正确阅读基因框架从而保证mRNA被适当的翻译的元件、和终止密码子。术语“控制序列”至少包括，其存在能够影响表达的组分，还可以包括其他组分，这些其他组分的存在是有利的，例如，前导序列和融合配对序列。表达控制序列可以包括一种启动子。启动子是足够指导转录作用的最小序列。同时还包括一些启动子元素，这些启动子元素足够使依赖于启动子的基因表达过程的细胞型特异性、组织特异性变得可以通过外部信号或者试剂控制或者归纳；这些元素可以位于基因的5'或3'区域。可构建的和可归纳的启动子都被包括在本发明范围内(参见例如，Bitter et al. ,Methods in Enzymology 153 :516-544,1987 (Bitter等人在1987年出版的“酶工程方法”第153期516-544页公开的文献))。例如，当在细菌系统内克隆时，可归纳的启动子，例如细菌噬菌体lambda的pL、 plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂交启动子)等等，都可以被使用。在一个实施方案中，当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒基因组的启动子(例如反向病毒长末端重复序列；腺病毒深启动子；牛痘病毒7. 5K启动子)。通过重组DNA或合成技术产生的启动子可以被用来提供核酸序列的转录作用。异源的是指来源于分离遗传来源或种族的物质。通常，特异性结合所关心的蛋白质的抗体不会特异性的结合异源蛋白质。宿主细胞是指在其中载体可以进行繁殖并表达其DNA的细胞。该细胞可以是原核的或者是真核的。该细胞可以是哺乳动物的，例如人类的。该术语还包括任意宿主细胞的子代。本领域技术人员应当理解，由于在复制期间会发生突变，所有的后代可能不会与其母代细胞完全一致。然而，当使用“宿主细胞”时也包括其后代细胞。免疫反应是指细胞免疫系统对刺激物的一种反应，所述免疫系统例如B细胞、T 细胞或者单核细胞。在一个实施方案中，所述反应对一种特定的抗原具有特异性(“抗原特异性反应”)。在一个实施方案中，免疫反应是一种T细胞反应，例如CD4+反应或CD8+反应。在另一个实施方案中，所述反应是B细胞反应，并导致特异性抗体的产生，或者记忆B 细胞的增殖。B细胞反应可以使记忆B细胞反应或者血浆B细胞反应。血浆B细胞反应的一种实施例是抗体的产生。记忆B细胞反应的一种实施例是记忆B细胞的增殖作用。免疫细胞的“无反应作用”包括免疫细胞对刺激作用的折射系数，所述刺激作用例如通过活化受体或细胞因子的刺激作用。“无反应作用”可以由于暴露于免疫抑制剂或者暴露于高剂量的抗抗原而发生。如这里使用的，术语“无反应性”或者“耐受性”包括对活化受体调节的刺激作用的折射系数。这种折射系数通常具有抗原特异性，并在停止暴露于耐受化抗原之后还能维持这样的折射系数。例如，在T细胞中的无反应性(与无反应作用相反)的特点在于缺少细胞因子的产生(例如IL-2)。当T细胞暴露于抗原中并受到第一信号(一种T细胞受体或CD-3调节的信号)且在没有产生第二信号(一种共刺激信号)时，T细胞发生无反应性。在这种情况下，将所述细胞再暴露于同一个抗原(即使暴露发生在共刺激分子存在的情况下)会导致不能产生细胞因子，并因此，不能增值。然而，如果与细胞因子(例如，IL-幻一起培养的话，无反应性的T细胞可以与无关的抗原起反应并因此可以增值。例如，T细胞无反应性还可以通过由T淋巴细胞产生的IL-2缺失来观察，该过程通过酶联免疫吸附测定或通过含有指示剂的细胞株进行的增殖试验来调节。做为选择，还可以使用一种报道基因构建物。例如，无反应性的T细胞不能启动IL-2基因的转录作用，所述转录作用是在5' IL-2基因增强因子的控制下通过异源启动子诱导的IL-2基因的转录作用，或者是通过APl序列的多聚体诱导的IL-2基因转录作用，所述APl序列多聚体可以再增强因子内部被发现(Kang et al. Science 257 1134,1992) 0无反应性的抗原特异性T细胞相对于其相应的参照抗原特异性T细胞在细胞毒素活性上减少了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%、95%、乃至 100%。免疫原性肽是指一种肽，所述肽包括等位基因-特异性基序或其他序列，从而所述肽能够结合主要组织相容性复合体(MHC)分子并且导致细胞毒性T细胞(“CTL”)反应或针对衍生出免疫原性肽的抗原的B细胞反应(例如，产生抗体或者记忆B细胞增殖作用)。在一个实施方案中，使用序列基序或者其他方法来识别免疫原性肽，所述方法例如本领域内已知的神经网络或多项式判断法。一般，使用运算法则来确定肽的结合阈从而通过分数来进行选择，所述分数能够赋予他们高的结合可能性，同时具有某一结合亲合力并具有免疫原性。所述运算法则或者基于特定氨基酸在特定位置的主要组织相容性复合体(MHC)结合的作用，或者基于特定的氨基酸在特定的位置对抗体结合的作用，或者基于包含基序的肽中特定取代作用的结合的作用。在免疫原性肽的含义中，保存残基是指肽中的某一特定位点上，以比通过随机分布所预计的情况具有显著增高的频率出现的残基。在一个实施方案中，保守残基是一种残基，在此残基上主要组织相容性复合体(MHC)结构能够与免疫原性肽提供一种接触点。免疫原性肽还可以通过测定其与特异性主要组织相容性复合体(MHC)蛋白质(例如，HLA-A02. 01)的结合来识别，或者在存在于主要组织相容性复合体(MHC)蛋白质中时， 通过他们刺激⑶4和/或⑶8的能力来识别。免疫原性组合物是指一种组合物，包括一种免疫原性的多肽或编码免疫原性多肽的核酸，所述免疫原性的多肽能够导致对抗细胞表达多肽可测量的细胞毒性T细胞 (“CTL”)反应，或者能够导致对抗所述多肽的可测量的B细胞反应(例如，产生能够特异性结合所述多肽的抗体)。为了进行体外应用，免疫原性组合物可以由隔离的核酸、包括核酸/或免疫原性肽的媒介物组成。为了进行体内应用，所述免疫原性组合物通常包括核酸、 包括核酸的媒介物、和/或在药学上可接受的载体中的免疫原性多肽，和/或其他的试剂。 免疫原性组合物可以选择性地包括一种添加剂、一种PD-I拮抗剂、一种共刺激分子、或一种编码共刺激分子的核酸。根据本领域内已知的实验，可以方便的检测多肽或编码该多肽的核酸导致细胞毒性T细胞(“CTL”)反应的能力。免疫反应条件(体外)包括“足够形成免疫复合物的条件”，所述免疫复合物能够允许抗体向特定抗原决定簇突起，从而使与该抗原决定簇的结合相对于与其他所有抗原决定簇的结合相比更容易检测，和/或更为排斥与其他所有抗原决定簇的结合。免疫反应条件取决于抗体结合反应的方式，并且基本上与免疫方案(例如ELISA或者放射免疫试验)、FACS中使用的条件或者体内面临的条件相同。参见Harlow & Lane，Antibodies，A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York(1988),该文描述了免疫试验方式和条件。这里描述的方法中使用的免疫反应条件是“生理条件”，生理条件是指活哺乳动物或者哺乳动物细胞中常见的条件(例如，温度、摩尔渗透压浓度、PH值)。尽管已经认识到某些器官可能存在一些极端的条件，但是生物体内部和细胞内部环境通常具有的PH值为7 (例如，从pH6. 0到pH8. 0，更为常见的是从pH6. 5到pH7. 5)，以水作为主要溶剂，并且温度在大于0°C到小于50°C之间。摩尔渗透压浓度在能够支持细胞存活和增殖的范围内。抑制或治疗一种疾病抑制一种疾病，例如抑制肿瘤生长或抑制持续感染是指抑制一种疾病的全面发展，或者减轻该疾病过程的生理学影响。在几个实施例中，抑制或治疗一种疾病是指减轻肿瘤或带有病原体的传染病的症状。例如，癌症治疗可以防止已知患有癌症的病人体内肿瘤伴随综合征的发展，或者能够减轻肿瘤的症状或者病征。在另一个实施方案中，传染病的治疗涉及抑制传染病的发展或者减轻所述传染病的症状。“治疗，，是指一种治疗性介入，该治疗性介入能够改善一种疾病或与此疾病有关的病理学情况的症状或病征。治疗性的接种法涉及对已经感染上一种病原体的主体给药试剂。所述主体可以是无任何症状的，从而所述治疗可以防止所述症状的发生。治疗性疫苗还可以减少一种或者一种以上存在的症状的严重性，或者减少病原体的感染量。传染性疾病是指任意由传染性试剂。传染性病原体的例子包括，但不仅限于病毒、细菌、支原体和真菌。在一种特定的实施例中，传染性疾病是一种由至少一种传染性病原体造成的疾病。在另一个实施例中，传染性疾病是一种至少由两种不同类型的传染性病原体造成的疾病。传染性疾病可以作用于任何体系，可以是急性的(短期发作)或者慢性/ 持续性(长期发作)的，发作同时会引起或者不会引起发烧。传染性疾病可以感染任意年龄阶段并且可以相互感染。病毒引起的疾病通常在发生由已经存在于受体中的病毒重新活化产生的免疫抑制之后。持久性病毒感染具体的例子包括但不局限于，巨细胞病毒(CMV)肺炎、肠炎和视网膜炎；埃-巴二氏病毒(EBV)淋巴组织增生性疾病；水痘/疱疹(由水痘带状疱疹病毒引起)；HSV-I和HSV-2粘膜炎；HSV-6脑炎、BK-病毒出血性膀胱炎；病毒流行性感冒；呼吸道合胞病毒(RSV)引发的肺炎；艾滋病(由艾滋病病毒引发的)；和甲型肝炎、乙型肝炎或者丙型肝炎。其他的传染性病毒包括逆转录病毒；小核粮核酸病毒(例如，骨髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒，人考克塞基病毒、鼻病毒、埃可病毒)；Calciviridae (例如，引起肠胃炎的菌株)；披盖病毒科(Togaviridae)(例如，马脑脊髓炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科 (Coronaviridae)(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒)；纤维病毒科(Filoviridae)H^Un, ebola病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；流行性感冒病毒正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流行性感冒病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae) (例如，Hantaan 病毒、bunga 病毒、白龄病毒(Phleboviruses)禾口 Nairo 病毒)；Arena 病毒(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如，呼吸道肠道病毒、环状病毒(Orbiviruses)和轮状病毒)；双RNA病毒科(Birnaviridae)；嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(parvoviridae)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头状瘤病毒、多形瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(绝大多数是腺病毒)；疱疹病毒科 (Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(HSV) 1和单纯疱疹病毒(HSV) _2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如非洲猪瘟病毒)；和未分类的病毒(例如，海绵状脑病的病原体，delta肝炎的试剂(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷型附属物)、非甲型感染的试剂、非乙型肝炎的试剂(1类=内部传输；2类=不经肠道传输(即，丙型肝炎)；诺沃克类病毒和与之有关的病毒、和星形病毒(astroviruses))。真菌传染病的例子包括但是不局限于曲霉病；口腔白色念珠菌病(由白色念珠菌所引起)；隐球菌病(由隐球酵母属所引起)；和荚膜组织胞浆菌病。因此，传染性真菌的例子包括，但是不局限于，新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、厌酷球孢子菌、皮炎芽生菌、沙眼衣原体、白色念珠菌。传染性细菌的例子包括幽门螺旋杆菌、伯氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、 通用型嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分支杆菌属(例如，肺结核分枝杆菌、小鼠抗鸟结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、M. kansaii.M. gordonae)、金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、单核细胞增多性李氏杆菌、酿脓链球菌(A组链球菌)、无乳链球菌(B组链球菌)、链球菌(易变组)、粪链球菌、牛链球菌、链球菌(厌氧菌属)、肺炎链球菌、致病性弯曲杆菌属、肠道球菌、流感嗜血杆菌、炭疽芽胞杆菌、白喉棒状杆菌、棒状杆菌属、红斑丹毒丝菌、肠梭状芽孢杆菌、破伤风杆菌、产气肠杆菌、肺炎克雷白杆菌、多杀巴其J 德氏菌(Pasturella multocida)、畸形菌体、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、 念珠状链杆菌、苍白密螺旋体、细弱密螺旋体、钩端螺旋体属、和衣氏(以色列)放线菌 (A. israelii)。其他的传染性有机体(例如真核原生生物)包括恶性疟原虫和弓形虫抗体。“持续感染”是指一种传染病，在此传染病中传染试剂(例如一种病毒、支原体、细菌、寄生虫、或真菌)是不确定的或者没有从受感染的宿主中排除，即使后来引发了免疫反应。持续感染可以是慢性感染、潜伏性感染或慢感染。潜伏性感染的特点在于在复发性疾病的亚阶之间缺乏可证明的传染性病毒。慢性感染的特点在于初次感染之后传染性病毒的持续性存在，并且慢性感染还可以包括慢性的或者复发性疾病。慢感染的特点在于进行性疾病之后延长的潜伏期。与潜伏性感染和慢性感染不同，慢感染可能不会以急性的病毒复制阶段作为开始。与急性传染相对短暂(持久几天到几星期)并能够通过免疫系统从身体中分解不同，持续感染可以持续，例如，几个月、几年、乃至一生。这些传染病还可以在很长的一段时间内经常复发乃至对宿主细胞产生过度破坏，所述很长的时间包括潜伏阶段和有效感染阶段，但不会杀死细胞。持续感染经常包括潜伏期和有效感染两个阶段，但不会快速的杀死宿主细胞或者对宿主细胞产生过度损害。在持续病毒感染期间，病毒基因组既可以稳定的统一到细胞DNA中或者附加性的被维持。某些病毒会产生持续感染，所述病毒例如人T细胞白血病毒、埃-巴二氏病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、家畜囊虫病、乳多空病毒、朊病毒、肝炎病毒、腺病毒、细小病毒和乳头状瘤病毒。使用标准技术在宿主体内(例如受感染个体的大肺泡上皮细胞内部)可以发现引起感染的传染性试剂，即使已经进行了免疫反应之后。按照任何本领域内已知的标准方法可以诊断哺乳动物患有持续感染，所述方法在例如，美国专利第6，368，832号、美国专利第6，579，854号和美国专利第6，808，710号和美国专利申请公开号20040137577、美国专利申请公开号20030232323、美国专利申请公开号20030166531、美国专利申请公开号20030064380、美国专利申请公开号20030044768、美国专利申请公开号20030039653、美国专利申请公开号20020164600、美国专利申请公开号20020160000、美国专利申请公开号 20020110836、美国专利申请公开号20020107363、和美国专利申请公开号20020106730，这些专利或专利申请在此通过弓I证并入本文。“减轻持续感染的症状”是指改善与持续感染有关的任何状况或症状。做为选择， “减轻持续感染症状”可以包括相对于未经处理的参照中的量相比，减少主体内传染性微生物(例如病毒、细菌、真菌或寄生虫)的量。通过标准技术测定，与等量的未经处理的对照物相比较，这种减少或者预防程度最少是5%、10%、20%、40%、50%、60%、80%、90%、95%、 或100%。理想的是，通过本领域内已知的标准方法检测到持续感染被完全的清除了，在这种情况下，持续感染被认为已经治愈。正在进行持续感染治疗的病人是经过专业医生诊断确定患有这种病症的病人。可以通过任何合适的方法进行诊断。诊断和检测可以包括，例如，检测生物样品(例如，组织活体检查、验血、或尿检验)中微生物的装载量、检测生物样品中微生物传染病的替代标记物水平、检测与持续感染有关的症状、或检测涉及到针对持续感染的免疫反应的免疫细胞(例如，检测抗原特异性T细胞，所述抗原特异性T细胞是无变应性的和/或被功能性的削弱)。对正在预防持续性感染发展的病人可以或者不可以进行这种诊断。本领域技术人员应当理解这些病人已经进行了如上所述的标准测试，或者由于存在一种或者一种以上的风险因素(例如家族病史或者接触传染试剂)，不经过检测就已经被识别具有很高的患病风险。分离的是指一种“分离的”生物学组分(例如一种核酸或蛋白质或细胞器)基本上被分离或者从天然存在这些生物学组分的有机体细胞中区别于其他的生物学组分而纯化出来，也就是说，其他的染色体DNA和外染色体DNA和RNA、蛋白质和细胞器。“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达而制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸。一种纯化的抗体占蛋白质和与其天然相关的其他天然存在的有机分子重量的至少60 %。在某些实施例中，制得按重量计至少大约75 %、至少大约80 %、至少大约90 %、至少大约95%或至少大约99%的抗体，例如PD-1、PD-L1、或PD-L2特异性抗体。纯化的抗体可以通过例如使用重组产生的蛋白质或者保守基序肽进行的亲和层析法，或者其他的标准技术来制备。标记物一种直接或者间接与另外一种分子相连从而促进所述分子检测的可检测的化合物或组合物。其中所述另外一种分子例如抗体或者蛋白。具体的，标记物的非限制性实施例包括荧光标记物、酶催化连接、和放射性同位素。在一个实施例中，“标记的抗体” 是指将其他分子整合入抗体中。例如，所述标记物是一种可检测的标志，例如，将放射标记的氨基酸或者附着物整合入生物素化的多肽中，生物素化的多肽可以被标记的亲和素检测 (例如，包含荧光标记的链霉亲和素或者酶活性可以通过光学检测或者比色法测定)。标记多肽和糖蛋白的各种方法在本领域内是已知的，可以使用。多肽标记物的实施例包括但不局限于如下物质放射性同位素或放射性核苷酸(如或mI)，荧光标记物(如异硫氰酸荧光素(FITC)，罗丹明，稀土荧光粉)，酶标记物(例如辣根过氧化物酶，半乳糖苷酶， 荧光素酶，碱性磷酸酶)，化学发光标记物，生物素基团，二级报道分子识别的预先确定的多肽抗原决定簇(如亮氨酸拉链对序列，二级抗体结合位点，金属结合域，抗原决定簇标记)， 或磁剂，如钆螯合物。在一些实施方案中，标记物是由不同长度的连接间隔子所附着，以减少潜在的空间位阻。淋巴细胞白血细胞的一种类型，与身体的免疫防御相关。淋巴细胞主要有两种类型Β细胞和T细胞。主要组织相容性复合体(MHC)是不同种类中描述的组织相容性抗原系统的总称，包括人类白细胞抗原(“HLA”)。哺乳动物该术语包括人类和非人类的哺乳动物。同样的，术语“主体”包括人类主体和动物主体。平均荧光强度(流式细胞仪)流式细胞仪致力于细胞或粒子光强度测量，所述光强度既可以是激光散射光也可以是由荧光染料发射的荧光。光可以通过光电倍增管(PMT) 进行检测，光电倍增管(PMT)通过一种放大器将光转换为电压，该电压与原始荧光强度和光电倍增管上的电压成正比。这些电压是连续分布的，通过模拟数字转换器(ADC)将这些连续分布的电压转换为离散分布，模拟数字转换器(ADC)将各个信号至于根据荧光强度的特定的频道中。ADC的分辨率越大，越能反映连续分布。
流式细胞仪数据可以通过线性或对数尺度显示。在大多数生物情况下，都使用对数尺度显示，在生物情况下，分布率向右偏斜。在这种情况下，将分布率进行标准化从而获得实验结果-也就是说，实验结果是Log正常值，所得数据已经经过log-转化。线性信号通过线性放大器，而对数转换即可以通过对数放大器实现也可以由对照表(LUT)获取。在分析细胞计数器中，大多数模拟数字转换器(ADC)是10位，也就是说，他们将数据分成加10 或IOM频道，但是，现在越来越多趋向于使用12-或14位的ADC以提供更大的数据解析。将从单一数据频道获得的数据(散射面或者荧光)显示在直方图中，其中X轴被分为IOM个频道(对于10位ADC)。如果该数据是线性的，则可以容易地获得该频道的频道数和线性值。在对数尺度中，X轴也被分为IOM个频道，但表示为4-log十进制(通常使用4-log十进制)。为了定量流式细胞仪的数据，可以使用多种分布的测定方法。通常，通过测量平均值和中位值来测定集中趋势。平均值是“平均数”，既可以是算数平均数也可以是几何平均数。算数平均值可以通过公式SigmaOO/n计算，几何平均值通过公式η root(al χ a2 χ a3…an)计算。通常，对对数放大的数据使用几何平均数，从而计算加权数据的分布，对线性数据或者线性刻度上显示的数据使用算数平均数。中位值是中位数值，即第50个百分数， 其中，有一半的数值在此之上，一半的数值在此之下。具有“高”表达和“低”表达的细胞可以分别根据整个群落的荧光度确定；这些参数可以方便地从流式细胞仪数据图上读出。赘生物是指一种非正常细胞增殖作用产物，包括良性肿瘤和恶性肿瘤，以及其他的增殖性疾病。低聚核苷酸一种长度高达大约100个核苷酸碱基的直线型多聚核苷酸序列。开放阅读框(ORF)用于编码氨基酸的三个一组的一系列核苷酸(密码子)，期间没有任何内部终止密码子。该序列通常可被翻译成一种肽。可操作的连接当第一核酸序列与第二核酸序列处于一种功能相关的关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作的连接。例如，如果一种启动子影响一种编码序列的转录作用或者表达时，该启动子与该编码序列可操作的连接。通常，可操作的连接的DNA序列是相邻序列，且位于同一个需要加入两个蛋白-编码区域的阅读框中。药学上可接受的载体所述药学上可接受的载体的应用是非常常见的。 E. W. Martin等人编写的由Mack出版公司，Easton，PA出版的“雷明顿(Remington' s)药物科学”第15版描述了适用于这里所公开的融合蛋白质药物传递的组合物和制剂。通常，载体的天然性质取决于所使用的具体的给药方式。例如，肠胃外制剂通常包含作为媒介物的可注射的液体，所述可注射的液体包括药学上可接受的液体和生理学上可接受的液体，例如，水、生理盐水、盐类缓冲溶液、葡萄糖水溶液、甘油等等。对于固体组合物 (例如粉末、药丸、药片或胶囊剂形式)，惯用的无毒性固体载体可以包括，例如，药用级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性的载体之外，被给药的药物组合物还可以包括少量的无毒性辅助剂物质，例如润湿剂或者乳化剂、防腐剂、和PH缓冲剂等等，例如醋酸钠或单月桂酸山梨醇酐酯。“治疗有效量”是指能够在治疗主体后实现理想的治疗效果的组合物或者细胞的量。例如，其可以包括导致免疫反应所必需的PD-I拮抗剂的量、导致抑制肿瘤生长或显著改变肿瘤或持续感染外在症状的PD-I拮抗剂的量。当对一主体给药时，通常使用能够实现目标组织浓度的剂量(例如，在淋巴细胞中的浓度)，该剂量已经显示出完成了体外作用。在特定的实施例中，治疗有效量是指能够有效诱导记忆B细胞增殖作用的试剂的量，例如，PD-I拮抗剂的量。在另一个特定的实施例中，治疗有效量是指能改改变主体所患有的疾病的表现和症状的PD-I拮抗剂的量，所述疾病例如，能够通过增加记忆B细胞反应和/或T细胞反应而改善的疾病。在治疗过程中，试剂的有效剂量，例如，PD-I拮抗剂的有效剂量可以以单一剂量的形式给药，也可以以多剂量的形式给药，例如，每日给药。但是，PD-I拮抗剂的有效剂量还取决于被治疗的主体、需要治疗的疾病的严重程度和类型、以及给药方式。这里描述的方法以相同的方式对人类和动物给药。因此，通用术语“被治疗的主体”应该被理解为包括所有需要增加理想的生物学效果的生物(例如，人、猩猩、狗、猫、马和牛)，所述生物学效果例如增加的免疫反应。多聚核苷酸术语多聚核苷酸或核酸序列是指聚合物形式的核苷酸，具有至少10 个碱基。一种重组多聚核苷酸包括一种多聚核苷酸，这种多聚核苷酸没有直接与两个编码序列相连，而在作为其衍生母体的有机体天然存在的基因组中，这种多聚核苷酸直接与所述编码序列相连(一个在5'末端相连，一个在3'末端相连)。因此所述术语包括，例如， 一种并入媒介物中的重组DNA ；—种并入自发复制的质粒或者病毒中的重组DNA ；或并入原核生物或真核生物基因组DNA中的重组DNA、或并入作为一种独立于其他序列的分离的分子(例如，一种互补DNA)而存在的基因组DNA的重组DNA。所述核苷酸可以是核糖核苷酸、 脱氧核糖核苷酸、或者这两种核苷酸的改良型。该术语包括单链形式的DNA或者双链形式的 DNA。多肽是指任意的氨基酸链，无论其长度或者翻译后修饰(例如，糖基化作用或磷酸化作用)。一种多肽的长度可以在3到30个氨基酸之间。在一个实施方案中，多肽的长度在大约7到大约25个氨基酸之间。在另一个实施方案中，多肽的长度大约在8到大约10 个氨基酸之间。在依旧另一个实施方案中，肽的长度大约为9个氨基酸。关于多肽，“包括” 是指其他的氨基酸顺序或其他的分子可以被包括在所述分子中。“基本上由…组成”是指其他的氨基酸顺序不能被包括在所述分子中，但是其他的试剂(例如标记物或者化合物)可以被包括，且“由…组成”是指其他的氨基酸顺序和其他的试剂都不能包括在所述分子中。增殖作用是指细胞分化产生子代，增殖作用可以使用本领域内已知的多种方法测定。这些方法包括，但不局限于，计算细胞总量的实验、计算特定细胞型数量的实验、 KI-67实验、胸腺嘧啶整合、和溴代脱氧尿苷实验。程序性死亡(PD)-I —种能够与PD-Ll或者PD-L2蛋白质形成一种复合物的蛋白质，其涉及一种免疫反应，例如，T细胞的共刺激作用。通常，PD-I蛋白质基本上与天然存在的(野生型)PD-I相同(参见，例如，Ishida et a 1. EMBO J. 11 :3887-3895,1992, Shinohara et al. Genomics 23 =704-706,1994 ；和美国专利第5，698，520号，所有文献通过引证在此全部并入本文)。在一些实施例中，PD-I信号能够通过减少T细胞增殖作用、产生细胞因子、 或者清除病毒来减少，例如CD8+T细胞细胞毒性。因此，通过任意标准方法测定可知，与参照水平相比，PD-I多肽能够将⑶8+T细胞的细胞毒性减少至少5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、 50%、60%、70%、80%、90%、或者多达 100%。如这里使用的，术语“活性”涉及PD-I多肽或蛋白质包括任意天然存在的PD-I蛋白质具有的活性，例如，能够通过，例如使用位于抗原呈递细胞上的天然配位体来调整活化的免疫细胞中的抑制性信号。这种调节免疫细胞中的抑制性信号的作用能够导致免疫细胞和/或免疫细胞分泌的细胞因子的增殖和/或存活率的调节。PD-I蛋白质还可以通过与一种结合B7分子的共刺激受体竞争来调整共刺激信号。因此，术语“PD-1活性”包括PD-I 多肽或蛋白质结合其天然配位体的能力，调节免疫细胞共刺激或者禁止性信号的能力，以及调节所述免疫反应的能力。“减少PD-I表达或活性”是指相对于参照物中PD-I蛋白质的水平或者生物活性， PD-I蛋白质的水平或者生物活性下降，所述参照物例如，未经处理的主体或样品。在一个具体的实施例中，相对于未经处理的参照物，所述水平或者活性减少了至少10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，乃至大于 100%。例如，如果 PD-1 蛋白质与 PD-L1、PD-12或者二者的结合减少了，会导致PD-I蛋白质生物活性的减少，从而导致PD-I 信号的减少，并因此导致CD8+T细胞细胞毒性的增加。"PD-1基因”是一种编码PD-I蛋白质的核酸。PD-I融合基因是一种与一种第二异源核酸序列可操作的连接的PD-I编码区域。PD-I融合基因包括PD-I启动子、或可以包括异源启动子。在一些实施方案中，第二异源核酸序列是一种报道基因，那就是说，其表达可以被检验的基因；报道基因包括，但不仅限于，编码葡糖醛酸酶(GUQ的基因、编码荧光素酶的基因、编码氯霉素转乙酰酶(CAT)的基因、编码绿色荧光蛋白质(GFP)的基因、编码碱性磷酸酶的基因、和编码半乳糖苷酶的基因。样品(生物学样品)包括生物学样品，生物学样品包括液体、组织、细胞、及其亚组成部分，例如DNA、RNA和蛋白质。例如，在本申请中，常用的样品包括骨髓、脾脏、淋巴结、 血液等等，外周血液(还可以包括可以分离出B细胞或者B细胞原始粒子的其他来源，包括尿液，唾液，组织活检，手术切除标本，细针穿刺材料，尸检材料等等)。特异性结合试剂是指一种基本上只与设定的靶分子结合的试剂。因此，PD-I特异性结合试剂是一种基本上结合PD-I多肽而不是无关多肽的试剂。在一个实施方案中，所述特异性结合试剂是一种能够特异性的结合PD-1、PD-Ll或PD-L2多肽的单克隆抗体或多克隆抗体。关于抗原，例如PD-1，术语“特异性结合”是指抗体或者其他的配位体优选的与一种含有这种抗原的细胞或组织完全的或者部分结合，而不与缺少这种抗原的细胞或者组织结合。当然，本领域技术人员应该理解，非特异性相互作用的某一程度可能存在于分子或非靶细胞或组织之间。然而，特异性结合可以被区别出来，由于其是通过抗原的特异性识别作用来调节的。虽然有选择反应性的抗体能够结合抗原，但是他们的结合亲合力比较低。特异性结合会导致抗体(或其他的配位体)和含有这种抗原的细胞之间的结合作用比抗体(或其他的配位体)和不含有所述抗原的配位体之间的结合更强壮。与不含有PD-I多肽的细胞或者组织相比，特异性结合一般会导致含有PD-I多肽的细胞或组织上结合抗体或其他配位体(每单位时间)的量增加2倍、例如，增加5倍、增加10倍、或者增加100倍以上。在这种情况下特异性结合需要一种抗体，这种抗体由于其对一种特定蛋白质的专一性而被选择出来。多种免疫试验方式适用于选择对特定的蛋白质具有特异性免疫活性的抗体或者其他配位体。例如，固-相酶联免疫吸附免疫测定试验(ELISA)是常用的用于选择对一种蛋白质具有特异性免疫活性的单克隆抗体。参见Harlow & Lane，Antibodies，A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Publications,New York(1988) (Harlow & Lane 等人编写的 Cold Spring Harbor出版公司，纽约，于1988年出版的“抗体，一种实验手册”)中的关于用于确定具体的免疫反应性的免疫测定技术形式和条件的描述。T细胞是一种对免疫反应至关重要的白血细胞。T细胞包括，但是不局限于， ⑶4+T细胞和⑶8+T细胞。⑶4+T淋巴细胞是一种免疫细胞，该免疫细胞能够在其表面上携带一种标记物，所述表面被叫做分化4簇(CD4)。这些细胞又名辅助性T细胞，能帮助安排免疫反应，包括抗体应答以及杀伤性T细胞反应。⑶8+T细胞携带“分化8簇”(⑶8)标记物。在一个实施方案中，CD8+T细胞是一种细胞毒性T细胞。在另一个实施方案中，CD8+细胞是一种抑制性T细胞。当T细胞对呈递到抗原呈递细胞上的重要的特异性抗原作出反应时，T细胞被活化。转导/转染转导细胞是一种细胞，在此细胞中已经通过分子生物学技术引入了一种核酸分子。如这里所使用的术语“转导”包括所有能够将核酸分子引入这种细胞的技术，包括用病毒媒介物转染、与质粒媒介物转化、和通过电穿孔、脂质转染法和加速粒子枪等技术引入无保护的DNA。媒介物是指一种核酸分子通过被引入宿主细胞中来产生一种转换的宿主细胞。 媒介物可能包括任意核酸序列，这种核酸序列能够在宿主细胞中复制，例如，作为复制的起源。媒介物可以包括一种或一种以上编码可选择的标记物及本领域内已知的其他遗传因子的核酸。媒介物包括质粒媒介物，包括用于表达革兰氏阴性细菌细胞和革兰氏阳性细菌细胞的质粒。实例性的媒介物包括能够在大肠杆菌和沙门氏菌中表达的媒介物，所述媒介物还包括病毒媒介物，例如，但是不局限于，反向病毒、原痘、鸟痘病毒、传染性上皮瘤病毒、羊痘病毒、suipox、腺病毒、疱疹病毒、α病毒、杆状病毒、辛德毕斯病毒、牛痘病毒和脊髓灰质炎病毒媒介物。除非另有解释，这里使用的所有科学技术术语都与本发明所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。单数术语“一个(a)”、“一种(an)”也包括复数的意思，除非上下文另有清楚的说明。同样，术语“或者(or)”包括“和0 and”的意思，除非上下文另有清楚的说明。本领域技术人员更应该理解的是所有的给定的核酸或者多肽的碱基尺寸或氨基酸尺寸，以及分子量或者分子质量是近似值，并且只起到描述的作用。尽管与本发明已经描述过的相似或者相同的方法和材料可以被用于实现或者检测这里所公开的发明，但是下面描述的是适当的方法和材料。术语“含有(comprise)”是指“包括(include)”。这里提到的所有的出版物、专利申请、专利及其他参考文献通过引证在此全部并入本文。如果有冲突的话，以本发明说明书，包括术语的解释为准。另外，所述材料、方法和实施例只起到说明性作用，并不作为一种限制。相关申请这里公开的主题内容与2007年12月沈日递交的PCT申请第PCT/US2007/088851 号、2005年6月8号递交的美国临时申请第60/688,872号、2006年6月8日递交的美国实用新型申请第11/449,919号和2006年6月8日递交的PCT申请PCT/USZOOe/^MZS的主题内容相关。该申请还与2006年12月27日递交的美国临时申请第60/877，518号有关。 前述所用申请通过弓I证在此全部并入本文。PD-I 拮抗剂
这里公开的方法包括PD-I途径抑制剂(PD-1拮抗剂)的使用。PD-1分子是免疫球蛋白基因总科的成员。人PD-I具有包含免疫球蛋白总科域的细胞外区域、横跨膜域和包括免疫受体酪氨酸基禁止基序(ITIM)的胞内区域((Ishida et al.，EMBO J. 11 =3887,1992 ； Shinohara et al. ,Genomics 23 :704，1994 ；美国专利第 5，698，520 号)。这些特点也定义了一种分子大族，叫做免疫抑制受体，所述免疫抑制受体还包括gp49B、PIR-B、和杀伤抑制受体(KIRs) (Vivier and Daeron(1997) Immunol. Today 18:286)。不局限于任何理论，人们相信这些受体的酪氨酰磷酸化的ITIM基序能够与包含磷酸酶Sl 12-区域相互作用，这会导致抑制信号。这些免疫抑制受体的子集与主要组织相容性复合体(MHC)分子相结合，例如，杀伤抑制受体(KIRs)和CTLA4与B7-1和B7-2结合。在人体中，PD-I是一种50_55kDa的I型横跨膜受体，最初在经过活化作用导致的细胞凋亡的T细胞株中识别。PD-I在T细胞、B细胞和巨噬细胞上表达。PD-I的配位体是 B7族成员PD-配位体1 (PD-L1，又名B7-H1)和PD-L2 (又名B7-DC)。在活体内，PD-I在活化的T细胞、B细胞和单核细胞上表达。实验数据表明PD-I 与它的配位体在中枢免疫反应和外周免疫反应的下游调节作用下发生相互作用。特别是在野生型T细胞而不是在PD-I缺乏型T细胞中的增值在在有PD-Ll参与的情况下被抑制。另外，PD-I-缺陷型老鼠表现出一种自身免疫表型。人PD-I的示范性的氨基酸顺序如下所述(还是参见Ishida et al.，EMBO J. 11 3887，1992 ；Shinohara et al.，Genomics 23 :704，1994 ；美国专利第 5，698，520 号)
0160]mqipqapwpv vwavlqlgwr ρgwfldspdrpwnpptffpa0161]llvvtegdna tftcsfsnts esfvlnwyrmspsnqtdkla0162]afpedrsqpg qdcrfrvtql pngrdfhmsvvrarrndsgt0163]ylcgaislap kaqikeslra elrvterraevptahpspsp0164]rpagqfqtlv vgvvggllgs lvllvwvlavicsraargti0165]garrtgqplk edpsavpvfs vdygeldfqwrektpeppvp0166]cvpeqteyat ivfpsgmgts sparrgsadgprsaqplrpe0167]dghcswpl(SEQ ID NO :1)0168]老鼠PD-I的示范性的氨基酸顺序如下所述0169]mwvrqvpwsf twavlqlswq sgwllevpngpwrsltfypa0170]wltvsegana tftcslsnws edlmlnwnrlspsnqtekqa0171]afcnglsqpv qdarfqiiql pnrhdfhmnildtrrndsgi0172]ylcgaislhp kakieespga elvvteriletstrypspsp0173]kpegrfqgmv igimsalvgi pvllllawalavfcstsmse0174]argagskddt lkeepsaapv psvayeeldfqgrektpelp0175]tacvhteyat ivfteglgas amgrrgsadglqgprpprhe0176]dghcswpl(SEQ ID NO :2)0177]其他氨基酸序列公幵在美国专利第6，808，710号和美国专利申请公幵号
2004/0137577、美国专利申请公开号2003/0232323、美国专利申请公开号2003/0166531、 美国专利申请公开号2003/0064380、美国专利申请公开号2003/0044768、美国专利申请公开号2003/0039653、美国专利申请公开号2002/0164600、美国专利申请公开号2002/0160000、美国专利申请公开号2002/0110836、美国专利申请公开号2002/0107363、 和美国专利申请公开号2002/0106730中，这些专利或专利申请在此通过引证并入本文。 PD-I是免疫球蛋白(Ig)总科的成员，在它的细胞外区域包含单个Ig V样区域。PD-I的细胞质区域包含两个酪氨酸，其中与细胞膜最接近的酪氨酸(在老鼠PD-I中是VAYEEL(参见 SEQ ID NO :2的氨基酸223-228))位于ITIM(免疫受体酪氨酸基抑制基序)内部。PD-I上免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)的存在表明该分子具有通过补充细胞质磷酸酶减弱抗原受体信号的功能。人和鼠PD-I蛋白质具有大概60%的氨基酸一致性，带有四个潜在的 N-糖基化作用地点的保守区域和定义Ig-V区域的残基。在人和老鼠的进化同源基因之间， 细胞质区域中的免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)和在羧基末端酪氨酸(在人和老鼠中分别为TEYATI (参见SEQ ID NO :2中的氨基酸166-181))周围的免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)样基序具有保守性。根据其结合PD-I的能力，PD-I是分子族的成员。在活体内，类 CTLA4、PD-1作为抗-CD3的响应快速的生成在T细胞表面上(Agata et al. Int. Immunol. 8 765，1996)。然而，与CTLA4相反，PD-I还产生在B细胞的表面上(作为对抗_免疫球蛋白M的应答)。PD-I还表达在胸腺细胞和骨髓细胞的子集上(Agata et al. (1996) supra； Nishimura et al. (1996)Int. Immunol. 8 :773)。T细胞的无反应性伴随有PD-I表达的相互影响。这里公开了 T细胞的细胞毒性可以通过将T细胞与一种能够减少PD-I表达或者活性的试剂相接触来增加。更准确的说，这里公开了能够用于减少PD-I表达或者活性的试剂可以用于增加免疫反应，使之达到一种病毒抗原或肿瘤抗原的程度。不局限于任何理论，PD-I表达或活性的减少会导致细胞毒性T细胞活性的增加， 并同事会增加其对传染性试剂的特异性免疫应答。为了使T细胞对外源蛋白做出反应，必须通过抗原-呈递细胞(APC)提供两种信号从而支撑T淋巴细胞。第一种信号赋予免疫反应特异性，在识别出存在于主要组织相容性复合体(MHC)中的外源抗原肽之后，该信号通过T细胞受体(TCR)被转导。第二种信号叫做共刺激作用，导致T细胞增殖并具有功能性。 共刺激作用既不具有抗原特异性又不具有主要组织相容性复合体(MHC)限制，可以通过一种或一种以上抗原-呈递细胞(APC)表达的不同的细胞表面多肽来提供。如果T细胞只通过T细胞受体被刺激且没有收到其他的共刺激信号的话，他们会变得无反应、无活动力或死亡，从而导致免疫反应下调。在抗原-呈递细胞(APC)上表达的⑶80(B7-1)和⑶86 ￠7- 蛋白质是至关重要的共刺激性多肽。尽管B7-2在最初的免疫响应期间起到了突出的作用，B7-1在免疫反应后期被上调从而延长最初的T细胞响应或者共刺激次要的T细胞响应。B7多肽能够向免疫细胞提供共刺激信号或抑制性信号，从而促进或抑制免疫细胞响应。例如，当与共刺激受体结合时，PD-Ll (B7-4)当以可溶形式存在时会导致免疫细胞的共刺激作用或抑制免疫细胞共刺激作用。当与一种抑制性受体结合时，PD-Ll分子可以向免疫细胞传播一种抑制性信号。示范性的B7族成员包括B7-1、B7-2、B7-3 (通过抗体BB-I识别)、B7h (PD-Ll)、和 B7-4及其可溶解的片段或者衍生物。B7族成员在免疫细胞上结合一种或一种以上受体，例如CTLA4、⑶观、I COS, PD-I和/或其他的受体，并且，根据不同的受体，B7族成员具有向免疫细胞传播抑制性信号或共刺激信号的能力。
⑶观是一种受体，可以在休眠T细胞上组成性表达。在信号通过T细胞受体之后， ⑶观的连接和共刺激信号的转导会导致IL-2的增殖和分泌。CTLA4 (⑶15 是与⑶观相同的受体，在休眠T细胞中CTLA4是缺失的，但是在T细胞活化之后会导致他的表达。CTLA4 在T细胞响应负调节中起到重要作用。ICOS是一种与⑶观和CTLA4有关系的多肽，其包含在IL-10的生产过程中。PD-I是能够结合PD-Ll和PD-L2的受体，他能够快速地在T细胞表面上诱导。PD-I还可以在B细胞的表面上被表达(作为抗免疫球蛋白M的响应)并且能够在胸腺细胞子集和骨髓细胞上被表达。PD-I的接合(例如通过交联或通过聚集作用)会导致免疫细胞中抑制信号的传输，从而导致免疫响应的减少同时伴随免疫细胞无反应性的增加。PD-I族成员在抗原呈递细胞上结合一种或一种以上受体，例如PD-Ll和PD-L2。PD-Ll和PD-L2都是人PD-I配位体多肽，是B7族多肽的成员(参见上面)。每个PD-I配位体都包含一种信号序列、一种IgV 区域、一种IgC区域、一种横跨膜区域和一种短细胞质尾部。在活体内，这些配位体已经被证明能够在胎盘、脾、淋巴结、胸腺和心脏中表达。PD-L2还可以在胰腺、肺和肝中被表达，而 PD-Ll可以在胎儿的肝、活化的T细胞和内皮细胞中表达。PD-I的两个配位体再活化的单核细胞和树突状细胞中被表达。PD-Ll示范性的氨基酸序列(2000年10月4号生效的GENBANK基因银行登记号 AAG18508)在下面进行了阐述
0185]mrifavfifm tywhllnaft vtvpkdlyvv eygsnmtiec
0186]kfpvekqldl aalivyweme dkniiqfvhg eedlkvqhss
0187]yrqrarllkd qlslgnaalq itdvklqdag vyrcmisygg
0188]adykritvkv napynkinqr ilvvdpvtse heltcqaegy
0189]pkaeviwtss dhqvlsgktt ttnskreekl fnvtstlrin
0190]tttneifyct frrldpeenh taelvipelp lahppnerth
0191]lvilgaillc lgvaltfifr lrkgrmmdvk kcgiqdtnsk
0192]kqsdthleet(SEQ ID NO :3)
0193]一种示范性PD-L2前体氨基酸序列(2002年4月8号生效的GENBANK基因银行登记号AAK15370)在下面进行了阐述
0194]mifIllmlsl elqlhqiaal ftvtvpkely iiehgsnvtl
0195]ecnfdtgshv nlgaitaslq kvendtsphr eratlleeql
0196]plgkasfhip qvqvrdegqy qciiiygvaw dykyltlkvk
0197]asyrkinthi lkvpetdeve ltcqatgypl aevswpnvsv
0198]pantshsrtp eglyqvtsvl rlkpppgrnf scvfwnthvr
0199]eltlasidlq sqmeprthpt wllhifipse iiafifiatv
0200]ialrkqlcqk lysskdttkr pvtttkrevn sai(SEQ ID NO 4)
0201]一种示范性PD-L2前体氨基酸序列(2006年12月12号生效的GENBANK基因银行登记号Q9BQ51)在下面进行了阐述
0202]mifIllmlsl elqlhqiaal ftvtvpkely iiehgsnvtl
0203]ecnfdtgshv nlgaitaslq kvendtsphr eratlleeql
0204]plgkasfhip qvqvrdegqy qciiiygvaw dykyltlkvk
asyrkinthi lkvpetdeve ltcqatgypl aevswpnvsvpantshsrtp eglyqvtsvl rlkpppgrnf scvfwnthvreltlasidlq sqmeprthpt wllhifipfc iiafifiatvialrkqlcqk lysskdttkr pvtttkrevn sai(SEQ ID NO :46)PD-I拮抗剂包括能够减少PD配位体1 (PD-Ll)或者PD配位体2 (PD-L2)表达或者活性的试剂或者能够减少PD-I和PD-Ll之间相互作用或减少PD-I和PD-L2之间相互作用的试剂。示范性化合物包括抗体(例如一种抗PD-I抗体、一种抗-PD-Ll抗体和一种抗-PD-L2抗体)、RNAi分子(例如抗PD-I RNAi分子、抗PD-LlRNAi、和抗PD_L2RNAi)、反义分子(例如抗PD-I反义RNA、抗PD-Ll反义RNA、和抗PD-L2反义RNA)、显性负蛋白质(例如一种显性负PD-I蛋白质、一种显性负PD-Ll蛋白质、和一种显性负PD-L2蛋白质)、和小分子抑制剂。PD-I拮抗剂是指任意能够减少细胞中PD-I表达或者活性的试剂。与参照物中的表达及活性相比，PD-I表达或者活性被减少了大约10%,20%,30%,40%,50%,60%, 70%、80%、90%、或100%。活性方面示范性的减少了至少大约50%、至少大约60%、至少大约70%、至少大约80%、至少大约90%、至少大约95%、或完全没有可检测到的活性。在一个实施例中，所述对照物是没有被PD-I拮抗剂处理的细胞。在另一个实施例中，所述对照物是一种标准值，或者用一种已知不会影响PD-I活性的试剂，例如载体，处理后的细胞。 PD-I的表达或活性可以通过任何本领域内已知的方法来确定，包括这里所描述的方法。任选的，PD-I拮抗剂抑制或减少PD-I与PD-L1、PD-L2或二者的结合。A.抗体这里公开的方法中使用了能够特异性结合PD-1、PD_L1或PD_L2(或其联合)的抗体。抗体包括单克隆抗体、人源化抗体去免疫抗体、和免疫球蛋白(Ig)融合蛋白。多克隆的抗-PD-I、抗PDLl或PD-L2抗体可以通过本领域内已知的方法来制备，例如，通过用PD-I配位体或者PD-I免疫原免疫适当的主体(例如，动物主体)、抗-PD-1、抗-PD-Ll或抗-PD-L2 抗体在免疫主体中的滴定值可以通过标准技术进行实时监控，例如使PD-I配位体或PD-I 多肽固定进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。在一个实施方案中，特异性结合PD-I、PD-Ll或者PD-L2 (或其结合)的抗体分子可以从哺乳动物(例如，从血清中)分离出来，并使用本领域普通技术人员已知的技术进行纯化，例如，抗体可以通过使用蛋白质A色层分离法进行纯化从而产生分离的免疫球蛋白 G(IgG)抗体。产生抗体的细胞可以从主体处获得，并通过标准技术来制备单克隆抗体(参 JAL Kohler and Milstein Nature 256 495 49,1995 ；Brown et al. , J. Immunol. ( ^1 学)127 :539 46,1981 ；Cole et al. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R. Liss, Inc.，pp. 77 96，1985 ；Gefter, Μ. L. et al. (1977) Somatic Cell Genet.3 :231 36 ；Kenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies :A New Dimension In Biological Analyses (在单克隆抗体中一种生物学分析的新尺度).Plenum Publishing Corp. , New York, N. Y. (1980) ；Kozbor et al. Immunol. Today 4 :72,1983 ；Lerner, Ε. Α. (1981) Yale J. Biol. Med. 54 :387 402 ；Yeh et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. 76 :2927 31,1976).在一个实施例中，将永生的细胞株(一般是骨髓瘤细胞株)融合到淋巴细胞(通常是脾细胞)中，所述淋巴细胞是从用PD-1、PD-L1或PD-L2免疫的哺乳动物中获得的，且，所得杂交瘤细胞的培养物上清液被筛选来识别能够产生特异性结合所关心多肽的单克隆抗体的杂交瘤。在一个实施方案中，为了产生杂交瘤，从获得淋巴细胞的相同的哺乳动物种中获得永生的细胞株(例如骨髓瘤细胞株)。例如，可以通过将用PD-1、PD-L1或PD-L2肽免疫的老鼠中的淋巴细胞与一种永生的老鼠细胞株相融合来制备鼠科杂交瘤。在一个实施例中，使用的小鼠骨髓瘤细胞株对包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养基(“HAT培养基")敏感。根据标准技术，任意大量的骨髓瘤细胞系都可以用作融合配体，包括，例如， P3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63-Ag8. 653或Sp2/0_Agl4骨髓瘤细胞系，这些细胞系可以从位于 R0Ckville，Md的美国典型菌种保藏中心(ATCC)处获得。HAT-敏感的小鼠骨髓瘤细胞可以使用聚乙二醇(“PEG”)被融合到老鼠脾细胞中。融合产生的杂交瘤细胞随后使用HAT培养基进行筛选，HAT培养基能够杀死未融合的(已经非生产性融合的)骨髓瘤细胞。产生所关心的单克隆抗体的杂交瘤细胞可以通过，例如，筛选杂交瘤培养物上清液来检测，从而通过使用免疫试验(例如酶联免疫吸附测定试验(ELISA)或放射免疫测定法(RIA)测定能够结合PD-1、PD-L 1或PD-L2分子的抗体的生成。作为可以替换的方法，为了制备隐藏单克隆抗体的杂交瘤，通过用PD-1、PD-Ll或 PD-L2筛选重组组合的免疫球蛋白文库(例如一种抗体噬菌体展示文库)从而分离免疫球蛋白文库中能够忒一些结合所述多肽的成员，来识别和分离能够特异性结合PD-1、PD-Ll 或PD-L2的单克隆抗体。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是可以商业购得的(例如，但不仅限于，Pharmacia公司和Mratagene公司)。尤其可以有效的用于生产和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实施例可以在例如，美国专利第5，223，409号；PCT公开号WO 90/(^809 ;PCT
发明者G·弗里曼, K·蒂坦吉, R·阿梅德, R·阿玛拉, V·韦露 申请人:埃默里大学, 达纳-法伯癌症研究院有限公司