专利名称：一种乳制品中β-内酰胺酶的金标试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测乳制品中(3-内酰胺酶的金标试剂盒及制备方法，属于生物技术领域。
背景技术：
"解抗剂"学名P-内酰胺酶，它是针对P-内酰胺类抗生素提炼出来的一种化学品，是一 种抗生素分解剂，它能有效分解牛奶中残留的抗生素。 一些不法生产厂家用来降解牛乳中残 留的抗生素，生产所谓的"人造无抗奶"，致使抗生素酶解后的残留物进入乳制品，对人体健 康造成伤害，同时也可能造成病菌的耐药性。因此，迫切需要快速的检测方法，从而能快速 准确的检测乳制品中(3-内酰胺酶。
金标法又叫"胶体金法"，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免 疫标记技术，有其独特的优点。免疫金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用 于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等 问题，且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精确。因此己 成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。
关于乳制品中P-内酰胺酶的检测报道较少，本发明利用免疫金标记技术建立了检测(3-内酰胺酶的胶体金试纸条方法，能够真正实现乳品中P-内酰胺酶的一步法快速检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种p-内酰胺酶的胶体金免疫层析试纸条及其制备工艺，能够简易、 快速地检测乳品中非法添加的p-内酰胺酶。
本发明根据抗原抗体特异性结合的免疫学基本原理，将抗(3-内酰胺酶单克隆抗体用胶体 金标记，包被在玻璃纤维膜上作为金标垫，P-内酰胺酶抗原和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤 维素膜(NC膜)上作为检测线和质控线，当被检样品中含有(3-内酰胺酶时，可在检测线上 形成抗原抗体结合物，并在NC膜上呈现紫红色条带，通过肉眼能够简易、快捷地对液态牛 奶、奶粉、固体样品等乳制品中含有的P-内酰胺酶进行检测。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测乳制品中p-内酰胺酶的金标试剂盒的制 备方法，主要涉及以下几方面内容
1、 抗(3-内酰胺酶单克隆抗体的制备
以卩-内酰胺酶作为免疫原，选用8周龄雌性BABL/C小鼠作为免疫动物，免疫剂量300吗/ 只，采取腹腔注射，每次免疫间隔为2周，免疫5次。最后一次不加佐剂，免疫原剂量减半， 3 4天后取小鼠脾细胞与SP-2/o骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细胞。采取有限稀释法筛 选杂交瘤细胞，筛选能够稳定分泌卩-内酰胺酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
2、 胶体金溶液及金标抗体的制备
用新制双蒸水配制lOOmL 0.01%氯金酸溶液，置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸，在100r/min磁力搅拌下，迅速加入预先在37。C保温的1%柠檬酸三钠溶液4.5mL，保持 温度和转速不变，继续搅拌加热15min左右，直至溶液呈现清亮的酒红色，胶体金的大小为 20 30nm。。室温冷却，4'C冰箱保存备用。
取30mL胶体金溶液加于50mL离心管中，用0.1M K2C03或0.1M HC1调节pH至7.0 7.5， 用铝箔纸包住离心管，轻轻振荡；边振荡边逐滴加入3mL含250吗(3-内酰胺酶单克隆抗体溶 液，继续振荡20min左右；逐滴加入1.5mL P/。BSA溶液以饱和游离的胶体金，然后于4'C， 9000rpm，离心45min;离心后取出离心管，将上清液轻轻吸掉一部分后，用移液枪将管底沉 淀小心吸至1.5mL离心管中，4'C保存备用。
3、 金标垫制备
将上述标记好的胶体金用胶体金稀释液(20mM PB， 150mM NaCl， 1%BSA， 0.1% TritonX-lOO， 2% Sucrose, 0.01% Proclin 300) 10倍稀释后浸泡或喷点玻璃纤维，37。C真空干 燥，即制成金标垫。
4、 硝酸纤维素膜的处理
用金标点样仪喷涂两条平行线于硝酸纤维素膜上，NC膜上的检测线为卩-内酰胺酶抗原， 质控线为羊抗鼠IgG，置37'C真空干燥后备用。
5、 胶体金试纸条的组装
取制作试纸条专用的底板，先将干燥好的硝酸纤维素膜粘贴在相应位置，再将吸水纸和 干燥好的金标垫粘贴在相应位置并稍微压住硝酸纤维素膜，最后将样品垫粘好并压住金标垫， 用切条机切割成3mm宽的试纸条装入检测卡中，此时，样品垫的位置正对检测卡的加样孔、 硝酸纤维素膜位置正对检测卡的观测孔，与干燥剂一起装入铝箔袋中，密封包装。
与现有技术相比，本发明具有如下的积极效果
(1) 本发明首次公开了一种检测乳制品中p-内酰胺酶的金标试剂盒及制备方法，可检测 样品中的(3-内酰胺酶。
(2) 反应时间短。该试剂盒只有2歩检测步骤，即加样、反应，均通过渗滤完成，检测 全过程仅需数分钟。
(3) 检测结果不受仪器的影响；不受反应环境的影响。
(4) 操作歩骤简单，而且试剂可在室温长期保存。 具体实施例
本发明的内容可通过以下实施例作进一步详细阐述，但不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
卩-内酰胺酶单克隆抗体的制备
将含lmg/mL的(3-内酰胺酶溶液0.5mL与等体积完全弗氏佐剂混匀，充分乳化，供首次 免疫用，选用8周龄雌性BABL/C小鼠作为免疫动物，免疫剂量300pg/只，采取腹腔注射， 以后每隔2周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量250pg/只，最后一次免疫 采用脾内注射，3 4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在50S 90S内将1mL 50%聚乙二醇(分子量为 1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，lmin后加入20mLDMEM培养液(Dulbecco Modified Eagle Medium),终止融合，水浴静止10 min后离心，去除上清；将融合细胞用含20%小牛 血清的HAT选择性培养基(在培养液中加入次黄嘌岭(hypoxanthine)，氨基碟呤(Aminopterin) 和胸腺嘧啶(thymidine)制成选择培养液，简称HAT培养液)悬浮后，以最后浓度为bio4 饲养细胞/0.1mL接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作词养层的96孔培养板中，于5%002， 37'C条 件下培养，7~8天后，每培养孔更换2/3 HT培养液(在培养液中加入次黄嘌岭(hypoxanthine) 和胸腺嘧啶(thymidine)制成选择培养液，简称HT培养液)。10 20天后，开始对镜检有杂 交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进 行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以(3-内酰胺酶为包被抗原，以 免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照。阳性细胞孔的 判定标准为(A趋-A加)/ (Aw-A站)〉2.1;对分泌阳性抗体的细胞进行克隆。采用有限稀 释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释 为70个/mL再取lmL稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆。直至所有细胞孔的培 养上清均呈阳性为止；对10 13周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3mL/只 0.5mL/只，8 10 天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5><105细胞/只，3 5天后注意观察，收集腹水， 离心去除沉淀，加甘油于-20'C保存。
实施例2
试纸条的生产工艺流程
1、 胶体金溶液及金标抗体的制备
用新制双蒸水配制100mL 0.01%氯金酸溶液，置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至 沸，在100r/min磁力搅拌下，迅速加入预先在37。C保温的1%柠檬酸三钠溶液4.5mL，保持 温度和转速不变，继续搅拌加热15min左右，直至溶液呈现清亮的酒红色，胶体金的大小为 20~30nm。。室温冷却，4'C冰箱保存备用
取30mL胶体金溶液加于50mL离心管中，用0.1M K2C03或0.1M HC1调节pH至7.0-7.5， 用铝箔纸包住离心管，轻轻振荡；边振荡边逐滴加入3mL含25(VgP-内酰胺酶单克隆抗体溶 液，继续振荡20min左右；逐滴加入1.5mLP/t)BSA.溶液以饱和游离的胶体金，然后于4'C， 9000rpm，离心45min;离心后取出离心管，将上清液轻轻吸掉一部分后，用移液枪将管底沉 淀小心吸至1.5mL离心管中，4"C保存备用。
2、 金标垫制备
将上述标记好的抗体用稀释液(20mMPB， 150mMNaCl， 1%BSA， 0.1%TritonX-lOO， 2% Sucrose, 0.01% Proclin 300) 10倍稀释后浸泡或喷点玻璃纤维，37'C真空千燥，即制成金 标垫。
3、 硝酸纤维素膜的处理
用金标点样仪喷涂两条平行线于硝酸纤维素膜上，NC膜上的检测线为p-内酰胺酶抗原， 质控线为羊抗鼠IgG，置37'C真空干燥后备用。
具体实施方式
见图l、图2， 一种快速检测P-内酰胺酶的胶体余检测卡，其包括检测卡壳体1和试纸 条2，试纸条2封装于检测卡壳体1中，检测卡壳体1上丌有加样孔3和观测孔4，试纸条2 包括底板5，试纸条2的底板5上依次粘贴有吸水纸6、硝酸纤维素膜7、金标垫8、样品垫 9，吸水纸6和金标垫8分别粘贴在硝酸纤维素膜7两侧，在硝酸纤维素膜7的两端结合处， 吸水纸6和金标垫8的一小段重叠压在硝酸纤维素膜7上，样品垫9粘贴在金标垫8的另一 顶U，样品垫9的一小段重叠在金标垫8上；余标垫8上喷涂有金标抗P-内酰胺酶单克隆抗体； 硝酸纤维素膜7上依次喷涂有材质为P-内酰胺酶的检测线10、材质为羊抗鼠IgG的质控线11 。
实施例3
卩-内酰胺酶试剂盒的检测方法 1、样品的预处理
取10ml样品，12000rpm离心10分钟。用塑料吸管小心吸取上层液体，准确吸取lml 上清于具塞试管中，加入4ml20mMPBS溶液，盖上盖子，充分混匀。此稀释的样品为待测 样品，可直接用于试验。 2、试剂盒检测
(1) 从铝箔袋中取出测试卡，将其置于干净的水平桌面；
(2) .加入待测样品lOOpl于加样孔内；
(3) 3~15分钟内即可判断结果。
结果判断阳性(+ ):仅质控线出现一条紫红色条带，检测线上无紫红色条带出现，此 时结果为表明P-内酰胺酶含量在50ppm以上；阴性(-)质控线和检测线均出现紫红色条 带。如果结果表明，P-内酰胺酶含量在50ppm以下；无效质控线未出现紫红色条带，表明 操作过程不正确或试剂盒已损坏变质。
本发明的快速检测P-内酰胺酶的胶体金试纸条，其检测快速，检测时间在10min以内， 能够满足现场快速检测的需要，且检测准确率高、特异性强，改变了对卩-内酰胺酶的检测必 须由专业机构的专业人员才能进行检测的局限性，携带方便，操作简便，各个牛奶收购站、 各级检验检疫部门及消费者均可即时进行检验；检测试纸条的制备工艺简单，成本低，且在 常温下即可保存，无需特殊设备和仪器，检测重复性好。
图1为本发明快速检测P-内酰胺酶的胶体金检测卡示意图2为本发明快速检测P-内酰胺酶的胶体金检测卡中所述试纸条的结构示意图； 图3为图2的侧视图。
权利要求
1、一种半定量快速检测β-内酰胺酶的胶体金试纸条及其制备方法，其特征在于它是由底板、样品垫、结合垫、吸水板等组成，其特征在于结合垫中喷有胶体金标记的抗β-内酰胺酶单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的质控线和检测线分别为羊抗鼠IgG和β-内酰胺酶抗原。
2、 根据权利要求1所述的P-内酰胺酶胶体金试纸条的制备方法，其特征在于其中所述的结合垫上金标抗体的制备方法包括下述步骤(1) 胶体金溶液制备用新制双蒸水配制100mL 0.01%氯金酸溶液，置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至 沸，在100r/min磁力搅拌下，迅速加入预先在37。C保温的1%柠檬酸三钠溶液4.5mL，保持 温度和转速不变，继续搅拌加热15min左右，直至溶液呈现清亮的酒红色，胶体金的大小为 20 30nm。。室温冷却，4'C冰箱保存备用。(2) 胶体金标记抗体取30mL胶体金溶液加于50mL离心管中，用0.1M K2C03或0.1M HC1调节pH至7.0~7.5， 用铝箔纸包住离心管，轻轻振荡；边振荡边逐滴加入3mL含25(^g(3-内酰胺酶单克隆抗体溶 液，继续振荡20min左右；逐滴加入1.5mL 1。/。BSA溶液以饱和游离的胶体金，然后于4。C， 9000rpm，离心45min;离心后取出离心管，将上清液轻轻吸掉一部分后，用移液枪将管底沉 淀小心吸至1.5mL离心管中，4。C保存备用。(3) 金标垫制备将上述标记好的抗体用稀释液(20mMPB， 150mMNaCl， 1。/。BSA， 0.1% TritonX-lOO， 2% Sucrose,'0.01% Proclin 300) 10倍稀释后浸泡或喷点玻璃纤维，37'C真空干燥，即制成金 标垫。
3、根据权利要求l所述的P-内酰胺酶胶体金试纸条的制备方法，其特征在于NC膜上的检测 线为(3-内酰胺酶抗原，质控线为羊抗鼠IgG。
全文摘要
本发明提供了一种半定量快速检测β-内酰胺酶的胶体金试纸条及其制备方法。根据抗原抗体特异性结合的免疫学原理，将抗β-内酰胺酶单克隆抗体用胶体金标记，包被在玻璃纤维膜上作为金标垫，β-内酰胺酶抗原和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜(NC膜)上作为检测线和质控线，当被检样品中含有β-内酰胺酶时，可在检测线上形成抗原抗体结合物，并在NC膜上呈现紫红色条带，通过肉眼能够简易、快捷地对液态牛奶、奶粉、固体样品等乳制品中含有的β-内酰胺酶进行检测。
文档编号G01N33/577GK101620230SQ20091018403
公开日2010年1月6日 申请日期2009年8月11日 优先权日2009年8月11日
发明者张建中, 徐祖奇, 蔡建荣, 赵春城, 赵晓联, 马祯婉 申请人:无锡益达生物技术有限公司