多元细胞信号转导测定的利记博彩app

专利名称：多元细胞信号转导测定的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及高容量的细胞筛选测定(high-content cellular screeningassay)，更具体
地涉及用于筛选细胞刺激剂并在单细胞或单细胞群中采用报告分子的多元监测的测定。
背景技术：
发现一种新的治疗剂的过程传统上包括以下阶段，在患者或者合适的模型系统 中i)鉴定药物靶标；ii)验证该靶标；iii)筛选影响靶标活性的化合物；iv)测定先导 化合物的毒性；V)测定先导化合物的副作用；和Vi)考查先导化合物的代谢及稳定性。 一旦鉴定并验证潜在的治疗靶标，药物发现的初始阶段需要筛选通常是成数十万种化合 物，来鉴定那些以适当治疗方式调节靶标的药物。这种筛选过程需要开发能够迅速廉价 地测量调节目的靶标因子的化合物的效力的测定技术。这些高通量的筛选测定可采取各 种形式，其包括通常依靠基于比色、荧光、放射性测量或发光的检测的基于细胞的测定 或生化测定，以测量受体激活、RNA浓度、蛋白浓度、酶活性或蛋白质间形成功能复合 体的物理相互作用。药物发现领域面临的始终的挑战是提高速度和效率，依赖这种速度 和效率从化合物筛选库中所测定的数十万种化学化合物里鉴定出潜在的先导化合物，然 后优化成新的药物。在先导化合物优化过程中遇到的一个普遍问题是，最初根据其调节 一种或几种特定靶蛋白活性的能力鉴定出的候选药物，也常常有一种或多种禁忌症。化 合物缺乏特异性从而导致药物除了既定的靶标外还靶向范围广泛的因子和生物过程，这 能够产生有害作用。令人关注的其它领域包括药物毒性和代谢，这些引起毒性反应的化 合物能破坏正常细胞和组织的功能，导致细胞死亡。某些化合物也已被证实调控其自身 代谢，藉此刺激该靶物质分解并从机体排泄，导致药效降低。目前高通量的筛选测定通常集中于测量化合物在调控单一因子或靶标的活性中 的效用，并依赖于二次筛选及后续分析(follow-upanalyse)的延续过程，以便测定化合物 功能的其它特性，例如特异性和毒性。这增加了将化合物开发并优化为具有高治疗指数 (即高效率、高特异性、低毒性)的药物所需的时间及花费。结果，很多因为其对靶标的 活性而原本被选定的化合物，最终因为后续发现的副作用被放弃，导致在先导药物评价 上所做的努力浪费，这最终证明不能令人满意。在药物发现和先导药物优化过程中，需要更快速、更高效、更廉价、特别是信 息丰富的筛选测定，这样的测定同时提供关于各种化合物特性及其对各种细胞途径作用 的信息(即功效、特异性、毒性和药物代谢)。例如，先前采用过的一种方法阐述于US 2005/0164321 (PromegaCorp)中，其阐
述了用酶介导反应的方法，该方法用于在同一孔中的多元发光和不发光测定，以检测样 品中一个或多个部分的量(例如活性)或存在情况，所述部分包括酶促反应的辅因子(例 如ATP)、结合和/或改变分子构象的蛋白质(肽或多肽)(例如修饰或剪切肽或多肽底物 的蛋白质)或被蛋白质结合和/或改变的分子。WO 98/58074(Allelix Biopharma)阐述了用于筛选化学化合物以鉴定受体(包括
G-蛋白质偶联受体)的配体的测定方法和组合物。该发明采用的细胞为其中目标受体通过第二信使系统被偶联到受环核苷酸门控(gate)的离子通道的细胞。受体刺激导致第二 信使系统产生环核苷酸，这导致可测量的离子通过通道流入。该发明还提供了这样的多 元系统，其中用不同的离子内流(ion influx)荧光报告分子装载表达不同受体类型的混合 细胞培养物。EP1439384(Cellomics Inc)提供用于测定细胞中荧光标记报告分子的分布、环境 或活性的方法和分析系统，所述方法和分析系统的目的是筛选大量的特异性影响特定生 物功能的化合物。Bertelsen, M.，(Methods in Enzymology，(2006), 414 348-363)阐述了使用 高容量的成像系统进行炎症信号转导和细胞内蛋白质易位的多元分析。Howell, B.J.等(Methods in Enzymology，(2006)，284-300，2006)阐述
了基于细胞的多元成像测定的开发和实施，所述测定采用荧光显微镜监测细胞增殖、细 胞周期阶段和细胞凋亡。Nickischer, D.等(Methods in Enzymology，(2006), 414, 389-418)阐述了三 种促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)细胞内信号转导途径成像测定的开发和实施，以便 为激酶抑制剂提供MAPK模块选择性概况分析(profiling) MK2-EGFP易位、c_JUN和 ERK活化。Hanson, B.等(J.Biomolecular Screening，(2006)，U, 644-651)阐述了多元细 胞内测定，其通过联合fluo-4钙迁移测定和β内酰胺酶报告系统，使得可以用单细胞系 进行两个G-蛋白偶联受体测定药物筛选。Jonas, J-C.等(Diabetes，(1998)，47, 1266-1273)阐述了细胞内 Ca2+浓度和细 胞外胰岛素从用葡萄糖刺激的分离的胰岛细胞的细胞灌流液中分泌之间的时间和数量关 系，所述胰岛素。在含有葡萄糖的培养基中用钙指示剂fUra-PE3装载培养的胰岛，并将 单个胰岛转移到灌注室中。用荧光显微镜测量[Ca2+]，而用RIA测定灌流液下游收集的 组分中的胰岛素。因此，本文阐述了 [Ca2+]与大群混合(即异质)的细胞群的胰岛素分 泌之间的关系，因此在单细胞水平上，细胞刺激与相关的分析物的产生之间没有特定的 相关性。此外，Jonas等没有阐述细胞相关的分子/分析物的多元测定或测量。Marriott 等(J.Cellular Physiology，1998，177，2，232-240)阐述了鼠腹腔巨隨 细胞内白细胞介素6mRNA表达的诱导和细胞内钙的测量。mRNA和细胞内钙的测量都 是细胞内事件，因为mRNA不被细胞分泌。Veronesi 等(Neurotoxicology，2003，24，463-473)阐述了支气管-气管上皮细 胞的胞内钙和胞外IL-6测量。在该论文中，IL-6与细胞无关，用ELISA进行下游测量。McMillen等(Clinical Care Medicine，1995, 23, (1) 34-40)阐述了用下游放射免 疫分析法进行人单核细胞的胞内钙的测量和胞外IL-6的测量，这种方法的实施不需细胞 洗涤步骤。Dracker 等(Blood，2002，100，(11)，摘要编号 5025)报道了用下游 ELISA 进
行多发性骨髓瘤细胞系的胞内钙和胞外IL-6的测量，其不需细胞洗涤步骤。Kohno等(Diabetes，2003，坠，(4)948-956)披露了在同一细胞群中细胞内钙的 测量和神经肽Y(NPY)的免疫化学染色。在用4%低聚甲醛对死细胞进行细胞固定后检 测 NPY。
Lundgren 等(World Journal of Surgery，1996，20, (7)727-735)阐沭了通过下游 放射免疫分析法测量人甲状旁腺细胞的胞内钙和胞外PTH，其不需细胞洗涤步骤。以上方法都没有给出来自刺激活细胞的即时及多元的高容量信息，其中在来自 单一同质细胞群的细胞中测量胞内及与细胞相关的信号转导因子。因此，以上方法不能 使特定细胞内事件和细胞相关分析物的下游产生相关联。本发明解决了这些限制，并提 供了优于已知方法的很多优点。发明概述本发明提供用于采用成像仪器进行化合物筛选的基于细胞的多元测定方法， 所述测定提供高容量的信息，这些信息涉及检测试剂的生物效能、脱靶效应(off-target effect)和潜在候选药物的细胞毒性。因此，本发明的第一方面提供用于在单个活细胞群 中测量至少一种细胞内事件和细胞相关分析物的方法，其中所述至少一种细胞内事件和 细胞相关分析物是在细胞中运行的协同生化过程的各个组分，所述方法包括以下步骤a)提供含有单个活细胞群的样品；b)让单个细胞群中的至少一个活细胞与引起或怀疑引起至少一个细胞产生细胞 相关分析物的检测试剂接触；c)测量在至少一个细胞中的物理性质的变化，作为至少一种细胞内事件的度量 (measure)；d)洗涤细胞以去除细胞外液体；e)测量细胞相关分析物的存在、含量或活性；和f)将至少一个细胞中的至少一种细胞内事件的变化与细胞相关分析物的存在、 含量或活性相联系。因此，本发明提供综合性的高容量、高通量的基于细胞的测定方法，所述方法 能够产生关于外源性药物对细胞作用的生物活性数据。活细胞通过在时间和空间上调控 的复杂的生物化学途径网络不断响应其环境中的重要信号，以给细胞提供对协调响应必 不可少的综合信息交换。激素、生长因子和神经递质都属于已被广泛研究的信号转导物 质。另外，本发明提供用于测量同一细胞中发生的多个事件的信息丰富的方法，所述方 法能协助生物化学途径分析。这进而有助于阐明与临床病况相关的各种途径，所述临床 病况如癌症、动脉粥样硬化、银屑病、类风湿关节炎、多发性硬化症、哮喘和慢性阻塞 性肺疾病。在本文所述方法中采用的样品将合适地含有单细胞群。按照所述方法，细胞 与检测试剂接触，以刺激细胞引发下游生化过程(或事件)级联。所述过程可导致细胞内 的激素、第二信使、气体、酶、转录因子、反应元件和/或基因表达产物水平改变。此 外，还可能将观察到的细胞刺激后的细胞内事件的变化与因响应所述细胞刺激而可能产 生的细胞相关分析物的形成相关联，所述变化的特征在于一种或多种相应的细胞内效应 分子的水平或数量变化。在一个实施方案中，可将在检测试剂存在下测量的细胞内事件的变化和细胞相 关分析物的存在、含量或活性的变化，与在缺少检测试剂时的至少一种细胞内事件和所 述细胞相关分析物的存在、含量或活性每一种的对照值比较。对照值可方便地以电子形 式存储在数据库中或其它电子格式中。检测试剂可为化学实体，例如药物、食用色素、激素、毒素、烷基化剂、氧化剂或致癌物。或者，检测试剂为物理因子，例如电磁辐射(例如UV、X-射线、微波)、 β —辐射或热。技术人员应理解，去除细胞外液体的洗涤步骤d)可在步骤b)之后但在步骤C) 之前实施。本文所述术语“多元测定”或“多元方法”涉及测量或传达来自同一来源的 两种或多种信使的信息或信号的方法(多元测定的实例由Ugozzoli等阐述(Analytical Biochemistry, 2002，MI，47-53))。本文所用术语“高容量筛选”是药物发现方法，其用活细胞作为分子发现的试 管。它阐述了利用空间或时间解决的方法，以便从单独实验中比从仅含一个单独输出的 一个单一实验中发现更多。其运用细胞生物学与分子工具的组合，通常用自动高分辨率 显微镜和自动化处理(Giuliano等，J Biomol Screen.，1997, 2, 249-259)。本文所述方 法阐述用活细胞的测定方法的用途。本文所述术语"细胞内事件"意欲指与细胞信号传导和信号转导相关的基本的 细胞过程，包括例如受体激活、钙释放、第二信使产生、氧化氮释放、磷酸化、酶激 活、转录因子和响应元件激活及基因表达。因此，在本发明的情况中，将检测物理性质 的变化作为细胞内事件的度量，意欲指检测细胞内效应分子的存在与否或测量其水平或 含量的变化，或测量细胞内酶、第二信使、氧化氮、转录因子、响应元件或一种或几种 基因表达产物活性的变化。优选细胞内事件为离子浓度(例如细胞内钙)增加和/或基 因表达增加。本文所述术语〃细胞过程〃意欲包括活细胞经历的正常过程并包括生物合 成、吸收、运输、调控、受体结合和内化、代谢、细胞生理、生化应答、细胞呼吸作 用、生长和细胞死亡。另外的细胞过程可包括细胞粘附(其中细胞经由细胞粘附分子附 着到另一个细胞或底层基底或基质)、细胞信号转导、形态发生、复制和响应刺激物。本文所述术语〃细胞相关分析物(cell-associated analyte)“意欲指在刺激细胞后 通常由协同的生化过程或途径产生的细胞组分，这种组分随后可由细胞分泌，但在测量 细胞相关分析物的存在、含量或活性时其与细胞在物理上相连(physically associated)。本 发明阐述了经过设计以测量存在于细胞内和细胞外液体中的两种或多种不同分析物的联 合测定或多元测定。例如，细胞内分子可存在于细胞质和细胞核中，而细胞相关分析物 可存在于沐浴细胞直接表面的液体中。在优选实施方案中，将测定设计为测量与细胞紧 密相连的细胞相关分析物，例如与细胞膜结合或存在于细胞直接环境中的细胞相关分析 物，因为这样可以提供对分泌因子或分析物的表达水平及产生水平的时间特性的准确测 量。本发明方法适用于几乎任何类型的细胞。在一个实施方案中，细胞群为正常 (即未经修饰的)细胞，其在来源方面可来自任何公认来源，包括哺乳动物细胞、细菌细 胞、植物细胞、昆虫细胞和酵母细胞。在优选实施方案中，采用真核细胞类型，例如哺 乳动物细胞。实例包括CHO、3T3、Cos-7、HEK-293、Jurkat、HeLa、Sf_9、HUVEC> HMEC> HL-60、U20S、J774、BHK、ECV304 和 THP-1 细胞。备选细胞包括酵母细 胞和昆虫细胞。在另一实施方案中，通过用重组表达载体转染来修饰细胞，所述表达载体包含第一报告基因构建体，所述构建体包含编码第一可检测报告分子的核酸序列，所述核酸 序列与表达控制元件可操作地连接并在其控制之下。在该实施方案中，第一方面的接触 步骤b)合适地在允许报告基因构建体表达的条件下进行。本文所述术语"可操作地连接"表明对包含报告基因构建体的元件的安置使其 功能与其预期目的一致，即对报告基因构建体的安置使转录在启动子中启动并经过编码 报告分子的DNA序列来进行。在再一实施方案中，报告基因构建体可另外编码目的蛋白，例如绿色荧光蛋白 (GFP)、硝基还原酶报告分子(NTR)或催化荧光素产生光的荧光素酶基因。另一种细 菌中常用的报告分子是IacZ基因，其编码半乳糖苷酶蛋白，从而导致细胞表达该基 因，以便当细胞生长在含有底物类似物X-gal的培养基时出现蓝色。如本文所述，报告基因(或报告分子)是在培养中的细胞中连接到另一目的基因 (表达例如荧光素酶)上的基因。选择某些基因作为报告分子，是因为它们赋予表达它 们的生物体的特性易于被鉴定并检测，或者因为这些基因为细胞内事件或分子的选择标 记，并因此可被用于诸如绿色荧光蛋白(GFP)易位测定等技术。用报告基因来确定目的 基因是否被细胞吸收或被表达，或在细胞或细胞群中基因表达是否被激活或改变。为了 将报告基因导入生物体中，将报告基因和目的基因安置在同一核酸构建体中，将该构建 体插入或转染到细胞或细胞群中。例如，对培养的细菌或真核细胞而言，众所周知这种 构建体通常是环状(质粒)DNA形式。在一个实施方案中，通过用第一报告基因构建体转染来修饰的细胞包含编 码荧光蛋白的核酸序列，所述荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)或来源于维多利亚 水母(Aequorea Victoria)的GFP功能类似物。用于所述方法中的优选荧光蛋白包括 EGFP (Cormack, B.P.等，Gene，(1996)，173, 33-38) ； EYFP 和 ECFP (US 6066476， Tsien，R.等)；F64L-GFP (US 6172188，Thastrap, O.等)；BFP, (US 6077707， Tsien, R.等)。其它荧光蛋白包括 NFP (Clontech)和 Renilla GFP (Stratagene)。在另一实施方案中，修饰的细胞包含第一报告基因构建体，所述报告基因构建 体包含编码酶的核酸序列，例如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和硝基还原酶。 在特别优选的实施方案中，报告基因构建体编码硝基还原酶。合适的酶报告分子是能够 在该酶的底物中产生可检测信号(例如荧光信号或发光信号)的报告分子。特别适合的 酶/底物包括荧光素酶/荧光素；β “半乳糖苷酶/DDAO半乳糖；β -半乳糖苷酶/ 荧光素二 - β -D-半乳糖苷；碱性磷酸酶/Attophos ；硝基还原酶/CytoCy5S (如WO 2005/118839 中所述)。用多种酶基因作为报告基因的方法众所周知(见综述Naylor L.H.，Biochemical Pharmacology, (1999)，巡，749-757)。选择报告基因以使在其它细胞蛋白存在下可测
量该基因的产物，并在所选择的调控序列控制下将该报告基因转入细胞，所述调控序列 响应宿主细胞中基因表达的变化。典型的调控序列包括响应激素的那些调控序列和其它 细胞控制因子和信号转导因子。例如，已知结合七种跨膜受体的激动剂能调控包括cAMP 响应元件、NFAT、SRE和APl在内的启动子元件；MAP激酶激活导致SRE调节，从而 导致Fos和Jun转录；DNA损伤导致DNA修复酶和肿瘤抑制基因p53转录激活。可通 过选择适当的调控序列，用报告基因来测定加入的试剂对涉及所选择的研究中的调控序列的细胞过程的作用。用作报告分子的硝基还原酶基因可用众所周知的方法分离，例如用聚合酶链式 反应(PCR)从 cDNA 文库中扩增(Molecular Cloning，ALaboratory Manual (分子克隆，实 验手册)，第二版，Cold Spring HarbourLaboratory Press 1989，第 14.5-14.20 页)。一旦被 分离，可将硝基还原酶基因插入到适用于哺乳动物启动子的载体中(Molecular Cloning， ALaboratory Manual (分子克隆，实验手册)第二版，Cold Spring HarbourLaboratory Press 1989，第16.56-16.57页)，所述启动子与研究中的基因调控序列相连并受其控制。然 后可将含有硝基还原酶报告分子和相关调控序列的载体，通过用众所周知的技术转染 引入到宿主细胞中，所述转染技术例如用DEAE-葡聚糖或磷酸钙(Molecular Cloning, ALaboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989,第 16.30-16.46 页)。其它合适的技术为本领域技术人员所熟知。业已证明以这种方式表达时硝基还原 酶被保留在细胞中(见 Bridgewater 等，Eur.J.Cancer 31a, 2362-70)。可通过本领域技术人员熟知方法通过限制酶切消化、连接、转化和质粒 纯化的标准重组分子生物学技术制备DNA构建体，所述方法在Sambrook，J.等
(1989), Molecular Cloning-Α Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press中阐述。或者，可通过已建立的方法来合成制备构建体，所述方法例如 Beaucage 和 Carathers (Tetrahedron Letters，(1981)，22, 1859-1869)阐述的亚磷酰胺 (phosphoramidite)方法或 Matthes 等(EMBOJ.，(1984), 3, 801-805)阐述的方法。根 据亚磷酰胺方法，例如在自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，纯化、退火、连接并克隆 到合适的载体中。还可通过聚合酶链式反应(PCR)用特异引物制备DNA构建体，例如 其如 US4683202 中或由 Saiki 等(Science，(1988)，239, 487-491)所述。在 PCR 方案
(1990)，AcademicPress, SanDiego, California, U.S.A.中可找到 PCR 方法的综述。在制备DNA构建体的过程中，必须让编码报告分子的基因序列与细胞周期阶段 特异性破坏控制元件在读框架内连接，并任选空间定位控制元件。然后将得到的DNA构 建体置于合适的细胞周期阶段特异性表达控制元件的控制之下。可通过采用对所述分子特异的荧光探针，通过检测及定量测量由细胞发射的荧 光来合适地完成细胞内事件(例如在细胞刺激后激素、第二信使或钙的水平变化)的测 量。可用已知的方法完成细胞内激素、第二信使、转录因子等的测量。可测量的细胞内 事件和相关的效应分子的实例包括j)细胞钙流或钙瞬变测定所述测定采用细胞渗透荧光指示染料分子，例如Fluo-2和Fluo-4，以使探针与 钙离子结合引起的荧光发射增加。参见例如"CellularCalcium，A Practical Approach “， 由 McCormack 和 Cobbold (1991)编辑，IRL Press。
) GFP标记的易位测定这些测定需要表达GFP的核酸构建体，致使可鉴定出在细胞质与细胞膜、早 期内体或细胞核之间发生蛋白质易位。参见例如Hancock等，生物分子筛选学会(The Society for Biomolecular Screening)，第九届年度会议禾口展览(9th Annual Conference and Exhibition), DrugDiscovery at the Cutting Edge(2003), Portland, Oregon),其阐述了用
于监测和定量多种信号转导事件(包括AKT-I激活)的活细胞内GFP标记的蛋白易位测定。jjj)报告基因测定可将报告基因测定用于检测目的基因的表达，所述基因的表达产生对培养的细 胞几乎没有明显的或立刻的作用的细胞蛋白质。本文将报告分子直接标记目的基因以形 成基因融合。这两个基因受同一启动子的控制，并被转录成单个信使RNA分子，进而被 翻译成蛋白质例如酶报告分子。重要的是这些例子中两种蛋白质都能正确折叠成有活性 的构象，其尽管融合但仍与它们的酶底物相互作用。在DNA构建体的形成中，通常包括 编码柔性多肽接头区的DNA区段，致使报告分子与基因产物之间的干扰减至最小。所述 方法实例众所周知，参见例如 Bronstein 等，Chemiluminescent and Bioluminescent Reporter GeneAssays(化学发光和生物发光报告基因测定)，Analytical Biochemistry, (1994)， 219, 169-181。jy)细胞裂解测定本文在细胞裂解液中测定细胞内组分，所述细胞裂解液经常加有使细胞膜离解 的去污剂。所述细胞裂解步骤和测定的实例可在US6900019 (Horton)中找到。测量细胞相关分析物的存在、含量或活性的测定众所周知，其包括免疫细胞化 学、蛋白质结合测定和酶测定。测定的组分通常可包括a)含有或疑似含有将被测定的分析物的细胞样品；b)分析物的未标记的特异性结合配偶体(binding partner)，其被或能够被固定在 固相支持体上；c)分析物的特异性结合配偶体或类似物，其被标记或者不被标记，并能够被标记。在一个实施方案中，所述测定为酶测定。在这种形式中，微孔板的孔中含有 组分a)、b)和c)，组分c)为待测定化合物的酶标记的特异性结合配偶体。通过将适 用于检测酶标记的检检测试剂加入到孔中来启动所述测定的测量。参见例如Berg，J.， Tymoczko J 禾口 Stryer L，Biochemistry，W.H.Freeman and Company，(2002) 0在另一实施方案中，被标记的特异性结合配偶体可包括荧光标记。适用于通过 免疫细胞化学测定法测量分析物的合适的荧光标记物众所周知，其包括例如荧光素、罗 丹明和花菁染料。在另一实施方案中，采用酶联免疫斑点(ELISPOT)测定来测量细胞相关分析 物。参见 Czerkinsky，C.,等，J.Immunol.Methods，(1983)，65(1-2), 109-21)。在该 实施方案中，可用半透明(PVDF)膜测定细胞相关分析物，所述膜起抗体或其它结合试 剂的固相支持体的作用，用酶标记的探针和荧光底物检测细胞相关分析物。在又一实施方案中，可用活细胞ELISA技术进行细胞相关分析物的测量，其中 可能含有待测量的分析物的细胞样品包含在容器中，并用合适的探针和发光体或荧光底 物检测细胞相关分析物。参见例如Granow，R.等，J.Immunological Methods，(1994)， 171， 93-102。细胞相关分析物的性质不是本发明关键，除非所述分析物的存在、活性或数量 可与细胞内事件(其通过细胞内组分或报告基因激活或GFP易位的改变来测定)相关 联。特异性结合配偶体所适用的任何细胞相关分析物原则上可用于本发明中。适用于本发明的典型特异性结合配偶体组合可选自半抗原_抗体、配体-受体、DNA-DNA、 RNA-RNA、DNA-RNA、生物素_链霉亲和素、蛋白质_抗体、肽-抗体和多肽-抗体 相互作用。优选特异性结合测定为蛋白质结合测定，或更具体为免疫细胞化学测定。典 型的分析物包括蛋白质、肽、神经递质、神经营养因子、维生素、肽激素、酶、生长因 子、类固醇激素、前列腺素、整联蛋白、基质组分、粘附素、分化分子簇、细胞因子、 趋化因子、淋巴因子和白三烯等。对某些细胞内组分的测量指示细胞内事件的变化，所述组分包括第二信使、 ADP> ATP> AMP、环 ADP-核糖、细胞钙、cGMP、cAMP、IP3> IP1^ IP4> 丝氨酸-苏 氨酸激酶、PI3-激酶、甘油二酯、AKT-1、核糖体蛋白S6激酶、SMAD-9、磷脂酶C、 磷脂酶CS-1、β淀粉样蛋白前体、ras同源基因家族、成员A.PARAPARA(ARHA)、 与受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸激酶2、热休克蛋白70-kD 1A、(HSPAlA)、鞘氨醇 激酶-I (SPHKl)、SPHK2、Forkhead Box OlA (FOXO-IA)、糖皮质激素受体(GCCR)、 半胱氨酸蛋白酶、AKTl和转录因子。可例如用以下方法分别测量这些细胞内分析物 GFP易位标记物、报告分子-基因测定法、荧光或发光探针、酶介导的测定、蛋白结合 技术、电生理法、光谱法、核磁共振技术、流式细胞术、离子运输、显微镜法和放射测 定。可用光学成像方法进行荧光强度变化的检测和测量，其采用结合电荷耦联装置 (CCD)成像器(例如扫描成像器或区域成像器)的仪器。例如，LEADseeker 多模态 成像统(Multimodality Imaging System) (GEHealthcare)特征在于 CCD 相机，其使得可以 单向(single pass)对高密度微孔板进行定量荧光成像。或者，可用IN Cell 1000分析仪光 学成像系统(Analyzer Optical Imaging System) (GE Healthcare)以〃活细胞〃形式对细胞成 像。在这种方式中，应该将合适的细胞标记物引入到细胞中，所述细胞标记物例如细胞 质、细胞核或细胞膜荧光标记物，其具有与目的化合物的荧光发射波长不同且可区别的 荧光发射波长。根据本发明，可联合各种方法，使得能在用检测试剂处理的单细胞或单一同质 细胞群中并行监测细胞内和细胞外的细胞相关事件。因此，本发明提供了一种有利的方 法，其用于直接测定推定药物或试剂对单细胞或单细胞群的作用效果，由此减少开发和 优化高疗效的化合物所需的时间和花费。发明简述为清晰起见，本发明某些实施方案将通过参考以下附图举例阐述，其中

图1显示来自实施例1的联合测定结果。通过结合钙敏感的细胞渗透性染料 Fluo-4,来检测钙离子载体A23187刺激的来源于单个群体的U20S细胞引起的细胞质中 胞内钙的增加。用IN Cell 1000分析仪光学成像系统测量荧光发射(入发射=535nm)，用 IOx物镜、505光通过二色性475/535滤光器装置及200毫秒曝光来成像。图2为免疫细胞化学分析图像，其显示根据实施例4来源于单个群体的A23187 刺激的U20S细胞的细胞相关分泌性人IL-6。在IN CelllOOO分析仪上测量荧光。图3显示来自U20S细胞的钙离子载体刺激的IL-6的产生，这表明根据实施例 3细胞相关的IL-6从培养中的A23187刺激的单U20S细胞群分泌。让细胞与检测试剂 (钙离子载体A23187)接触4小时，在用检测试剂刺激细胞后测量细胞相关IL-6。刺激后滗出细胞上清液，在与抗IL-6抗体孵育前，用PBS彻底洗涤细胞3次。在添加化学 发光底物前，用PBS彻底洗涤细胞3次。在获得IL-6结果之前用相同的细胞群获得钙 瞬变结果。与图1所示结果联合获得数据。用LEADseeker多模态成像系统曝光20秒获 得结果(图3)，其使用化学发光底物和发光信号报告分子(用辣根过氧化物酶标记的抗 IL-6)。图4显示实施例2的联合测定的结果。通过结合钙敏感的细胞渗透性染料 Fluo-4,来检测用组氨酸刺激的来源于单个群体的U20S细胞引起的细胞质中胞内钙的增 加。用IN Cell 1000分析仪测量荧光发射(λ S|i= 535nm)，用IOx物镜、505光通过二 色性475/535滤光器装置及200毫秒曝光来成像。图5显示根据实施例3来源于单个群体的人U20S细胞产生组氨酸刺激的IL-6。 让细胞与组氨酸检测试剂过夜接触，在刺激细胞后测量细胞相关IL-6。用LEADseeker多 模态成像系统曝光20秒获得结果，其使用化学发光底物和发光信号报告分子(用辣根过 氧化物酶标记的抗IL-6)。图6显示已知量的重组IL-6的标定曲线，其用已知量的重组IL-6(0.48_1500pg/ ml)用实施例3的化学发光测定(R&D Systems,目录代码Q6000B)来制作。在 LEADseeker多模态成像系统中测量结果。图7显示来自钙离子载体A23187刺激的培养中生长的人U20S细胞的钙瞬变， 其联合实施例4的IL-6测量数据获得。在IN Cell 1000分析仪上实施图像分析，用IOx 物镜、505光通过二色性475/535滤光器装置及200毫秒曝光来成像。荧光测量显示与无 刺激的对照(0离子载体)相比，细胞内钙增加。图8显示来自A23187刺激的U20S细胞的细胞内钙和细胞相关IL_6之间的关 系，细胞内钙和细胞相关分子二者都显示随着离子载体A23187浓度的增加而剂量依赖性 增加。细胞来源于单个群体。用INCell 1000分析仪按照实施例4获得结果。图9显示来自A23187刺激的来源于单个群体的U20S细胞的细胞内钙和细胞相 关IL-6之间的关系。数据显示当细胞仅与检测试剂接触时细胞内钙和细胞相关IL-6增 加。无刺激(对照)的细胞显示在细胞内钙和细胞相关IL-6之间没有相关性。用INCell 1000分析仪按照实施例4获得结果。图10显示来自A23187刺激的来源于单个群体的人U20S细胞的细胞内钙和细胞 相关IL-6之间的良好的相关性(相关系数> 0.99)。用IN Cell 1000分析仪按照实施例4
获得结果。图11显示来自EGFP易位和PDGF测量(细胞相关分子)的联合测定的 EGFP-NFATIc 易位。图12显示从EGFP-NFATlc转染的U20S细胞释放的洛诺霉素(ionomycin)刺激 的PDGF，其与EGFP-NFATlc易位联合。图13显示细胞内NFATlc易位和细胞相关PDGF之间的相关性，所述细胞相关 PDGF来自洛诺霉素刺激的EGFP-NFATlc转染的来源于单个群体的U20S细胞。图14显示在用洛诺霉素+PMA刺激转染的细胞时的EGFP-NFATlc易位，其用
成像系统测量。图15显示与EGFP-NFATlc易位联合获得的从EGFP-NFATlc转染的U20S细胞中释放洛诺霉素+PMA刺激的TNF α。图16显示细胞内NFATlc易位和细胞相关人TNF α的相关性，所述细胞相关人 TNF α来自洛诺霉素+PMA刺激的EGFP-NFATlc转染的U20S细胞。发明详述
实施例1.在离子载体A23187刺激的U20S细胞中测量钙瞬变1.1 材料钙流缓冲液(calciumflux buffer) (5mM KCl，含有 ImM MgS04、IOOmM HEPES> IOmM D-葡萄糖、145mM NaCl 和 ImM CaC12，pH7.4)。Fluo-4 (InVitrogen)Hoescht 33342 (InVitrogen)7.5% 白蛋白(Sigma)钙离子载体A23187 (Sigma)U20S 细胞(欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of CellCultures)， Porton Down, UK)1.2方法和结果i)以6000个细胞/孔将U20S细胞接种到96孔Greiner聚簇板(cluster plate)， 于100 μ 1完全McKoys培养基中，并在37°C、5% CO2中孵育过夜。ii)用42.8ml钙流缓冲液与6.65ml的7.5%白蛋白制备加样缓冲液。将该缓冲液 保存在37 °C。iii)用118.16ml钙流缓冲液和1840ul的7.5%白蛋白制备120ml维持缓冲液。iv)将5mg钙离子载体A23187溶解在Iml的DMSO中。随后用完全维持缓冲 液稀释离子载体，以获得在1.56-100 μ M范围内的离子载体终浓度。通过将456μ1的 DMSO加到50 μ g小瓶中来制备Fluo-4染料，充分混合小瓶以提供100 μ M浓度的Fluo_4 储液。将100 μ 1的100 μ M Fluo-4染料和6 μ 1的16mM Hoescht细胞核染料加到9.894ml 加样缓冲液中。从细胞培养板中去除培养基，加入100 μ 1/孔的经温热的完全加样缓冲 液。让板在37°C、5% CO2中孵育40分钟。孵育后去除加样缓冲液，加入150 μ 1/孔 的维持缓冲液。将板转移到IN Cell 1000分析仪(Kinetic Module)上，使用IOx物镜、 505光通过二色性475/535滤光器装置(Fluo_4)、200毫秒曝光、360/460滤光器装置 (Hoescht)、300毫秒曝光。在以下时间后每五秒获取一次图像0秒、5-60秒。20秒 后分配(dispense)离子载体，继续采集图像。用目标强度算法(object intensity algorithm) (INCell Investigator 软件)分析结果。ν)图1显示来自用钙离子载体Α23187 (1.56-100 μ Μ)刺激在培养中生长的U20S 细胞后细胞内钙浓度的联合测定的结果。图3显示细胞相关IL-6的增加。数据显示用 钙离子载体刺激时细胞响应为细胞质胞内钙增加，其如由细胞渗透性染料Fluo-4U = 535nm)发射的荧光的增加所显示。图1显示细胞内钙经八分钟增加，表明细胞内钙水平 峰值和下降的时间变化。细胞内事件的变化也取决于测定中采用的钙离子载体的剂量。2.组氨酸刺激的U20S细胞中钙瞬变的测量
2.1 材料钙流缓冲液(5mMKCl，含有lmMMgS04、IOOmM HEPES> IOmMD-葡萄糖、 145mM NaCl 和 ImM CaCl2, pH 7.4)。Fluo-4 丐荧光(calcium fluor) (InVitrogen)Hoesch 33342 DNA 染色液(InVitrogen)7.5% 白蛋白(Sigma)组氨酸(Sigma)U20S细胞(欧洲细胞培养物保藏中心，Porton Down, UK)2.2方法和结果i)以6000个细胞/孔将U20S细胞接种到96孔Greiner聚簇板，于100 μ 1完全 McKoys培养基中，并在37°C、5% CO2中孵育过夜。ii)用42.8ml钙流缓冲液与6.65ml的7.5%白蛋白制备加样缓冲液。将该缓冲液 保存在37 °C。iii)用118.16ml钙流缓冲液和1840 μ 1的7.5%白蛋白制备120ml维持缓冲液。iv)称取25.3mg组氨酸，并将其溶解在Iml经温热的维持缓冲液中。随后用 完全维持缓冲液稀释组氨酸，以获得在1.56-100 μ M范围内的组氨酸终浓度。通过将 456 μ 1的DMSO加到50 μ g小瓶中来制备Fluo_4染料，充分混合小瓶以提供100 μ M浓 度的Fluo-4储液。将100 μ 1的100 μ M Fluo_4染料和6 μ 1的16mM Hoescht细胞核染料 加到9.894ml加样缓冲液中。从细胞培养板中去除培养基，加入100 μ 1/孔的经温热的完 全加样缓冲液。让板在37°C、5% CO2中孵育40分钟。孵育后去除加样缓冲液，加入 150 μ 1/孔的维持缓冲液。将板转移到IN Cell 1000分析仪(Kinetic Module)上，使用IOx 物镜、505光通过二色性475/535滤光器装置(Fluo-4) 200毫秒曝光、360/460滤光器装置 (Hoescht)，300毫秒曝光。在以下时间后每五秒获取一次图像0秒、5-60秒。20秒 后分配组氨酸，继续采集图像。用目标强度算法(IN Cell Investigator软件)分析结果。ν)图4显示来自用组氨酸(1.56-100μΜ)刺激在培养中生长的U20S细胞后细胞 内钙浓度联合测定的结果。图5显示细胞相关IL-6的增加。数据显示用组氨酸检测试剂 刺激时细胞群响应为细胞质胞内钙增加，其如由细胞渗透性染料Fluo-4 (λ S|i= 535nm) 发射的荧光的增加所显示。图4显示细胞内钙经八分钟升高，亦表明细胞内钙水平峰值 和下降的时间变化。细胞内事件的变化也取决于测定中采用的组氨酸检测试剂的剂量。3.在测量钙瞬变后对来自组氨酸或钙离子载体A23187刺激的U20S细胞的人白 细胞介素_6的联合测定3.1 材料抗人IL-6 抗体(R&D SYSTEM, SQ6000B)发光底物(R&DSYSTEM，SQ6000B)钙离子载体A23187 (Sigma)组氨酸(Sigma)U20S细胞(欧洲细胞培养物保藏中心，Porton Down，UK)3.2方法和结果i)以6000个细胞/孔将U20S细胞接种到96孔Greiner聚簇板，于100 μ 1完全McKoys培养基中，并在37°C、5% CO2中孵育过夜。 )用A23187或组氨酸刺激细胞(参见以上实施例1和2)，并测量钙瞬变(见图 1和4)。用离子载体或组氨酸刺激后，滗出细胞上清液，用PBS彻底洗涤细胞3次，然 后与抗IL-6抗体孵育。在加入化学发光底物之前，用PBS洗涤细胞3次。在获得IL-6 结果之前用同一单细胞群获得钙瞬变的结果。iii)联合图1和4所示的结果获得IL-6数据。在LEADseeker多模态成像系统中 用化学发光底物和发光信号报告分子(用辣根过氧化物酶标记的抗IL-6)曝光20秒获得 结果(表1和图3为离子载体剌激；图5为组氨酸刺激)。iv)用已知量的重组IL-6作为标准的标定曲线结果如表2和图6所示，其使得可 准确测量细胞相关的IL-6。结果(表2和图6)显示随着IL-6浓度增加化学发光信号增 加。从LEADseeker多模态成像系统中获得这些数据。表1来自培奍中经刺激的U20S的白细朐介素-6样品测量结果
权利要求
1.用于在单个活细胞群中测量至少一种细胞内事件及细胞相关分析物的方法，其中 所述至少一种细胞内事件和所述细胞相关分析物是在所述细胞中运行的协同生物化学过 程的各个组分，所述方法包括以下步骤a)提供含有单个活细胞群的样品；b)让所述单个细胞群中的至少一个活细胞与引起或怀疑引起所述至少一个细胞产生 细胞相关分析物的检测试剂接触；c)在所述至少一个细胞中测量物理性质的变化，作为至少一种细胞内事件的度量；d)洗涤所述细胞以去除细胞外液体；e)测量所述细胞相关分析物的存在、含量或活性；和f)将所述至少一个细胞中的所述至少一种细胞内事件的变化与所述细胞相关分析物 的存在、含量或活性相联系。
2.权利要求1的方法，其中在步骤a)中所述细胞群体的每一个细胞包含第一报告基 因构建体，所述报告基因构建体包含编码第一可检测报告分子的核酸序列，所述核酸序 列与表达控制元件可操作地连接并在其控制下；其中所述接触步骤b)在允许所述第一报 告基因构建体表达的条件下进行。
3.权利要求2的方法，其中所述第一报基因构建体包含编码荧光蛋白的核酸序列。
4.权利要求3的方法，其中所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)或GFP功能类似物。
5.权利要求2的方法，其中所述第一报告基因构建体包含编码酶的核酸序列。
6.权利要求5的方法，其中所述酶选自荧光素酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和硝 基还原酶。
7.权利要求1的方法，其中所述细胞内事件为离子浓度增加和/或基因表达增加。
8.权利要求1的方法，其中在步骤C)中通过细胞发出的荧光变化来测量所述至少一 种细胞内事件。
9.权利要求1的方法，其中在步骤C)中通过光学成像方法来测量所述至少一种细胞 内事件。
10.权利要求1的方法，其中通过免疫化学方法测量所述细胞相关分析物的存在、含量或活性。
11.权利要求1的方法，其中通过光学成像方法来测量所述细胞相关分析物的存在、 含量或活性。
12.权利要求1-12中任一项的细胞，其中所述细胞群由真核细胞组成。
13.权利要求12的细胞，其中所述细胞选自哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述检测试剂为选自以下的化学实体药 品、食用色素、激素、毒素、烷化试剂、氧化剂和致癌物质。
15.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述检测试剂为选自以下的物理因子电 磁辐射(例如UV、X-射线、微波)、β-辐射和热。
16.权利要求1的方法，所述方法进一步包括a)在所述检测试剂存在下实施权利要求1-15中任一项的方法；和b)将所述至少一种细胞内事件的变化及所述细胞相关分析物的存在、含量或活性的变化，与不存在检测试剂时所述至少一种细胞内事件及所述细胞相关分析物的存在、含 量或活性中的每一种的对照值进行比较。
17.权利要求16的方法，其中所述对照值以电子形式存储在数据库或其它电子格式中。
全文摘要
本发明公开了用于采用成像仪器进行化合物筛选的基于细胞的多元测定的方法。本文所述方法提供关于检测试剂的生物效价、脱靶效应和潜在候选药物的细胞毒性等的高容量的信息。
文档编号G01N33/50GK102016580SQ200980110787
公开日2011年4月13日 申请日期2009年1月15日 优先权日2008年1月18日
发明者J·K·霍尔顿 申请人:通用电气医疗集团英国有限公司