专利名称：用于检测生物分子的相互作用的方法和单元的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及使用固定有生物分子(生体関連分子)的载体检测生物分子的相互作 用的方法以及用于在该方法中使用的单元。
背景技术：
随着基因组解析的发展，参与各种生物的生理反应的生物分子被明确。这些生物 分子包括DNA、蛋白质、糖链、细胞等，功能和结构等已明确的分子被用于药物开发或临床检 验、食品检验、环境检测等各种产业用途中。在以临床检验为首的检验中，通常采用以下的方法。即，如果使检体与载体上固定 有与要检测的生物分子(以下称为分析物)特异性结合的探针分子(以下称为配体)的器 件接触，当检体上存在分析物时，由于和配体结合，分析物在载体上被捕获，从而该被捕获 的分析物被检测到。如上所述的检验方法近年来也要求高速化、自动化，从而迫切希望研究出同时综 合地计测几百 几万的生物分子的检测方法，使用固定生物分子的集成技术、所谓的MEMS 技术的器件设计成为可能，其是作为所谓的微阵列用于药物开发研究和生物研究中的综合 解析。作为器件的微阵列根据被固定在载体上的探针分子的种类，包括DNA微阵列(也 称之为DNA芯片)、蛋白质微阵列(也称之为蛋白质芯片)、细胞微阵列(也称之为细胞芯 片)等。解析是使预先用例如荧光物质进行了荧光标记的检体接触微阵列上，然后洗涤微 阵列，然后检测测定荧光物质发出的荧光信号，从而鉴定或定量检体中所含的分析物(特 表 2006-515065 号公报)。DNA芯片等的微阵列通常被制成载玻片那样的大小，专门在其上滴上检体，用标本 覆盖使之反应。今后，根据用途大量自动处理微阵列是必要的。这种情况下希望将微阵列 小型化，并且希望开发出用于自动处理小型化微阵列的有效的手段。发明概述本发明人等为了自动处理小型化了的微阵列，而将微阵列固定在支撑构件上，将 其插入容纳有检体的中空支架(holder)中，使之反应，结果发现由于检体的容积为微量 (几μ 几百μ )，所以受表面张力影响，检体与微阵列的接触进行得不充分，导致反应不 充分。因而，本发明的课题是提供一种在小型化微阵列的自动处理中，用于使微量的检 体与微阵列的接触充分进行的手段。本发明人通过在将微阵列固定在支撑构件上后将其插入容纳有反应液的中空支 架中使之反应之际，进行定位，使支撑构件不偏斜地插入到中空支架内，发现检体与微阵列 的接触得以充分进行，从而完成了本发明。S卩，本发明包含以下的发明。
(1)单元，所述单元是使用固定有生物分子的载体检测生物分子的相互作用中使 用的单元，其具备一端具有开口部另一端封闭的中空支架和固定有载体的可插入中空支架 的载体支撑构件，所述载体固定有生物分子，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下， 载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的边缘咬合，由此中空支架被密封，同时，载体支 撑构件和中空支架被定位，在以定位姿势沿包括中空支架轴心的面切开的剖面图中，由中 空支架的内侧和固定有载体的载体支撑构件的外侧所构成的面积在载体支撑构件的自载 体固定部至前端部的区域，在轴心的左右是大致相同的。(2) (1)所述的单元，载体支撑构件中的载体固定部是具有底面和侧面的凹部，载 体被配置于凹部的底面。(3) (2)所述的单元，载体支撑构件凹部的至少后端部一侧的侧面是倾斜面。(4) (3)所述的单元，倾斜面的表面粗糙度在IOym以下，倾斜面与底面所成的角 度在75°以下。(5) (2) (4)任一项所述的单元，在载体支撑构件凹部的自前端部一侧的侧面至 前端部形成有排液槽。(6) (1) ( 任一项所述的单元，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下， 在载体支撑构件的自载体固定部至前端部一侧的区域，载体支撑构件的体积占中空支架容 积的比例为60%以上。(7) (1) (6)任一项所述的单元，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下， 载体支撑构件的体积占中空支架容积的比例为25 70%。(8) (1) (7)任一项所述的单元，具有分别固定有载体的多个载体支撑构件，载 体支撑构件的后端部分别被固定于表面材料，具有对应于各个支撑构件的多个中空支架。(9)使用固定有生物分子的载体检测生物分子的相互作用的方法，包括将固定 有生物分子的载体固定于载体支撑构件，将该载体支撑构件插入到一端具有开口另一端封 闭的容纳有反应液的中空支架中，由此使载体上生物分子与反应液中已被荧光标记的生物 分子进行相互作用的相互作用工序；通过洗涤载体除去没有和载体上固定的生物分子发生 相互作用的生物分子的洗涤工序和对载体照射激发光，通过检测器检测荧光的检测工序； 在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的 边缘咬合，由此中空支架被密封，同时，载体支撑构件和中空支架被定位，在以上述定位姿 势沿包括中空支架轴心的面切开的剖面图中，由中空支架的内侧与固定有载体的载体支撑 构件的外侧所构成的面积在载体支撑构件的自载体固定部至前端部的区域，在轴心的左右 是大致相同的。(10) (9)所述的方法，载体支撑构件中的载体固定部是具有底面和侧面的凹部，载 体被配置于凹部的底面。(11) (10)所述的方法，载体支撑构件凹部的至少后端部一侧的侧面是倾斜面。(12) (11)所述的方法，倾斜面的表面粗糙度在IOym以下，倾斜面与底面所成的 角度在75°以下。(13) (10) (1 任一项所述的方法，在载体支撑构件凹部的自前端部一侧的侧 面至前端部形成排液槽。(14) (9) (1 任一项所述的方法，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势5下，在载体支撑构件的自载体固定部至前端部一侧的区域，载体支撑构件的体积占中空支 架容积的比例为60%以上。(15) (9) (14)任一项所述的方法，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势 下，载体支撑构件的体积占中空支架容积的比例为25 70%。(16) (9) (15)任一项所述的方法，具有分别固定有载体的多个载体支撑构件， 载体支撑构件的后端部分别被固定于表面材料，具有对应于各个支撑构件的多个中空支架。根据本发明，可提供一种在小型化微阵列的自动处理中，用于使微量的检体与微 阵列的接触充分进行的手段。本说明书包含作为本申请优先权基础的特愿2008-141155号的说明书、权利要求 书和附图中记载的内容。
图1给出了本发明的一个实施方式。图2给出了本发明的一个实施方式。图3给出了本发明的一个实施方式。图4给出了本发明的一个实施方式。图5给出了本发明的一个实施方式。图6给出了载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的边缘咬合的情况(a)和不 咬合的情况(b)的比较结果。图7给出了具有排液槽的载体支撑构件(a)、不具有排液槽的载体支撑构件(b)和 中空支架(C)的一个实施方式。图8给出了使用具有排液槽的载体支撑构件和不具有排液槽的载体支撑构件时 的检测结果。图9给出了在插入到中空支架的姿势下，载体支撑构件的体积占中空支架的容积 的比例为80%的载体支撑构件(a)和50%的载体支撑构件(b)分别插入到容纳有反应液 的中空支架中的结果。
具体实施例方式本发明中，生物分子包括DNA和RNA等核酸、肽、糖链和细胞、它们的复合体以及它 们与其他分子的复合体等。本发明中，肽包括寡肽、多肽和蛋白质。载体上固定的生物分子 是肽时，通常1 lOOOkDa、优选1 200kDa的肽是理想的。此外，载体上固定的生物分子 是核酸时，通常3 5000碱基、优选10 1000碱基的核酸是理想的。此外，载体上固定的 生物分子是糖链时、通常1 100糖、优选1 30糖的糖链是理想的。本发明中，生物分子 优选是核酸、更优选是DNA。生物分子的相互作用优选是指生物分子之间的特异性相互作用，包括例如，蛋白 质之间的相互作用、蛋白质和肽的相互作用、核酸之间的相互作用、蛋白质和核酸的相互作 用、蛋白质和化合物的相互作用等。更具体而言，可举出核酸互补链之间的杂交、抗原与抗 体或其片断的反应、酶与基质或抑制剂的结合反应、配体和受体的结合反应、亲和素和生物素的结合反应、核酸和转录因子的结合反应、细胞粘附因子的结合反应、糖链和蛋白质的结 合反应、脂肪链和蛋白质的结合反应、磷酸基和蛋白质的结合反应、辅助因子和蛋白质的结 合反应等。本发明使用固定有生物分子的载体(有时也称之为微阵列)检测生物分子的相互 作用，其特征在于，在该检测中，使用具备一端具有开口部另一端封闭的中空支架和固定有 微阵列且可插入中空支架的载体支撑构件的单元；通过将载体支撑构件插入到容纳有反应 液的中空支架中，使微阵列和反应液接触，使生物分子相互作用。一端具有开口部另一端封闭的中空支架只要是能容纳反应液，则无特殊限制。中 空支架可以是单独的支架，也可以使用多个连结得到的支架。中空支架可举出本技术领域 中通常使用的微型管和微滴板(例如，96孔板)等。中空支架尺寸是本领域技术人员根据 用途可适当设定的，但可使用例如开口部的直径在6 12mm的范围，长度在15 35mm的 管状物。中空支架中可容纳含被荧光标记了的生物分子的检体作为反应液，通过向其中插 入载体支撑构件，使载体和反应液接触，使载体上的生物分子与反应液中被荧光标记了的 生物分子相互作用。反应液也可容纳核酸扩增产物。在通过洗涤载体除去和载体上固定的 生物分子未发生相互作用的生物分子的洗涤工序中，也可在将洗涤液容纳于中空支架、发 生相互作用后再将载体支撑构件插入其中进行洗涤。也可分别使用容纳检体作为反应液的 中空支架和容纳洗涤液作为反应液的中空支架。在使载体上的生物分子与反应液中的被荧光标记了的生物分子发生相互作用的 相互作用工序中，优选通过加热中空支架来加热反应液。本发明中，在载体支撑构件被插入 至中空支架的姿势下，通过载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的边缘相咬合，中空 支架被密封，因而可在抑制反应液蒸发的同时，有效加热。有时，在加热之际，一部分蒸发的 反应液会在密封中空支架的载体支撑构件后端部冷却，从而形成液滴。因而，在相互作用工 序中，通过对载体支撑构件后端部也一起加热，可抑制液滴的形成，防止微量的反应液减少 导致反应液中生物分子的浓度发生变化。相互作用工序中的加热温度为30 60°C，优选为 35 55°C，载体支撑构件后端部的加热温度也是一样的。本发明中，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的后端部 和中空支架开口部的边缘咬合，载体支撑构件和中空支架被定位。例如，如图1所示，通过 载体支撑构件12的后端部13和中空支架11的开口部的边缘15咬合，载体支撑构件在中 空支架内被定位在规定的位置上(图la)，如果载体支撑构件12的后端部13和中空支架 11的开口部的边缘15没有咬合，每次把载体支撑构件插入中空支架，中空支架内的载体支 撑构件的位置都会发生变化，不能定位在规定的位置上(图16)。本发明中，载体支撑构件和中空支架构成如下在以载体支撑构件被插入到中空 支架的上述定位姿势下，沿包括中空支架轴心的面切开的剖面图中，由中空支架的内侧和 固定有载体的载体支撑构件的外侧所构成的面积，在载体支撑构件的自载体固定部至前端 部的区域，在轴心的左右是大致相同的。例如，图2给出了以载体支撑构件被插入到中空支架的上述定位姿势下，沿包括 中空支架轴心21的面切开的剖面图的一个例子。在该剖面图中，中空支架的内侧和固定 有载体的载体支撑构件的外侧所构成的面积中，载体支撑构件的自载体固定部至前端部M的区域的面积包括轴心左侧22表示的部分的面积和轴心右侧23表示的部分的面积。通过 以该22的面积和23的面积大致相同的方式构成载体支撑构件和中空支架，使左右的表面 张力相等，从而可使载体14和反应液充分接触，而不会发生反应液的液面偏斜。图加中， 22的面积和23的面积并非大致相同，所以反应液如虚线所示发生偏斜。而图2b中，22的 面积和23的面积大致相同，所以反应液变为水性。所谓大致相同是指相差在20%以下、优 选在10%以下、更优选在5%以下。图2给出了沿着包括中空支架轴心21的面切开的剖面 图中将载体14切断的剖面图，因而，虽然并不是相对于中空支架的轴心成左右对称，但对 于相对于中空支架的轴心成左右对称的界面也是同样的。即，对于任意包括中空支架轴心 的截面上述左右的面积都是大致相同。在优选的实施方式中，例如如图3所示，载体支撑构件的载体固定部31是具有底 面32和侧面33 (33a和33b)的凹部，载体14配置于凹部的底面32。更优选载体支撑构件 凹部31的至少后端部13侧的侧面33a是倾斜面。优选载体支撑构件凹部31的前端部M 侧的侧面3 也是倾斜面。通过使后端部一侧的侧面33a为倾斜面，在将载体支撑构件插入 到中空支架内的反应液时可能混入的气泡容易逃逸到上部。此外，通过使该倾斜面的表面 粗糙度在10 μ m以下、优选在1 μ m以下，使倾斜面与底面所成的角度(图3的34)在75° 以下、优选在45°以下，气泡更容易逃逸。如果气泡不能顺利逃逸，则载体和反应液的接触 将受到阻碍，也可能导致生物分子的相互作用在载体的一部分上受到阻碍，但通过使之成 为气泡可顺利逃逸的上述构成，载体和反应液可达到良好的接触。优选在载体支撑构件上从凹部前端部一侧的侧面到前端部形成排液槽。例如如 图4所示，通过在凹部前端部一侧的侧面3 至前端部M形成排液槽41，可有效地将从中 空支架内的反应液中提拉载体支撑构件时可能残留在凹部的反应液排液。拉出载体支撑构 件后，通过使载体支撑构件的前端部M和滤纸接触，可更有效地排液。本发明中，在生物 分子相互作用后，在除去和载体上固定的生物分子未发生相互作用的生物分子的洗涤工序 中，通过使用含易潮解物质的洗涤液，可不干燥载体而直接对载体照射激发光，通过检测器 检测荧光。在生物分子的相互作用和洗涤中，由于使用了含盐的溶液，所以如果干燥载体， 则会产生盐导致的干燥不均现象，存在干燥不均导致的散射光强，难于正确检测的情况。特 别是在成像光学系的检测器中，干燥不均导致的散射光强，和扫描型检测器相比，存在很难 正确检测的情况，但如果使用含易潮解物质的洗涤液不进行干燥就进行检测，就可抑制干 燥不均导致的光散射的发生。在不干燥载体就进行检测的方式中，载体支撑构件的凹部如 果积存液体，则也有可能产生检测误差，但通过设置排液槽，可迅速地将凹部残留的多余洗 涤液排液，可降低检测误差。易潮解物质只要是不妨碍生物分子的相互作用，则无特殊限制，但例如可举出氯 化镁、氯化钙、氢氧化镁等碱土金属盐、碳酸钾、溴化钠等碱金属盐等。洗涤液中易潮解物质 的浓度通常为0. 01 3. Omol/1、优选为0. 05 1. Omol/1、更优选为0. 2 0. 5mol/l。在本发明优选的方式中，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，在载体支 撑构件的自载体固定部到前端部M侧的区域，载体支撑构件的体积占中空支架的容积的 比例为60%以上，优选为80%以上，更优选为90 95%。例如在图5中，在载体支撑构件 被插入至中空支架的姿势下，在载体支撑构件12的自载体固定部至前端部一侧的区域(虚 线以下的区域)、即载体固定部的前端部一侧末端处沿与中空支架11的轴心垂直的面切开的情况下，在不含载体固定部的一侧，载体支撑构件的体积占中空支架的容积的比例为上 述值。通过将载体支撑构件的自载体固定部至前端部一侧设计得稍大，可在将载体支撑构 件插入到中空支架时，中空支架中容纳的反应液为微量的情况下也可使液面上升而与载体 充分接触。因而，可使操作之际的液体的量减少。此外，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的体积占中空 支架的容积的比例优选为25 70%，更优选为40 50%。通过使载体支撑构件的体积的 比例为一定的值以下，可防止载体支撑构件插入时液体溢出。本发明中使用的单元也可具有多个载体支撑构件和对应于各个支撑构件的多个 中空支架。多个载体支撑构件上分别固定有载体，优选载体支撑构件的后端部分别被固定 于表面材料，可作为整体进行工作。所谓具有对应于各个载体支撑构件的多个中空支架是 指载体支撑构件分别插入到多个中空支架上而构成的。通过使用分别固定有载体的多个载 体支撑构件和多个中空支架，可有效实施大量的试验。本发明的检测方法中，在通过洗涤载体除去与载体上固定的生物分子未发生相互 作用的生物分子的洗涤工序之后，实施对载体照射激发光，通过检测器检测荧光的检测工序。本发明中，作为检测器优选使用成像光学系的检测器。成像光学系的检测器是对 载体照射激发光，检测得到的荧光的强度的检测器。成像光学系的检测器通常具备用于照 射激发光的激光器、仅使目标波长的荧光通过的荧光过滤器、用于检测通过荧光过滤器的 荧光的光检测部(例如、CXD照相机)。本发明中，通常，通过激光器向整个载体倾斜地照射 一次激发光，从载体的正面检测荧光。所谓向载体倾斜地照射激发光是指载体表面和激光 所成的角度小于90°，通常采用30 70°，优选采用40 60°的角度进行照射。在成像 光学系的检测器中，没有必要激光扫描载体的整个表面，可在短时间内实施检测。由于向载 体一次照射激发光，所以固定生物分子的载体使用尺寸比较小的载体、例如尺寸在IOmm以 下、优选在5mm以下、更优选在3mm以下的载体、最优选在1 5mm的四方载体。固定生物分子的载体材料可使用本领域公知的材料，无特殊限制。例如可举出钼、 钼黑、金、钯、铑、银、汞、钨和它们的化合物等贵金属；石墨、碳纤维为代表的碳等的导电体 材料；单晶硅、非晶硅、碳化硅、氧化硅、氮化硅等为代表的硅材料、SOI (绝缘体上的硅)等 为代表的所述硅材料的复合材料；玻璃、石英玻璃、氧化铝、蓝宝石、陶瓷、镁橄榄石、光敏玻 璃等无机材料；聚乙烯、乙烯、聚丙烯、环状聚烯烃、聚异丁烯、聚对苯二甲酸乙二酯、不饱和 聚酯、含氟树脂、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩醛、丙烯酸树 脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛树脂、脲醛树脂、环氧树脂、密胺 树脂、苯乙烯·丙烯腈共聚物、丙烯腈· 丁二烯苯乙烯共聚物、聚苯醚和聚砜等有机材料等。本发明中，载体优选使用表面具有碳层和化学修饰基团的载体。表面具有碳层和 化学修饰基团的载体包括衬底表面具有碳层和化学修饰基团的载体和包括碳层的衬底表 面具有化学修饰基团的载体。衬底材料可使用本领域公知的材料，无特殊限制，可使用和上 述载体材料和同样的材料。本发明适合使用具有微细平板状结构的载体。具有微细平板状结构的载体容易制 造，所以优选使用包含硅材料或树脂材料的衬底，特别是更优选包括单晶硅的衬底表面具 有碳层和化学修饰基团的载体。单晶硅包括部分结晶轴的方向发生极小变化的衬底(有时也被称之为镶嵌晶体)、包含原子尺寸水平的混乱(晶格缺陷)的衬底。衬底上形成的碳层无特殊限制，但优选使用合成金刚石、高压合成金刚石、天然金 刚石、软金刚石(例如类金刚石碳)、非晶态碳、碳类物质(例如石墨、富勒烯、碳纳米管)中 的任一个、它们的混合物、或它们层合而成的物质。此外，还可使用碳化铪、碳化铌、碳化硅、 碳化钽、碳化钍、碳化钛、碳化铀、碳化钨、碳化锆、碳化钼、碳化铬、碳化钒等碳化物。此处， 所谓软金刚石是所谓类金刚石碳(DLC =Diamond like Carbon)等作为金刚石和碳的混合体 的不完全金刚石结构体的总称，其混合比例无特殊限制。碳层从化学稳定性优异，能够耐受 其后的化学修饰基团的导入和生物分子的结合反应这一点，以及可借助静电结合和生物分 子结合所以其键具有柔软性这一点来看，是有利的。此外，在和生物分子的结合反应中，非 特异性吸附少，从这一点看也是有利的。如前所述，衬底自身也可使用包括碳层的载体。本发明中，碳层的形成可采用公知的方法进行。例如可举出微波等离子体CVD (化 学气相沉积)法、ECRCVD(电子回旋共振化学气象沉积)法、ICP(电感耦合等离子体)法、直 流溅射法、ECR(电子回旋共振)溅射法、离子化蒸镀法、电弧式蒸镀法、激光蒸镀法、EB (电 子束)蒸镀法、电阻加热蒸镀法等。高频等离子CVD法利用因高频而在电极间产生的辉光放电来分解原料气体(甲 烷)，在衬底上合成DLC(类金刚石碳)层。离子化蒸镀法利用钨丝生成的热电子分解并离 子化原料气体(苯)，根据偏压在衬底上形成碳层。也可在1 99体积％的氢气和其余为 99 1体积％的甲烷气体构成的混合气体中采用离子化蒸镀法形成DLC层。电弧式蒸镀法通过在固体石墨材料(阴极蒸发源)和真空容器(阳极)之间施加 直流电压在真空中引发电弧放电，以从阴极产生碳原子的等离子体，对衬底施加比蒸发源 更负的偏压，可使等离子体中的碳离子向衬底加速，形成碳层。激光蒸镀法通过向石墨靶板照射例如Nd: YAG激光(脉冲震荡)使之熔融，在玻璃 衬底上堆积碳原子，可形成碳层。在衬底的表面形成碳层的情况下，碳层的厚度通常是单分子层 100 μ m左右，过 薄则底层衬底的表面有可能局部露出，相反如果过厚将导致生产性变差，所以优选2nm Iym,更优选 5nm 500nmo通过向形成有碳层的衬底的表面导入化学修饰基团，可将生物分子牢固地固定在 载体上。导入的化学修饰基团本领域技术人员可适当选择，无特殊限制，但例如可举出氨 基、羧基、环氧基、甲酰基、羟基、金属螯合物和活性酯基。氨基的导入例如可通过将碳层置于氨气中照射紫外线或通过进行等离子体处理 来实施。或者，可通过将碳层置于氯气中照射紫外线以进行氯化，再在氨气中照射紫外线来 实施。或者，也可通过在亚甲二胺、乙二胺等多元胺类气体中使之和氯化了的碳层反应来实 施。羧基的导入例如可通过使如前所述氨基化的碳层与适当的化合物反应来实施。为 导入羧基而使用的化合物可举出式A-Ri-COOiK式中、X表示卤原子、R1表示碳数10 12 的2价的烃基。)表示的卤代羧酸、例如氯代醋酸、氟代醋酸、溴代醋酸、碘代醋酸、2-氯丙 酸、3-氯丙酸、3-氯丙烯酸、4-氯苯甲酸；式H00C-R2-C00H(式中、R2表示单键或碳数1 12的2价的烃基。)表示的二羧酸、例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸； 聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、偏苯三酸、丁烷四羧酸等的多元羧酸；式R3-CO-R4-COOH(式中、10R3表示氢原子或碳数1 12的2价的烃基，R4表示碳数1 12的2价的烃基。)所示的 酮酸或醛酸；式=X-OC-R5-COOH(式中、X表示卤原子，R5表示单键或碳数1 12的2价的 烃基。)所示的二羧酸的单酰卤、例如琥珀酸单酰氯、丙二酸单酰氯；邻苯二甲酸酐、琥珀酸 酐、草酸酐、马来酸酐、丁烷四羧酸酐等酸酐。环氧基的导入例如可通过使如上所述氨基化的碳层与适当的多元环氧化合物反 应来实施。或者，可通过使碳层含有的碳碳双键和有机过酸反应来得到。有机过酸可举出 过氧乙酸、过氧苯甲酸、二过氧化苯二甲酸、过氧甲酸、三氟过氧乙酸等。甲酰基的导入例如可通过使如前所述氨基化的碳层和戊二醛反应来实施。羟基的导入例如可通过使如前所述氯化的碳层和水反应来实施。活性酯基是指在酯基的醇一侧具有酸度高的吸电子基以活化亲核反应的酯组、即 反应活性高的酯基。其在酯基的醇一侧具有吸电子基，是与烷基酯相比被进一步活化的酯 基。活性酯基对氨基、巯基、羟基等基团具有反应性。更具体而言，苯酚酯类、硫酚酯类、N-羟 基胺酯类、氰基甲基酯、杂环羟基化合物的酯类等是已知具有比烷基酯等远高的活性的活 性酯基。更具体而言，活性酯基例如可举出对硝基苯基、N-羟基琥珀酰亚氨基、琥珀酰亚氨 基、邻苯二甲酰亚氨基、5-降冰片烯-2，3_二羧基酰亚氨基等，特别优选使用N-羟基琥珀酰 亚氨基。活性酯基的导入例如可通过采用氰胺或碳二亚胺(例如、1-[3_( 二甲基氨基)丙 基]-3-乙基碳二亚胺)等脱水缩合剂和N-羟基琥珀酰亚胺等化合物对如前所述导入的羧 基进行活性酯化来实施。通过该处理可介由酰胺键在烃基的末端形成结合有N-羟基琥珀 酰亚氨基等活性酯基的基团(特开2001-139532)。在将DNA和RNA等核酸固定的情况下，优选导入氨基、环氧基、碳二亚氨基、甲酰基 或活性酯基。在将多肽固定的情况下，优选导入氨基、碳二亚氨基、环氧基、甲酰基、金属螯 合物或活性酯基。使用导入了金属螯合物的载体，可有效且稳定地将聚组氨酸序列等的金 属离子和亲和性的具有标记的多肽固定。本发明的在载体上固定生物分子的方法无特殊限制。例如可通过将生物分子溶解 到缓冲液中配制溶液，在其中浸渍如上所述的载体，由此在载体表面固定生物分子。浸渍通 常在0 98°C、优选4°C 50°C下一般进行1分 M小时、优选10分 1小时。此时，通 过在浸渍一定时间后洗涤载体，可除去没有被固定的生物分子。此外，通过使用被称为点样 器(spotter)的装置，可将多种生物分子固定在载体的表面。在使用点样器的情况下，例如 使用点样器将生物分子溶液点样到载体上后，在加热的烘箱中烘烤一定时间，然后洗涤除 去没有固定的分子。通过使用点样器装置可将其他种类的生物分子固定到载体上的不同位 置上，所以可一次实施多个试验。实施例下面，使用实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术范围不受下述实施例的 限制。实施例1将图1的a和b所示的载体支撑构件插入到装有反应液的中空支架中。结果分别 如图6的a和b所示。图6a中，通过载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的边缘咬 合，定位成载体支撑构件被插入到中空支架的中央部，结果，反应液的液面水平，载体和反应液接触。图6b中，由于载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的边缘没有咬合，所以 载体支撑构件以在中空支架内偏右侧的方式被插入，结果由于表面张力导致反应液的液面 倾斜，产生载体和反应液不接触的部分。实施例2在3mm见方的硅衬底上使用离子化蒸镀法按下述条件进行2层的DLC层的制膜。第1层第2层原料气体CH44. 7547. 5(sscm)H20. 252. 5(sscm)工作压力3. 08. 0(Pa)基板偏压直流电压500500(V)高频输出100-(W)阳极电压5050(V)灯丝电压77(V)电流2222(A) 在得到的表面上具有DLC层的硅衬底上按照下述条件使用氨等离子导入氨基。原料气体NH330(sscm)工作压力8. 0(sscm)基板偏压直流电压500(Pa)高频输出-(W)阳极电压50(V)灯丝电压7(V)电流22(A)在含有140mM琥珀酸酐和0. IM硼酸钠的1_甲基_2_吡咯烷酮溶液中浸渍30分 钟，导入羧基。在含有0. IM磷酸钙缓冲液、0. IM 1-[3-( 二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二 亚胺、20mM N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中浸渍30分钟，进行活化，得到在硅衬底表面上具有 DLC层和作为化学修饰基团的N-羟基琥珀酰亚氨基的载体。将DNA探针用Sol. 6 (东洋钢板制)溶解成10 μ Μ,点样在载体上。在80°C烘烤1 小时，用2XSSC/0.2% SDS洗涤后，用超纯水洗涤，离心干燥，从而将DNA探针固定到载体 上。和上述探针杂交的区域用PCR扩增。标记使用CyDye进行。PCR溶液的组成如下。将 得到的PCR产物30 μ 1溶解到杂交溶液GXSSC/0. 2% SDS溶液)30 μ 1中，配制试样。将 试样50 μ 1加入到图7c所示的中空支架中。在图7a和b所示的载体支撑构件上分别固定 上述得到的固定有DNA探针的载体，分别插入到装有试样的中空支架中。图7a所示的载体 支撑构件具有排液槽，而图7b所示的载体支撑构件不具有排液槽。插入载体支撑构件后， 在55°C反应2分钟，用2 X SSC/0. 2% SDS洗涤1次，用IN醋酸钠/0. 5%吐温20洗涤1次， 用IN MgCl2A). 5%吐温20洗涤1次。使用冷却CXD照相机，介由荧光过滤器(Cy5用、工F ^ > K公司制)检测载体上相互作用了的生物分子的荧光标记。使用Φ 5mm的激光(640nm 波长)对载体表面以50°的角度照射激发光。结果如图8所示。使用具有排液槽的载体支撑构件(图7a)时，液体不能在载体固定部积存，可良好 地进行检测(图8a)。而使用不具有排液槽的载体支撑构件(图7b)时，可观察到一部分的液体积存(图8b)。实施例3以被插入至中空支架的姿势，将载体支撑构件的体积占中空支架的容积的比例为 80%的载体支撑构件(图9a)和50%的载体支撑构件(图9b)分别插入到容纳有反应液的 中空支架中。可知，在图9a的情况下，插入时有气泡生成，而在图9b的情况下，插入时不生 成气泡，反应液和载体的接触良好。本说明书中引用的全部的出版物、专利和专利申请全都作为参考直接引入本说明 书中。符号说明11 中空支架、12 载体支撑构件、13 载体支撑构件的后端部、14 载体、15 中空 支架开口部、21 中空支架轴心、24 载体支撑构件的前端部、31 载体固定部、32 载体固定 部的底面、33 载体固定部的侧面(倾斜面)、34 底面与侧面(倾斜面)所成的角度、41 排液槽。
权利要求
1.单元，所述单元是在使用固定有生物分子的载体检测生物分子的相互作用中使用的 单元，其中，具备一端具有开口部另一端封闭的中空支架和固定有载体的可插入中空支架的载体 支撑构件，所述载体固定有生物分子，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的后端部和中空支架开口 部的边缘咬合，由此中空支架被密封，同时，载体支撑构件和中空支架被定位，在以定位姿势沿包括中空支架轴心的面切开的剖面图中，由中空支架的内侧和固定有 载体的载体支撑构件的外侧所构成的面积在载体支撑构件的自载体固定部至前端部的区 域，在轴心的左右是大致相同的。
2.权利要求1所述的单元，其中，载体支撑构件中的载体固定部是具有底面和侧面的 凹部，载体被配置于凹部的底面。
3.权利要求2所述的单元，其中，载体支撑构件凹部的至少后端部一侧的侧面是倾斜
4.权利要求3所述的单元，其中，倾斜面的表面粗糙度在10μ m以下，倾斜面与底面所 成的角度在75°以下。
5.权利要求2 4任一项所述的单元，其中，在载体支撑构件凹部的自前端部一侧的侧 面至前端部形成有排液槽。
6.权利要求1 5任一项所述的单元，其中，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势 下，在载体支撑构件的自载体固定部至前端部一侧的区域，载体支撑构件的体积占中空支 架容积的比例为60%以上。
7.权利要求1 6任一项所述的单元，其中，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势 下，载体支撑构件的体积占中空支架容积的比例为25 70%。
8.权利要求1 7任一项所述的单元，其中，具有分别固定有载体的多个载体支撑构 件，载体支撑构件的后端部分别被固定于表面材料，具有对应于各个支撑构件的多个中空 支架。
9.使用固定有生物分子的载体检测生物分子的相互作用的方法，包括下述工序将固定有生物分子的载体固定于载体支撑构件，将该载体支撑构件插入到一端具有开 口另一端封闭的容纳有反应液的中空支架中，由此使载体上生物分子与反应液中已被荧光 标记的生物分子进行相互作用的相互作用工序；通过洗涤载体除去没有和载体上固定的生物分子发生相互作用的生物分子的工序；对载体照射激发光，通过检测器检测荧光的检测工序；在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的后端部和中空支架开口 部的边缘咬合，由此中空支架被密封，同时，载体支撑构件和中空支架被定位，在以所述定位姿势沿包括中空支架轴心的面切开的剖面图中，由中空支架的内侧和固 定有载体的载体支撑构件的外侧所构成的面积在载体支撑构件的自载体固定部至前端部 的区域，在轴心的左右是大致相同的。
10.权利要求9所述的方法，其中，载体支撑构件中的载体固定部是具有底面和侧面的 凹部，载体被配置于凹部的底面。
11.权利要求10所述的方法，其中，载体支撑构件凹部的至少后端部一侧的侧面是倾斜面。
12.权利要求11所述的方法，其中，倾斜面的表面粗糙度在IOym以下，倾斜面与底面 所成的角度在75°以下。
13.权利要求10 12任一项所述的方法，其中，在载体支撑构件凹部的自前端部一侧 的侧面至前端部形成排液槽。
14.权利要求9 13任一项所述的方法，其中，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿 势下，在载体支撑构件的自载体固定部至前端部一侧的区域，载体支撑构件的体积占中空 支架容积的比例为60%以上。
15.权利要求9 14任一项所述的方法，其中，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿 势下，载体支撑构件的体积占中空支架容积的比例为25 70%。
16.权利要求9 15任一项所述的方法，其中，具有分别固定有载体的多个载体支撑构 件，载体支撑构件的后端部分别被固定于表面材料，具有对应于各个支撑构件的多个中空 支架。
全文摘要
本发明涉及一种单元，所述单元是用于在使用固定有生物分子的载体检测生物分子的相互作用中使用的单元，其具备一端具有开口部另一端封闭的中空支架和固定有载体的可插入中空支架的载体支撑构件，所述载体固定有生物分子，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的边缘咬合，由此中空支架被密封，同时，载体支撑构件和中空支架被定位，在以定位姿势沿包括中空支架轴心的面切开的剖面图中，由中空支架的内侧和固定有载体的载体支撑构件的外侧所构成的面积在载体支撑构件的自载体固定部至前端部的区域，在轴心的左右是大致相同的。
文档编号G01N37/00GK102047122SQ200980119720
公开日2011年5月4日 申请日期2009年5月26日 优先权日2008年5月29日
发明者丹花通文, 山野博文, 龟井修一 申请人:东洋钢钣株式会社