专利名称：：一种链霉亲和素预包被酶标板的制备方法与应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明属于体外免疫检测
技术领域：
，特别涉及一种链霉亲和素预包被酶标板及其制备方法与应用。
背景技术：
：链霉亲和素(streptavidin)是由链霉菌streptomyces分泌的一种碱性糖蛋白，易于与聚苯乙烯塑料微孔板结合。一个链霉亲和素分子能结合4个生物素分子，二者亲和常数(K)为1015L/mol。由于生物素与亲和素有极高的结合力，生物素-亲合素系统(biotin-avidinsystem,BAS)已被广泛应用于酶联免疫检测中。将链霉亲和素固定到固相载体上，利用BAS固定难包被的小分子抗原抗体或核酸的方法已得到广泛应用。链霉亲和素预包被酶标板在酶联免疫、PCR-ELISA等领域均有应用。BAS固定作用的广泛应用取决于链霉亲和素固相包被的良好效果。目前报道的链霉亲和素包被为通过常规的湿法包被方法实现。湿法包被方法通过调节链霉亲和素的浓度和包被缓冲液优化包被效果，其过程繁琐，所需时间长，孔间差、批间差较大，稳定性差，生物素结合力低，包被的链霉亲和素固定不稳定，洗板过程易洗去。而且，湿法包被方法对酶标板的吸附力要求高，包被结束后要甩掉大部分包被液，链霉亲和素的利用率低，成本高。干法包被方法由于会影响抗原抗体等的活性和空间结构，因此在酶联免疫包被中应用很少。至今为止，尚未有干法包被方法制备的链霉亲和素预包被酶标板的报道。
发明内容本发明的首要目的在于克服目前常规的湿法包被制备链霉亲和素预包被酶标板的不足之处，提供一种链霉亲和素预包被酶标板的制备方法。本发明的另一目的在于提供由所述制备方法制备的链霉亲和素预包被酶标板。本发明的再一目的在于提供所述链霉亲和素预包被酶标板的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种链霉亲和素预包被酶标板的制备方法，包括以下步骤用pH9.09.8、0.010.07mol/L的碳酸盐缓冲液或pH4.55.5、(U0.2mo1/L的柠檬酸磷酸盐缓冲液溶解链霉亲和素，链霉亲和素的浓度为1.06.0yg/ml，得到包被缓冲液；将包被缓冲液加入空白酶标板中，每孔100250iU;之后置于324(TC烘干，得到链霉亲和素预包被酶标板。所述的碳酸盐缓冲液优选为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；所述的柠檬酸盐缓冲液优选为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；所述链霉亲和素预包被酶标板优选在烘干后置于封口袋中于25t:下保存；所述链霉亲和素预包被酶标板中的链霉亲和素结合稳定，与生物素结合力强；所述链霉亲和素预包被酶标板应用于体外免疫检测
技术领域：
，也可用于分子生3物学中核酸检测领域；所述链霉亲和素预包被酶标板的应用，包含以下步骤先用PBST缓冲液清洗所述链霉亲和素预包被酶标板至少5次，每次1分钟，每次清洗后甩掉拍干，除去未结合的链霉亲和素，加入待测物质进行酶联免疫吸附分析即可；所述PBST缓冲液为含有Tween20的PBS缓冲液，其中Tween20浓度为体积百分比0.05%;所述PBS缓冲液优选为pH值为7.4、浓度为O.Olmol/L的PBS缓冲液；本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(1)本发明中链霉亲和素预包被酶标板的制备方法简单，链霉亲和素利用率高，从而降低了链霉亲和素的用量(现有技术的链霉亲和素包被液浓度需要lOi!g/ml，而干法在2iig/ml时可达到相比湿法更优的包被效果)。(2)通过本发明所述的制备方法得到的链霉亲和素预包被酶标板批次稳定，即固相载体-酶标板结合的链霉亲和素的量较为均匀。另外，所述的链霉亲和素预包被酶标板的孔间差、批间差及稳定性均高于湿法包被，更适合长期保存。(3)本发明制备的链霉亲和素预包被酶标板链霉亲和素结合稳定，PBST缓冲液冲洗20次生物素结合量变化不显著，性能优良。链霉亲和素预包被酶标板对于生物素的结合量的测定数据能反映包被的质量，酶标板的生物素结合量越大，说明链霉亲和素预包被酶标板的包被效果越优越。本实验中洁特高亲和力板干法包被的最大生物素结合浓度为10ng/ml(见图1)，即每孔可结合lng生物素(4.1pmo1/孔)。而同样的方法测得的国产预包被板生物素结合量只有0.2ng(0.8pmo1/孔)，显示本实验的包被效果优于国产预包被板。(4)本发明所述的制备方法对空白酶标板的质量要求低，国产板和进口板之间的差异不显著，而湿法包被对空白酶标板的质量要求高，国产板和进口板之间有显著差异(如表4所示)，因此，本发明所述的制备方法成本更低。(5)本发明采用了碳酸盐缓冲液(pH9.6)和柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH5.0)两种pH值相差极大的包被缓冲液，可分别适合后期检测中不同pH值的检测体系，扩大了本发明的适用范围。图1是生物素结合容量测定结果图。具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1空白酶标板为洁特高亲和力酶标板。使用pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液(1.59g碳酸钠和2.93g碳酸氢钠加水稀释至lOOOmL)稀释链霉亲和素至2g/ml，得到包被缓冲液；将包被缓冲液加到空白酶标板中，每孔100iU，之后置于恒温箱中37t:温育过夜至完全干燥，得到链霉亲和素预包被酶标板。干燥的酶标板用封口袋装好于4t:下保存。实施例2空白酶标板为洁特高亲和力酶标板。使用pH5.0、0.15M的柠檬酸磷酸盐缓冲液(1030ml0.1M柠檬酸和970ml0.2MNa2HP04混合得到)稀释链霉亲和素至2g/ml，得到包被缓冲液；将包被缓冲液加到空白酶标板中，每孔100iU，之后置于恒温箱中37t:温育过夜至完全干燥，得到链霉亲和素预包被酶标板。干燥的酶标板用封口袋装好于4t:下保存。实施例3空白酶标板为Nunc酶标板。使用pH5.0、0.15M的柠檬酸磷酸盐缓冲液(1030ml0.1M柠檬酸和970ml0.2MNa2HP04混合得到)稀释链霉亲和素至2g/ml，得到包被缓冲液；将包被缓冲液加到空白酶标板中，每孔100iU，之后置于恒温箱中37t:温育过夜至完全干燥，得到链霉亲和素预包被酶标板。干燥的酶标板用封口袋装好于4t:下保存。实施例4空白酶标板为洁特高亲和力酶标板。使用pH9.0、0.01M的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液稀释链霉亲和素至6iig/ml，得到包被缓冲液；将包被缓冲液加到空白酶标板中，每孔200iU，之后置于恒温箱中4(TC温育过夜至完全干燥，得到链霉亲和素预包被酶标板。干燥的酶标板用封口袋装好于4t:下保存。实施例5空白酶标板为Nunc酶标板。使用pH9.8、0.07M的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液稀释链霉亲和素至1Pg/ml，得到包被缓冲液；将包被缓冲液加到空白酶标板中，每孔250iU，之后置于恒温箱中32t:温育过夜至完全干燥，得到链霉亲和素预包被酶标板。干燥的酶标板用封口袋装好于4t:下保存。实施例6空白酶标板为Nunc酶标板。使用pH4.5、0.2M的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液稀释链霉亲和素至6iig/ml，得到包被缓冲液；将包被缓冲液加到空白酶标板中，每孔250iU，之后置于恒温箱中4(TC温育过夜至完全干燥，得到链霉亲和素预包被酶标板。干燥的酶标板用封口袋装好于4t:下保存。实施例7空白酶标板为洁特高亲和力酶标板。使用pH5.5、0.1M的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液稀释链霉亲和素至1Pg/ml，得到包被缓冲液；将包被缓冲液加到空白酶标板中，每孔150iU，之后置于恒温箱中32t:温育过夜至完全干燥，得到链霉亲和素预包被酶标板。干燥的酶标板用封口袋装好于4t:下保存。对比实施例1采用湿法包被链霉亲和素，使用洁特高亲和力酶标板使用pH5.0、0.15M的柠檬酸磷酸盐缓冲液(1030ml0.1M柠檬酸和970ml0.2MCNNa2HP04混合得到)稀释链霉亲和素至4g/ml，得到包被缓冲液；将包被缓冲液加到空白酶标板中，每孔100iU，之后置于恒温箱中fC包被16h，甩干包被液，在37t:下封板2h，封口袋装好后保存于4t:。对比实施例2操作同对比实施例l，区别仅在于使用的空白酶标板为Nunc酶标板。效果比较将实施例13通过干法制备得到的链霉亲和素预包被酶标板与对比实施例12通过湿法制备得到的链霉亲和素预包被酶标板进行比较表l为各种酶标板的包被效果比较。各种酶标板在使用前用含体积百分比0.05%Tween20的PBST缓冲液(PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH值为7.4)冲洗5次，每次lmin，以洗掉结合不牢固的链霉亲和素，提高生物素结合力。接着，加入生物素标记的HRP100ii1(0.01MPBS1:1000稀释)，测量TMB(4，5-三甲氧基苯甲醛)显色后的OD值。由表中数据可得，这四种方式包被效果无显著差异(P〈0.01)。由于干法包被链霉亲和素用量少，仅为湿法的一半，说明本发明所述的制备方法利用链霉亲和素的效率高。另外，实施例13使用的酶标板不同，说明对于本发明的制备方法，空白酶标板的质量对于最终得到的链霉亲和素预包被酶标板质量影响不大，这有利于成本的降低。表l:四种实施方式包被效果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注A、a是统计学中的符号，上下字母相同，说明差异不显著(0.05)或差异极不显著(O.Ol)，下同。表2为不同包被方法包被的酶标板之间的孔间差、批间差比较。各种酶标板在使用前用含体积百分比0.05%Tween20的PBST缓冲液冲洗5次，每次lmin，以洗掉结合不牢固的链霉亲和素，提高生物素结合力。接着，加入生物素标记的HRP100iU(0.01MPBS1:1000稀释)，测量TMB显色后的OD值。其中洁特板、Nunc板的干法包被符合国家标准(国标CV值〈15%)。表2:两种酶标板包被后比较包被法卞&湿法洁特板Nunc板2.954%9.258%7.375%孔间差7.079%9,122%批间差9.235%14,63%表3为实施例1制备的酶标板的解吸附试验。用洗液PBST(0.05%Tween20)分别洗酶标板5、10和20次，清洗时间为lmin/次，加入生物素标记的HRP100yI(O.OIMPBS1:1000稀释)清洗次数不同的酶标板的生物素结合能力无显著差异(P〈0.01)，说明干法包被链霉亲和素结合牢固。表3:洁特板干法解吸附比较洁特板千法OD平均值0.050.015次1.13220次1,077aA10次0,967A表4为本发明所述的制备方法的空白酶标板分别为进口酶标板和国产酶标板的包被效果，操作条件同实施例l。本发明所述的制备方法对空白酶标板的质量要求低，国产和进口板之间的差异不显著，而湿法包被则有显著差异(如表4所示)，也就是说湿法包被对空白酶标板的要求高，因此，本发明所述的制备方法成本更低。图1为执行实施案例1所得链霉亲和素预包被酶标板，加入不同浓度的生物素溶液，分别为0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0、24.0、32.0ng/ml，37°C结合20min，甩干生物素溶液，加入l:lOOOHRP温育lh后显色，所得0D值如图1。当OD值降至最低处即为酶标板的生物素容量，如图1实施案例1所得酶标板的最大生物素结合浓度为10ng/ml，即每孔可结合lng生物素(4.1pmol/孔)。而同样的方法测得的国产预包被板生物素结合量只有0.2ng(0.8pmo1/孔)，显示本实验的包被效果优于国产预包被板。表4:进口、国产酶标板包被效果比较板名称_千法包被OD值_湿法包被OD值进口Costar板"0.781^0.801进「JNunc板0,6510.792国产板I0.M40.41];j产板20麓0扁凶产板3O,WO0.7S8上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。权利要求一种链霉亲和素预包被酶标板的制备方法，其特征在于包括以下步骤用pH9.0～9.8、0.01～0.07mol/L的碳酸盐缓冲液或pH4.5～5.5、0.1～0.2mol/L的柠檬酸磷酸盐缓冲液溶解链霉亲和素，链霉亲和素的浓度为1.0～6.0μg/ml，得到包被缓冲液；将包被缓冲液加入空白酶标板中，每孔100～250μl；之后置于32～40℃烘干，得到链霉亲和素预包被酶标板。2.根据权利要求1所述链霉亲和素预包被酶标板的制备方法，其特征在于所述的碳酸盐缓冲液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。3.根据权利要求1所述链霉亲和素预包被酶标板的制备方法，其特征在于所述的柠檬酸盐缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。4.根据权利要求1所述链霉亲和素预包被酶标板的制备方法，其特征在于所述链霉亲和素预包被酶标板在烘干后置于封口袋中于25t:下保存。5.—种链霉亲和素预包被酶标板，通过权利要求14任一项所述的制备方法得到。6.权利要求5所述链霉亲和素预包被酶标板的应用，其特征在于所述的链霉亲和素预包被酶标板应用于体外免疫检测
技术领域：
或分子生物学中核酸检测领域。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于先用PBST缓冲液清洗所述链霉亲和素预包被酶标板至少5次，每次1分钟，每次清洗后甩掉拍干，除去未结合的链霉亲和素，加入待测物质进行酶联免疫吸附分析即可；所述PBST缓冲液为含有Tween20的PBS缓冲液，其中Tween20浓度为体积百分比0.05%。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述PBS缓冲液为pH值为7.4、浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液。全文摘要本发明公开了一种链霉亲和素预包被酶标板及其制备方法与应用。本发明用碳酸盐缓冲液或柠檬酸磷酸盐缓冲液溶解链霉亲和素，得到包被缓冲液；将包被缓冲液加入酶标板中后烘干，得到链霉亲和素预包被酶标板。该制备方法简单，链霉亲和素利用率高，从而降低了链霉亲和素的用量。该制备方法对空白酶标板的质量要求不高，而且得到的链霉亲和素预包被酶标板批次稳定，链霉亲和素预包被酶标板的孔间差、批间差及稳定性均高于湿法包被，更适合长期保存。本发明所述的链霉亲和素预包被酶标板成本低，效果好，可应用于体外免疫检测
技术领域：
或者是分子生物学中核酸检测领域。文档编号G01N33/543GK101692087SQ20091019289公开日2010年4月7日申请日期2009年9月30日优先权日2009年9月30日发明者刘宾,吴希阳申请人:暨南大学