专利名称：水泡性口炎病毒快速检测试纸条及其利记博彩app
水泡性口炎病毒快速检测试纸条及其利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测水泡性口炎病毒 抗原的快速^f全测试纸条及其利记博彩app。
背景纟支术
水泡性口炎是由弹状病毒科水泡病毒属的水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis Virus, VSV)引起的人畜共患的重大动物疫病。其包括印第安 纳(Indiana, IN型)和新泽西(New Jersey, NJ型)两个血清型。牛、 猪、马、羊和其它多种野生动物可感染，人感染后出现类似流感和登革热 的症状。临床症状与口蹄疫(FMD)不易区别，该病的存在及流行直接影响 人类及动物健康。水泡性口炎病毒的基因组编码包含N, NS， M, G， L等5 种病毒蛋白，其中，N蛋白是该病毒核衣壳的主要蛋白，为VSV的群特异性 抗原。1950年证实此病为人畜共患病。目前，水泡性口炎病毒最常用的诊 断方法包括病毒分离鉴定、病毒中和试验(VN)、补体结合试验(CF)、液 相阻断ELISA (LP-ELISA)、竟争酶联免疫吸附试验(c-ELISA )、反转录聚 合酶链反应(RT-PCR )等。其中，病毒中和试验(VN )和补体结合试验(CF ) 两种方法因试验复杂、麻烦、耗时、不安全、需在生物安全三级(P3)实 验室内进行，且有时产生非特异性反应，应用受到限制，且其它诊断方法 也各有其一定的局限性而无法用于快速诊断。目前，国内口岸检疫中急需
VS的快速检测方法和试剂。研制快速、便捷、适合于口岸检疫和现场诊断 的检测试纸条，在水泡性口炎的快速诊断、检疫和流行病学调查中具有更重要的应用价值。
发明内容
本发明旨在解决水泡性口炎病毒抗原的快速^f企测问题，而提供一种无 须使用特殊的设备和专门的技术人员，即可直接、快速对水泡性口炎病毒 抗原做出4企测的水泡性口炎病毒快速^^测试纸条。
本发明还提供了该水泡性口炎病毒快速检测试纸条的利记博彩app。 为实现上述目的，本发明提供一种水泡性口炎病毒快速检测试纸条，
该试纸条包括
基板，它是由不透水材料制成的条形板状体；
样品吸收垫，它由多孔纤维制成，该样品吸收垫内吸附有胶体金标记 的水泡性口炎病毒的单克隆抗体；
硝酸纤维膜，其上设有检测线和对照线，其中，^r测线上包被或喷附 有水泡性口炎病毒多克隆抗体，对照线上包被或喷附有蛋白质A;
吸水垫，且
所述吸收垫、硝酸纤维膜及吸水垫沿基板的长度方向依次设置在基板 板面上。
形成基板的不透水材料为聚氯乙烯。 形成样品吸收垫的多孔纤维为玻璃纤维。
本发明还提供了所述水泡性口炎病毒快速检测试纸条的利记博彩app，该方 法包括如下步骤
a、制备水泡性口炎病毒单克隆抗体，其制备过程为(l)水泡性口炎 病毒的纯化，用水泡性口炎病毒(VSV)接种BHK-21细胞长成单层，收获 的细胞培养病毒液反复冻融3次，以8000转/分离心30分钟，取上清液， 超速离心和不连续蔗糖密度梯度离心，收获提纯的病毒条带，用核酸蛋白 分析仪测定蛋白含量为2. 4g/L, -20。C保存备用；(2)用提纯的水泡性口炎抗原加等体积弗氏完全佐剂乳化，和弗氏不完全佐剂乳化，免疫BALB/c小 鼠三次；(3)取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%聚乙二醇
(MW4000 )融合剂下融合，HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA 方法检测分泌抗VSV的阳性孔；(4)用有限稀释法进行细胞克隆，经间接 ELISA篩选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗VSV的特异性单克隆抗体的 杂交瘤细胞；(5)将获得的分泌抗VSV的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞注 射入BALB/c小鼠腹腔制备单抗腹水；(6 )采集单克隆抗体腹水，测定抗体 效价、蛋白含量和亲和力，腹水ELISA效价高达为1: 1024000,用核酸蛋 白分析仪测定纯化腹水IgG的含量为1.97 g/L,亲和力分常数高达5.41
x 107mol/L。用间接ELISA方法鉴定制备的单克隆抗体仅与水泡性口炎病毒 有特异性免疫反应，而与其它相关病毒(如BTV、 AKV、 EHDV、 PPRV等)没 有任何免疫反应。
b、 烧制胶体金，并准备待标记单抗，然后测定胶体金标记抗体的最适 稳定量，具体地说，是由柠檬酸钠还原法烧制直径20nm~ 50nm胶体金颗粒， 取-2(TC保存的纯化好的水泡性口炎病毒的单克隆抗体，将其浓度调整为 lmg/mL, 4。C保存备用；将准备好的待标记单克隆抗体做系列稀释为 g/mL~90jag/mL,分别取lmL,加入每管lmL分装好金胶溶液中，以测定胶 体金标记抗体的最适稳定量。
c、 对抗体进行"交体金标记，接着对胶体金标记抗体进行纯化，具体地 说，是将2mg水泡性口炎病毒的单克隆抗体溶于100mL胶体金溶液中，在 电磁搅拌器搅拌下，緩慢将单克隆抗体溶液加入胶体金溶液中进行标记。 然后在其中加入5。/。的牛血清白蛋白使其终浓度为1%， 4。C静置2 4小时， 弃沉淀物，将胶体金溶液离心处理，弃去上清，将沉淀用含0. 01 ~ 0.06% 叠氮钠，0. 02mol/L pH8. 2 Tris-HCl緩沖液稀释为原体积的10%, 4。C保存 备用。
d、 将纯化的胶体金标记抗体吸附于多孔纤维样品吸收垫上，具体地说，是将Q. 02 mol/LpH8. 6 TBS稀释金标单克隆抗体胶体金溶液浸入玻璃纤维 至液体开始渗出为止而形成金标抗体层，然后将玻璃纤维在室温温度干燥。 即制成了吸附有胶体金标记抗体的玻璃纤维。
e、 在硝酸纤维膜上形成由水泡性口炎多克隆抗体和蛋白质A包被或喷 附的检测线和对照线，具体地说，是在硝酸纤维膜上设定出检测线和对照 线位置，用喷膜机分别在其所在位置喷上2. 5mg/L的水泡性口炎多克隆抗 体和蛋白质A形成检测线和对照线，按2jaL/lcm设置喷膜量，喷膜后在37 。C干燥2小时，再用O.Olmol/L pH7. 2含3%牛血清白蛋白的PBS，在37 。C下封闭45分钟，用0. Olmol/L PH7. 0的PBS漂洗，再将硝酸纤维膜室温 下干燥。
f、 在基板上沿长度方向将样品吸收垫、吸附有胶体金标记单克隆抗体 的玻璃纤维、包被有检测线和对照线的硝酸纤维膜和吸水垫依次设置在基 板板面上，形成检测试纸条，并将其装入塑料外壳的检测卡内。具体地说， 是将硝酸纤维膜贴于不透水基板上，再将浸润有金标记单克隆抗体混合溶 液的多孔纤维材料样品吸收垫和另 一个多孔纤维材料样品吸收垫垫分别贴 于不透水基板上，并使两者位于硝酸纤维膜的两端，在浸润有金标单克隆 抗体混合溶液的多孔纤维材料样品吸收垫上的不与硝酸纤维膜相连的一端 设置一块多孔吸水材料，以形成手柄和吸水垫。
本发明的贡献在于，它有效解决了水泡性口炎病毒抗原的快速检测问 题。实验数据表明，本发明的水泡性口炎病毒抗原快速检测试纸条不仅特 异性强，敏感性高，稳定，操作简便，而且制备方法简单，使用快捷迅速， 可在10分钟之内得出结果，安全简便，不需任何仪器和设备，成本低廉， 所需试剂和样本量少，因此特别适合用于出入境口岸和基层检疫部门水泡 性口炎的现场快速诊断、检测、检疫和流行病学调查。
图1为本发明示意图。
具体实施方式
下列实施例是对本发明的进一步解释和说明，对本发明不构成任何限制。
1、水泡性口炎病毒的单克隆抗体制备过程
(1) BHK-21细胞长成单层后接种水泡性口炎病毒(VSV)，在37。C的 温度反应1小时。加入无血清的基础培养基继续培养，2 3d后细胞病变 (CPE)达75°/。以上时，收获病毒。将收获的病毒液反复冻融3次，以8000 转/分离心30分钟，取上清液。以28000转/分，温度4。C超速离心3小时。 沉淀用1/100原体积的PBS溶解，然后釆用20%、 60% (w/v)不连续蔗糖密 度梯度20000转/分，温度4。C超速离心3小时，收获提纯的病毒条带作为 免疫抗原，用DU800核酸蛋白分析仪测定蛋白含量，-20。C保存备用。
(2 )用提纯的水泡性口炎病毒首次免疫BALB/c鼠后，每隔2周免疫1 次，共免疫3次，注射剂量分别100pg、 100lug和200 ng。首免时加等体 积弗氏完全佐剂乳化，二免和三免时加等体积弗氏不完全佐剂乳化。三免 后第15d,断尾采血分离血清，用间接ELISA检测抗VSV血清抗体效价。于 融合前3d,通过尾静脉注射VSV强化免疫一次，剂量为100jLig。
(3 )用间接ELISA筛选阳性克隆，分别用BHK细胞增殖的EHDV病毒 抗原和BHK细胞建立间接ELISA。首先用DU 800核酸蛋白分析仪测定各种 抗原的蛋白浓度。再用方阵滴定法确定最佳包被抗原浓度，并对包被时间 及温度进行优化。两种ELISA方法分别命名为VSV-ELISA和BHK-ELISA， 这两种ELISA方法用于对杂交瘤细胞培养上清进行筛选，以获得抗 的 单克隆抗体阳性克隆。(4 )杂交瘤细胞注射入BALB/c鼠腹腔制备大量单抗腹水取12周龄
左右BALB /C小鼠，腹腔注射0. 5ml降植烷，7d后腹腔注入5 ~ 10 x 105个
杂交瘤细胞，注射后7 10d可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，2000转/
分离心5分钟，收集上清液，即为单克隆抗体腹水，测定抗体效价，分装
后-8(TC温度冻存备用。
(5 )采集单克隆抗体腹水，测定抗体的特异性、效价、蛋白含量和亲
和力，腹水ELISA效价高达为1: 1024000，用核酸蛋白分析仪测定纯化腹
水IgG的含量为2.13 g/L,亲和力分常数高达8. 57 x l07raol/L。用
VSV-ELISA和BHK-ELISA同时进行特异性检测，制备的单克隆抗体仅与VSV
病毒抗原有特异性免疫反应，而与其它相关病毒(如BTV、 AKV、 EHDV、 PPRV
等)没有任何免疫反应。
(6 )采用硫酸铵沉淀法和柱层析法进行水泡性口炎病毒的单克隆抗体 纯化。
2、水泡性口炎病毒抗原快速检测试纸条制作
(1) 用去离子双蒸水配制1 %的氯化金水溶液，取1 %的氯化金水溶 液lmL，加双蒸水99mL配置成0. 01 %浓度的氯化金水溶液100mL。加热至 沸腾，迅速加入浓度为1%柠檬酸三钠水溶液lmL，继续煮沸，同时观察液 体颜色变化情况，当煮沸约5 ~ 8分钟液体出现透明的酒红色时终止反应。 用电镜测定制备的胶体金颗粒的大小及其形状，测得胶体金颗粒的直径大 约为20nm~ 50nm。待冷却后用0. lmol/LK2C02isL 0. IN HC1调整胶体金的pH 值至8. 2~8. 6, 4'C避光保存。
(2) 胶体金颗粒平均直径的测定用支持膜的镍网(铜网也可)蘸取 金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察，或用醋酸铀复染后观 察。计算100个金颗粒的平均直径，其平均直径达到2Qnm 50nm。
(3 )待标记水泡性口炎病毒单克隆抗体的准备取-2(TC保存的纯化好的水泡性口炎病毒的单克隆抗体，将其预先对0. 005mol/L pH7. ONaCl溶 液中4。C的温度透析过夜，以除去多余的盐离子，于15000转/分离心20分 钟，取上清，去除聚合物，测定蛋白质浓度，并将抗体浓度调整为lmg/mL, 4。C的温度保存备用。
(4)胶体金与标记单克隆抗体最适用量之比的测定将用0. lmol/L ,2或0. 1NHC1调整好pH值(8. 2~8. 6)的胶体金，分装10管，每管lmL; 将准备好的待标记单克隆抗体做系列稀释为5 m g/mL ~ 90 iu g/mL )，分别取 lmL，加入以上分装好金胶溶液的Eppendorf管中，混匀；对照管不加单克 隆抗体，只加lmL稀释液。5分钟后，在上述各管中加入0. lmL 10% (w/v) 的NaCl溶液，充分混匀后静置2小时，观察结杲。对照管(未加单克隆抗 体)和加入单克隆抗体的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝 的聚沉现象，而加入单克隆抗体量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红 色不变。以稳定lmL胶体金溶液红色不变的最低单克隆抗体用量，即为该 标记单克隆抗体的最佳用量。取加入单克隆抗体浓度最低而染色没有发生 变化的管为最适标记量，在此基础上再补加10°/。(V/V)浓度为lmg/mL的单 克隆抗体溶液，即为稳定胶体金所需抗体实际用量。
(5 )胶体金与水泡性口炎病毒单克隆抗体的结合与标记将2mg水泡 性口炎病毒的单克隆抗体溶于lOOmL胶体金溶液中。在电磁搅拌器搅拌下， 緩慢将单克隆抗体溶液加入胶体金溶液中，2mg的抗体大约用IO分钟加完， 加完后继续搅动30分钟，继续加入过滤除菌的5%牛血清白蛋白溶液，使其 终浓度达到1%，再緩慢搅动20分钟后，4。C温度静置2 ~ 4小时，弃沉淀物， 用0. 45 juM滤膜过滤胶体金标记的单抗溶液。
(6 )胶体金标记单克隆抗体的纯化以1500转/分将标记好单克隆抗 体的胶体金溶液进行离心15分钟，弃去凝聚的沉淀留上清。上清移入新的 离心管后15000转/分于4。C温度离心30分钟，弃上清留沉淀。沉淀物溶于含1%牛血清白蛋白和含0. 02。/。NaN3的0. 02mol/L pH8. 2 Tris-HC1緩冲液 中，将沉淀重悬为原体积的1/10， 4X:温度保存备用。
(7) 胶体金标记抗体吸附玻璃纤维用0.02 mol/LpH8. 6 TBS稀释金 标单克隆抗体，充分混勻后，将lcmx5cm大小玻璃纤维滤纸浸入金标单抗 溶液中，至液体开始从玻璃纤维中渗出为止而形成金标抗体层，取出后阴 干，即制成了吸附有胶体金标记抗体的玻璃纤维，裁成5mmx5cm的长条备 用。
(8) 基于硝酸纤维膜上的检测线和控制线的印迹在硝酸纤维膜上设 定出检测线和对照线位置，用喷膜机分别在其所在位置喷上2. 5mg/L的水 泡性口炎多克隆抗体和protein A形成检测线和对照线，按2 |a L/lcm设置 喷膜量，喷膜后在37。C温度干燥2小时，再用0. 01mol/L pH7. 2含3%牛 血清白蛋白的PBS,在37。C温度下封闭45分钟，0. 01mol/L pH7. 0的PBS 漂洗，再将硝酸纤维膜室温下干燥，将硝酸纤维膜贴于不透水材料基板上， 再将浸润有金标混合溶液的多孔纤维材料样品吸收垫和另 一个多孔纤维材 料样品吸收垫分别贴于不透水材料基板上，并使两者位于硝酸纤维膜的两 端，在浸润有金标混合溶液的多孔纤维材料样品吸收垫上且不与硝酸纤维 膜相连的一端设置另一块多孔吸水材料，以形成手柄和吸水垫。
(9 )水泡性口炎病毒抗原快速检测试纸条的组装揭开PVC基板1上 的不干胶后，贴上喷涂有水泡性口炎多克隆抗体"企测线4， T线)和蛋白 质A (对照线5, C线)的硝酸纤维膜3,将制备好的吸附有胶体金标记单 克隆抗体的玻璃纤维与硝酸纤维膜的检测线一端连接并压在硝酸纤维膜3 上后，粘贴在PVC基板1上，在胶体金垫上覆盖未吸附有胶体金的玻璃纤 维作为样品吸收垫2，然后用厚的吸水垫6作手柄，并压在硝酸纤维膜3靠 对照线线5的一端，最后用切割机将试纸条切成5mmx5cm即可(参见图1 )。 检测试纸条装入塑料外壳的检测卡内，检测卡上贴上试纸条名称标签，装入铝箔袋，放入干燥剂，抽气密封，在铝箔袋上贴上产品说明书。
(10)试剂组成和使用方法该水泡性口炎病毒快速检测试纸条包括 检测卡一块、緩冲液一瓶、干燥剂lg、说明书一份、外包装铝箔袋一个。 使用方法撕开外包装，取出检测板。取50jliL~100|uL样品加入孔中， 再滴加入緩沖液3滴，IO分钟后观察结果。阳性结果；险测线4和对照线 5均出现有紫红色条带，说明血清中有水泡性口炎病毒抗原；阴性结果检 测线4无条带出现，而且对照线5出现有紫红色条带，说明血清中无水泡 性口炎病毒抗原；无效结果如果对照线5无色带，则^r测结果无效，标 本应重新检测。
(11 )该水泡性口炎病毒快速检测试纸条对出入境检验检疫相关实验 室提供的30份样品进行检测，结果显示，阴阳性成立，阳性两条带，阴性 一条带，结果与其它经典方法检测结果基本一致。
上述具体实施例的实验数据表明，本发明的水泡性口炎病毒抗原快速 检测试纸条，不仅特异性强，敏感性高，稳定，操作简便，而且制备方法 简单。使用快捷迅速，可在IO分钟之内得出结果，安全简便，不需任何仪 器和设备，成本低廉，所需试剂和样本量少。特别适合用于出入境口岸和 基层检疫部门水泡性口炎的现场快速诊断、检测、检疫和流行病学调查。
权利要求
1、一种水泡性口炎病毒快速检测试纸条，其特征在于，该试纸条包括基板(1)，它是由不透水材料制成的条形板状体；样品吸收垫(2)，它由多孔纤维制成，该样品吸收垫内吸附有胶体金标记的水泡性口炎病毒的单克隆抗体；硝酸纤维膜(3)，其上设有检测线(4)和对照线(5)，其中，检测线(4)上包被或喷附有水泡性口炎病毒多克隆抗体，对照线(5)上包被或喷附有蛋白质A；吸水垫(6)，且所述吸收垫(2)、硝酸纤维膜(4)及吸水垫(6)沿基板(1)的长度方向依次设置在基板(1)板面上。
2、 如权利要求1所述的水泡性口炎病毒快速检测试纸条，其特征在于， 形成基板(1)的不透水材料为聚氯乙烯。
3、 如权利要求1所述的水泡性口炎病毒快速检测试纸条，其特征在于， 形成样品吸收垫(2)的多孔纤维为玻璃纤维。
4、 如权利要求1所述的水泡性口炎病毒快速检测试纸条的利记博彩app， 其特征在于，该方法包括如下步骤a、 制备水泡性口炎病毒单克隆抗体；b、 烧制胶体金，并准备待标记单抗，然后测定胶体金标记抗体的最适 稳定量；c、 对抗体进行胶体金标记，接着对胶体金标记抗体进行纯化；d、 将纯化的胶体金标记抗体吸附于多孔纤维样品吸收垫上；e、 在硝酸纤维膜上形成由水泡性口炎多克隆抗体和蛋白质A包被或喷 附的检测线和对照线；f、 在基板上沿长度方向将样品吸收垫、吸附有胶体金标记单克隆抗体的玻璃纤维、包被有检测线和对照线的硝酸纤维膜和吸水垫依次设置在基 板板面上，形成检测试纸条，并将其装入塑料外壳的检测卡内。
5、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，水泡性口 炎病毒单克隆抗体的制备是将纯化的水泡性口炎病毒免疫BALB/c小鼠三 次，然后取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，并由间接ELISA 方法检测分泌抗VSV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，再由BALB/c小鼠 制备单抗腹水。
6、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，胶体金的 烧制和待标记单抗的准备是由柠檬酸钠还原法烧制直径20nrn 50nm胶体金 颗粒，取-2(TC保存的纯化好的水泡性口炎病毒的单克隆抗体，将其浓度调 整为lmg/mL， 4。C保存备用；将准备好的待标记单克隆抗体做系列稀释为5 jig/mL 90iag/mL,分别取lmL,加入每管lmL分装好金胶溶液中，以测定 胶体金标记抗体的最适稳定量。
7、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，抗体的胶 体金标记是将2mg水泡性口炎病毒的单克隆抗体溶于100mL胶体金溶液， 在电磁搅拌器搅拌下，緩慢将单克隆抗体溶液加入胶体金溶液中进行标记， 然后进行胶体金标记抗体的纯化标记好单克隆抗体的胶体金溶液纯化后， 于含1%牛血清白蛋白和含0. 02。/。NaN3的0. 02mol/L pH8. 2 Tris-HC1緩沖 液中重悬为原体积的1/10， 4tM呆存备用。
8、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(d)中，将0.02 mol/LpH8. 6 TBS稀释金标单克隆抗体吸附于玻璃纤维滤纸上，形成吸附有 胶体金标记抗体的玻璃纤维:。
9、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(e)中，在硝酸纤 维膜上设定出检测线和对照线位置，用喷膜机分别在其所在位置喷上 2. 5mg/L的水泡性口炎多克隆抗体和蛋白质A,形成检测线和对照线。
全文摘要
一种水泡性口炎病毒快速检测试纸条及其利记博彩app，试纸条包括基板(1)、吸附有胶体金标记的水泡性口炎病毒的单克隆抗体的样品吸收垫(2)、设有检测线(4)和对照线(5)的硝酸纤维膜(3)及吸水垫(6)，且所述吸收垫(2)、硝酸纤维膜(3)及吸水垫(6)沿基板(1)的长度方向依次设置在基板(1)板面上。利记博彩app包括a.制备水泡性口炎病毒单克隆抗体；b.烧制胶体金，并准备待标记单抗；c.对抗体进行胶体金标记和纯化；d.将纯化的胶体金标记抗体吸附于多孔纤维样品吸收垫上；e.在硝酸纤维膜上形成由水泡性口炎多克隆抗体和蛋白质A包被或喷附的检测线和对照线；f.将样品吸收垫、硝酸纤维膜和吸水垫依次设置在基板板面上，形成检测试纸条。本发明无须使用特殊的设备和专门的技术人员，即可直接、快速对水泡性口炎病毒抗原做出检测。
文档编号G01N33/569GK101666800SQ20091019043
公开日2010年3月10日 申请日期2009年9月16日 优先权日2009年9月16日
发明者吕建强, 洁 孙, 张彩虹, 曾少灵, 杨云庆, 杨俊兴, 秦智锋, 花群义, 阮周曦, 虹 陶 申请人:花群义