一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量pcr分型检测方法

专利名称：：一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量pcr分型检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法，具体地说，本发明涉及应用四重实时荧光定量PCR技术在一个PCR反应管中快速、平行地同时检测四型人乳头瘤病毒(HPV-6，-ll，-16，-18)的方法。
背景技术：
：人乳头瘤病毒(H咖anp即illomavirus，HPV)是一种双链DNA病毒，通过人体接触传播，在多种皮肤黏膜的良、恶性增生和生殖器感染中较为常见，迄今为止，全世界已发现逾120多种HPV基因型，各型HPV与其生物学行为存在着高度相关性，不同基因型的HPV具有不同的致病危险性，一般分为高危型HPV和低危型HPV。高危型HPV感染可以引起女性宫颈及其他生殖器癌变，而宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，全球每年约有50万新增病人，发病率在女性肿瘤中占第二位，但其死亡率则占第一位，95%以上的宫颈癌与人乳头瘤病毒感染有关。低危型HPV感染可导致宫颈上皮细胞轻度病变、产生生殖器疣、皮肤、经常性喉或呼吸道乳头状瘤等。在引起人类生殖器、肛门等部位感染的诸多基因型HPV中，最常见的只有四种基因型别HPV(HPV-6、-11、-16、-18)。一些研究表明，大约70%的宫颈上皮细胞发育不良和宫颈癌是有HPV-16，-18感染引起的，其中HPV-16约占55%，HPV-18约占10-15%，另外，相当一部分的阴道、外阴、肛门、阴茎等部位癌变与HPV-16、-IS持续感染密切相关。在男女外生殖器病变中，90X以上的外生殖器疣是由HPV-6、，-11感染引起的，另外肛门疣也主要是HPV-6，_11感染造成的。在中国，约有90%的生殖器疣肛门疣由HPV-6、-ll型引起，中国妇女宫颈癌组织中HPV感染率大于95%，其中HPV-16、-18型占90%以上。鉴于HPV-6、-11、-16、-18的高感染率及其危害性，预防HPV感染尤其是HPV-6、-11、-16、-18感染可以有效控制宫颈癌和尖锐湿疣等的发生，因此，全球很多公司都在研制HPV疫苗，Merck公司已经研制出了针对HPV-6、-11、-16、_18型的四价疫苗，并在很多国家得以应用，然而，在应用四价疫苗前，必须要了解被接种者是否感染了HPV，尤其是HPV-6、-11、-16、-18，只有在被接种者未感染HPV-6、-11、-16、-18情况下，才可以接种HPV四价疫苗，所以首先必须为接种者检测HPV-6、-11、16、-18，因此，同时快速准确的HPV-6、-ll、16、-18分型检测意义重大。HPV感染的潜伏期长，不易在体外培养，亚临床感染常见，加之血清学试验又不能区别近期和远期感染，因此，对HPV感染的分型诊断，目前主要依赖分子生物学手段对病毒DNA进行检测。目前常用的方法有PCR、基因芯片技术、DNA测序和第二代杂交捕获法，其中杂交信号放大法的杂交捕获II代(HC-II)和靶DNA扩增法的PCR方法是目前应用最多的HPV-DNA检测方法。但是，这些方法大多对操作人员要求高，试剂昂贵，同时所需临床标本量大，需对临床标本多次扩增及多次分离分析，技术复杂，无法在临床检测中快速高通量地检出患者感染的HPV病毒类型及病毒载量。目前第二代杂交捕获法(HC-II)是惟一通过FDA批准的可在临床使用的一种检测HPV-DNA的技术，但仍然存在不能分型和定量的缺点。在PCR基础上发展起来的多重实时荧光PCR技术同时检测多种或型病毒也有应用。但是，目前报道的荧光定量PCR检测HPV要么通量低，要么技术复杂、试剂昂贵、要么未实现四型HPV单管同时定量检测，难以满足临床上同时检测多个亚型的需要。但是，由于荧光定量PCR方法由于成本低、方便快速、操作简单、可以定量等诸多优点，该方法值得优化提高从而能够在临床上广泛应用。荧光定量PCR技术发展日新月异，美国AlleLogicBiosciences公司推出了最新一代荧光定量探针-AllGlo探针，它拥有普通TaqMan、TaqMan-MGB及MolecularBeacon探针所有优点。本研究通过检测AllGlo特异性探针的荧光增量得知检测结果，能在一个PCR反应中同时检测四型HPV，灵敏度、特异性和重复性都达到了95%。与HC-II方法相比，多重实时荧光PCR方法具有一下优势灵敏度高，线性范围广，本研究所建立的多重实时荧光PCR方法灵敏度可以达到10Copies/Test，最高可达109Copies/Test。本项研究采用AllGlo探针技术，设计了四对特异引物和相应的探针，应用四重荧光定量PCR技术同时检测四型HPV，并对该技术反应条件进行了优化，建立了一种基于AllGlo探针技术的单管四重荧光定量PCR同时检测四型HPV的方法，适合于尖锐湿疣的快速早期预防和诊治，以及宫颈癌危险因素的评估，为生殖系统常见HPV感染的病程监测和疗效判断提供指导，应用前景广阔。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法。人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法包括如下步骤(1)引物设计在基因库中检索获得四型人乳头瘤病毒，即HPV-6、-ll、-16、-18特异性的保守基因，通过网上序列比对，确定HPV-6、-ll、-16、-18亚型的高度保守序列区，作为待检靶基因特异性核酸序列设计特异引物；(2)荧光探针设计根据步骤(1)中的四型HPV的待检靶基因特异性核酸序列设计荧光探针；(3)标准分子的构建根据步骤(1)确定的特异引物，利用基因克隆技术构建四种分别含有HPV-6、-11、-16、-18高度保守序列区的标准质粒分子；(4)四重荧光PCR反应液组成使用步骤(1)中的引物和步骤(2)中的探针及2XqPCRMix定量PCR试剂组成四重荧光PCR反应液；(5)四重荧光PCR反应的优化和建立通过100-400nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，组成不同的四重荧光定量PCR反应体系，根据反应效率和曲线确定最终的PCR反应体系；(6)标准曲线制备使用步骤(5)中的四重荧光PCR反应体系，将已知拷贝数的含有四型HPV目的扩增片段的重组质粒连续IO倍倍比稀释，加入到荧光定量PCR主反应液中，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline)，进行结果分析，制备标准曲线；(7)临床标本检测用已知HPV基因型别和病毒载量的临床标本病毒DNA提取液作为模板，进一步用步骤(5)和(6)的方法和条件进行四重荧光定量PCR扩增。所述的特异性的保守基因，指的是HPV-6的衣壳蛋白基因，HPV-11的衣壳蛋白基因，HPV-16的E6蛋白基因和HPV-18的LI基因。所述的待检靶基因特异性核酸序列，指的是针对每一种亚型病毒基因所特有的一段基因序列。所述的特异性荧光定量PCR引物，指的是长度为20±3Nt的寡核苷酸链，与四型HPV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补。所述的特异性荧光定量PCR荧光探针，指的是长度为20±3Nt的寡核苷酸链，与四型HPV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补，所有探针的5'端和3'端均使用AllGlo探针进行标记，AllGlo探针的每种染料既是报告基团又是粹灭基团。步骤(1)、(2)所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列如下HPV-6:上游引物GTTATCGCCTCCCCCAAAT下游引物ATCTGGCTTTTCCTTTTCAGG探针URA-CCATTACCTGTCAAAAGCCCAC-URAHPV-11:上游引物TTGCGAAAGGAACAAATGTTT下游引物GGAAGACACCAATGAGCCACT探针MAR-TGGGGGAACCTGTGCC-MARHPV-16:上游弓I物AGGACCCACAGGAGCGAC下游弓I物AGTCATATACCTCACGTCGCAGT探针NEP-ATGCACAGAGCTGCAAACAA-NEPHPV-18:上游引物GGTTCAGGCTGGATTGCG下游引物TACACGCACACGCTTGGC探针JUP-TCGCAAACGTTCTGCTCC-JUPURA、MAR、NEP、JUP是AllGlo探针的四种不同荧光素。所述的四重荧光定量PCR反应体系，指的是由四组引物、探针以及2XqPCRMix定量PCR试剂组成的混合液。所述的标准分子，指的是利用基因克隆技术构建的人工重组质粒，每种质粒只重组一种特异待检靶基因序列。所述的四重荧光定量PCR反应标准曲线，指的是不同稀释度标准质粒分子用四重荧光定量PCR反应液进行检测所得，标准曲线的r2均大于0.98，扩增效率在1.00-1.25之间，满足荧光定量PCR标准曲线的要求。本发明根据四型HPV特异性基因的保守基因，登录GeneBank获取相关序列，应用Clustalw软件对所有序列比对分析，挑选最保守的基因序列用PrimerPremiers5.0软件设计引物，登录NCBI通过BLAST程序比对分析，每型病毒筛选出一对特异性最强的引物和相应的特异探针，用自制的不同浓度的标准分子(四型HPV靶基因质粒克隆载体)作为模板，在QiagenRotorGene6000荧光定量PCR仪中(能够同时检测5种荧光)进行单、四重荧光定量PCR实验，优化四重荧光定量PCR反应体系，确定该方法的灵敏度、特异性、重复性等，制备标准曲线，最后用该方法检测IO份临床标本，同时与临床实验室在用的单重T叫Man方法检测结果进行比较，分析四重荧光定量PCR方法的可靠性。本发明是一种临床最常见的四型人乳头瘤病毒(HPV)的早期、快速、简便而有效的四重实时荧光定量PCR检测方法，涉及的四型HPV包括HPV-6、HPV-11、HPV-16和HPV-18，由于采用AllGlo荧光素标记探针，使其检测灵敏度大大提高，达到10-100个拷贝的病毒分子，对于单个检测样本检测时间约为1.5个小时，操作简便，并且可以特殊进行大批量的样本分析检测，较现有的单重荧光定量PCR技术在检测通量方面有了极大提高，较HC-II技术在检测灵敏度、耗时、定量等方面均有很大的提高或改进，对HPV感染的流行监控、快速鉴定、疗效判断及指导HPV四价疫苗的应用等方面具有很大帮助，其应用前景看好。本发明可以简便快速地在一个反应管中同时、快速地检测临床常见四型HPV感染，对尖锐湿疣及常见型HPV致妇女宫颈癌变的早期防治、阻断传染源、减少HPV感染、监测临床疗效等均有很大的临床价值。采用本发明提供的方法，解决了现有HPV的某些检测方法要么不能分型、要么不能检测多重感染、要么不能定量、或者成本高、操作繁琐等诸多缺陷，实现了单管PCR同时分型检测四型HPV，而且能够定量检测，操作简单快速，灵敏度高，特异性好，重复性好，结果准确可靠。图l-5是四型HPV四重荧光定量PCR特异性实验扩增图(各型HPV模板质粒量均为10^opies/iU:图1是HPV-6在四重荧光定量PCR体系中的特异性扩增图，图2是HPV-11在四重荧光定量PCR体系中的特异性扩增图，图3是HPV-16在四重荧光定量PCR体系中的特异性扩增图，图4是HPV-18在四重荧光定量PCR体系中的特异性扩增图。图6-9是四型HPV四重PCR标准曲线模板质粒量(Copies/y1)分别为(从左至右)为107、106、105、104、103。具体实施例方式人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法包括如下步骤(1)引物设计在基因库中检索获得四型人乳头瘤病毒，即HPV-6、-ll、-16、-18特异性的保守基因，通过网上序列比对，确定HPV-6、-ll、-16、-18亚型的高度保守序列区，作为待检靶基因特异性核酸序列设计特异引物；(2)荧光探针设计根据步骤(1)中的四型HPV的待检靶基因特异性核酸序列设计荧光探针；(3)标准分子的构建根据步骤(1)确定的特异引物，利用基因克隆技术构建四种分别含有HPV-6、-11、-16、-18高度保守序列区的标准质粒分子；(4)四重荧光PCR反应液组成使用步骤(1)中的引物和步骤(2)中的探针及2XqPCRMix定量PCR试剂组成四重荧光PCR反应液；(5)四重荧光PCR反应的优化和建立通过100-400nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，组成不同的四重荧光定量PCR反应体系，根据反应效率和曲线确定最终的PCR反应体系；(6)标准曲线制备使用步骤(5)中的四重荧光PCR反应体系，将已知拷贝数的含有四型HPV目的扩增片段的重组质粒连续IO倍倍比稀释，加入到荧光定量PCR主反应液中，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline)，进行结果分析，制备标准曲线；(7)临床标本检测用已知HPV基因型别和病毒载量的临床标本病毒DNA提取液作为模板，进一步用步骤(5)和(6)的方法和条件进行四重荧光定量PCR扩增。所述的特异性的保守基因，指的是HPV-6的衣壳蛋白基因，HPV-11的衣壳蛋白基因，HPV-16的E6蛋白基因和HPV-18的LI基因。所述的待检靶基因特异性核酸序列，指的是针对每一种亚型病毒基因所特有的一段基因序列。所述的特异性荧光定量PCR引物，指的是长度为20士3Nt的寡核苷酸链，与四型HPV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补。所述的特异性荧光定量PCR荧光探针，指的是长度为20±3Nt的寡核苷酸链，与四型HPV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补，所有探针的5'端和3'端均使用AllGlo探针进行标记，AllGlo探针的每种染料既是报告基团又是粹灭基团。步骤(1)、(2)所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列如下HPV-6:上游引物GTTATCGCCTCCCCCAAAT下游引物ATCTGGCTTTTCCTTTTCAGG探针URA-CCATTACCTGTCAAAAGCCCAC-URAHPV-11:上游引物TTGCGAAAGGAACAAATGTTT下游引物GGAAGACACCAATGAGCCACT探针MAR-TGGGGGAACCTGTGCC-MARHPV-16:上游引物AGGACCCACAGGAGCGAC下游引物AGTCATATACCTCACGTCGCAGT探针NEP-ATGCACAGAGCTGCAAACAA-NEPHPV-18:上游引物GGTTCAGGCTGGATTGCG下游引物TACACGCACACGCTTGGC探针JUP-TCGCAAACGTTCTGCTCC-JUPURA、MAR、NEP、JUP是AllGlo探针的四种不同荧光素。所述的四重荧光定量PCR反应体系，指的是由四组引物、探针以及2XqPCRMix定量PCR试剂组成的混合液。所述的标准分子，指的是利用基因克隆技术构建的人工重组质粒，每种质粒只重组一种特异待检靶基因序列。所述的四重荧光定量PCR反应标准曲线，指的是不同稀释度标准质粒分子用四重荧光定量PCR反应液进行检测所得，标准曲线的r2均大于0.98，扩增效率在1.00-1.25之间，满足荧光定量PCR标准曲线的要求。实施例1.四型HPV目的基因质粒克隆载体的构建采用T-A载体克隆方案，将四种目的基因PCR产物经过电泳确认扩增片段分子量后，扩增片段克隆至PMD-19T质粒中，16t:连接过夜。将连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5a中，在LB培养基(含Ampl00g/ml)上筛选阳性菌落，经质粒小提试剂盒回收、抽提、纯化、重组质粒，并在英俊(上海)生物公司测序验证，序列经Blast后完全正确的目的质粒用紫外分光光度计定量后，用1XTE(pH8.0)缓冲液稀释到1010拷贝/iU作为储存液，-2(TC保存备用。2.DNA模板提取分泌物拭子标本用生理盐水溶解，组织块或尖锐湿疣疣体置4%氢氧化钠液中，用金属棒捣碎。振荡重悬1分钟，高速低温离心lmin(4°C，12000g/min)，弃上清液，往沉淀物中加50ii1DNA提取液(达安分子诊断公司)，IO(TC加热10min，高速低温离心5min(4。C，12000g/min)，备用。3.AllGlo探针四重荧光定量PCR3.1引物及探针查阅相关的专业文献，根据文献报道获取四型HPV特异性保守基因，登录GeneBank获取相关序列，应用Clustalw软件对所有序列比对分析，挑选最保守的基因序列用PrimerPremiers5.0软件设计引物，登录NCBI通过BLAST程序比对分析，每型病毒筛选出一对特异性最强的引物和相应的特异探针(见表l)。四型HPV单管多重荧光定量PCR引物和相应的AllGlo探针由上海超世生物公司合成。为了确保多重荧光定量PCR的特异性和灵敏度，所有的引物和探针均与GenBank里的扩增靶序列进行BLAST，所有引物和探针的Tm值几乎一致。为了增加与相应型别HPV扩增靶序列杂交的特异性，每条探针与非特异杂交序列至少有9个碱基不互补配对。采用QiagenRotorGene6000荧光定量PCR仪中(能够同时检测5种荧光)进行多重荧光定量PCR实验。表lAllGlo探针四重定量PCR检测四型HPV引物和探针<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>基因序号扩增耙位引物名称引物序列探针产物长度(bp)EU834744.1LlgeneHPV18FHPV18RGGTTCAGGCTGGATTGCGTACACGCACACGCTTGGCJUP-TCGCAAACGTTCTGCTCC-JUP100探针采用美国AlleLogicBiosciences公司推出了最新一代荧光定量探针-AllGlo探针URA、MAR、NEP、JUP均为不同波长的AllGlo探针标记荧光素。3.2单重荧光定量PCR条件优化采用四个引物探针比例对荧光定量PCR进行优化40iUPCR反应体系，2XqPCRMix(上海超世生物公司)20ia，io4c0pies/ia的质粒模板iyi，引物(上、下游)与相应型别探针分别加1.6ii1、1.6ii1(400nM:400nM)，1.6ii1、0.8ii1(400nM:200nM)，0.8ii1、0.8ii1(200nM:200nM)，0.8ii1、0.4ii1(200nM:100nM)，用双蒸水补至40ii1，所有引物探针应用浓度均为lOyM.，每种引物探针比例均平行做两管，同时用空白质粒做对照。于QiagenRotorGene6000荧光定量PCR仪(Qiagen公司生产)扩增，循环条件95°C5min，95。C10s、58。C20s(45cycles)。实时分析软件计算扩增Ct值，以扩增Ct值统计实验结果。以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值时的引物探针浓度比例为最佳。3.3四重荧光定量PCR条件优化根据单重荧光定量PCR条件优化实验所得结果，选择引物探针浓度比例为400nM:400nM和400nM:200nM两种比例进行四重PCR，PCR反应体系及扩增条件同上，将四种引物和探针加入同一管中，然后各管分别加入一型lOtopies/iU的HPV质粒模板1Pl，阴性对照加空白质粒各1Pi进行单目的基因多重PCR扩增，另外，加1四型HPV质粒和空白质粒的混合液作为模板，用双蒸水补至40iU，每个反应平行做3管。以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值时的引物探针浓度比例作为四重PCR标准曲线制作和其他实验的最终扩增条件。3.4四重荧光定量PCR的特异性、敏感性试验将已知拷贝数的含单一型别的HPV目的扩增片段的重组质粒，使用时连续10倍倍比稀释至浓度在1.0X10。拷贝/ia-1.0X108COpieS/iil之间作为单基因多重PCR的标准品；同时，将四种单一型别的HPV重组质粒和空白质粒混合后进行IO倍倍比稀释成1.0X10°Copies/ii1-1.0X108Copies/ii1之间，作为多基因多重荧光定量PCR的标准品。取不同载量的标准品1P1作为四重荧光定量PCR的模板，同时用空白质粒和双蒸水做对照实验，对各稀释度模板按照步骤(3.3)确立的反应体系和扩增条件同时进行荧光PCR检测，所有检测标本至少检测两次，扩增完成后用仪器自带的软件自动分析结果，从而确定该方法的最低检出限，评估四型HPV荧光定量PCR的检测灵敏度。3.5四重荧光定量PCR标准曲线制备将1(TCopies/y1四个型别HPV重组质粒等量混合均匀，稀释成含每种HPV质粒(Copies/111)103、104、105、106、107作为制备标准曲线的标准品，按照步骤(3.3)确立的反应体系和扩增条件同时进行荧光PCR检测，所有检测标本至少检测两次，扩增完成后用仪器自带软件分析结果，制备标准曲线。3.6四重荧光定量PCR的重复性试验将已知拷贝数的四型HPV重组质粒混合液(104Copies/iU)平均分成10份，-20°。冷冻保存作为模板，按制备标准曲线的四重荧光定量？0的反应体系和扩增条件进行扩增，同时按照步骤(3.5)制备标准曲线，每周检测一次，根据标准曲线仪器自动给出定量检测结果，连续5周，最后统计软件分析5次检测结果的重复性(CV%)。3.7结果判定3.7.1分析条件设定根据仪器所带分析软件自动分析结果，阈值设定原则以阈值线刚好覆盖阴性对照品扩增线和仪器噪音进行调整。3.7.2质控标准空白对照物无扩增曲线和Ct值，阳性对照的Ct值应与标准曲线的相应标准品的Ct值相对应，并且出现典型的扩增曲线，否则实验视为无效。3.7.3结果描述及判定A.阴性无Ct值无扩增曲线B.阳性及定量判断Ct值《35且出现典型的扩增曲线判定为阳性，且根据标准曲线自动获取定量值，表示样品中存在HPV病毒颗粒。C.有效原则Ct值》35的样品定量结果不可靠，需重做实验，无Ct值为阴性，有Ct值但>35需重新取标本复查。3.8临床标本检测取10份经杂交捕获法(HybridC即tur，HC_2，凯普生物科技有限公司，HybriBioLimited，HONGKONG)确定基因型别的宫颈细胞刷标本(Cervicalcytobrushsamples)或生殖器疣体或分泌物标本，按试剂盒说明提取DNA(达安基因诊断公司或凯普生物科技有限公司)，每份DNA提取样品平均分成4份，2份用临床实验室广泛使用的TaqMan单探针技术单重荧光定量PCR方法检测HPV6-11混合型和HPV16-18混合型(广州达安公司)，l份标本用AllGlo探针多重荧光定量PCR单管同时检测HPV-6、-ll、-16、-18，剩余样品置-7(TC冷冻保存(以备必要时复查用)。进一步验证四重荧光PCR方法的特异性。在每一个检测试验中采用同管等量的DNA模板，平行两管，只有当所有平行试验结果一致时，才确定该份DNA样品的检测结果，否则需重新进行检测，最后与T叫Man单探针技术检测结果进行比较(表2)。结果1.四重荧光定量PCR条件优化结果各型HPV标准分子(104Copies/iU)在四重荧光定量PCR体系中进行扩增后，当引物探针比例为(nM))400:400时，HPV-6、-11、-16、-18的Ct值分别为23-24、20-21、21-22、22-24;当引物探针比例为(nM)400:200时，HPV-6、-11、-16、-18的Ct值分别为22-23、20-21、22-23、23-25。2.四重荧光定量PCR的特异性、敏感性试验结果各型HPV标准分子(104COpieS/Pl)在四重荧光定量PCR体系中进行扩增后，其特异性均为100%9(见附图1-5)。HPV-6、-ll、-16、-18在四重荧光定量PCR体系中检测灵敏度分别为(Copies/ii1)102、101、3.四重荧光定量PCR标准曲线制备结果各型HPV标准分子的标准曲线在经过优化的四重荧光定量PCR反应体系进行制备，HPV-6、-11、-16、-18的标准曲线的r2分别为0.995、0.999、0.992、0.983，扩增效率(Efficiency)分别为1.00、1.12、1.25、1.03(见附图6-9)。4.四重荧光定量PCR的重复性试验结果相同的四型HPV标准分子混合液(104Copies/ii1)在四重荧光定量PCR体系检测5次，检测数据经对数转换后各型HPV5次检测的CV均小于5X，详见表2。:0116]表2四型HPV标准分子混合液重复性检测结果HPV基因第一次第二次第三次第四次第五次MenaSDcv型63.954.054.414.284.044.1460.191390.046162114.134.374.554.344.434.3640.1535580.035187163.914.004.014.374.044.0660.176720.043463184.324.564.394.604.504.4740.1169620.0261425.临床标本检测检测结果10份临床标本采用三种方法检测，其结果见表3。表3临床标本试验结果比较标本HC-2分型单重荧光定量四重荧光定量PCR号PCR61116186-1116-1861116181+_--3.5E5*03.2E50002_+--4.2E4004.6E4003--+-02.6E6002.1E604---+06.9E60007.6E65+_+-5.6E46.3E46.3E406.0E406_++-3.3E55.6E605.1E55.1E607+_++5.5E48.9E74.2E402.2E89.6E48+++-7.6E65.5E45.3E49.8E64.9E409++++6.2E67.3E75.0E48.9E62.9E42.1E810--__000000注:*3.5E5表示3.5X105，单位为Copies/ii1(test)，余同。权利要求一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法，其特征在于，包括如下步骤(1)引物设计在基因库中检索获得四型人乳头瘤病毒，即HPV-6、-11、-16、-18特异性的保守基因，通过网上序列比对，确定HPV-6、-11、-16、-18亚型的高度保守序列区，作为待检靶基因特异性核酸序列设计特异引物；(2)荧光探针设计根据步骤(1)中的四型HPV的待检靶基因特异性核酸序列设计荧光探针；(3)标准分子的构建根据步骤(1)确定的特异引物，利用基因克隆技术构建四种分别含有HPV-6、-11、-16、-18高度保守序列区的标准质粒分子；(4)四重荧光PCR反应液组成使用步骤(1)中的引物和步骤(2)中的探针及2×qPCRMix定量PCR试剂组成四重荧光PCR反应液；(5)四重荧光PCR反应的优化和建立通过100-400nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，组成不同的四重荧光定量PCR反应体系，根据反应效率和曲线确定最终的PCR反应体系；(6)标准曲线制备使用步骤(5)中的四重荧光PCR反应体系，将已知拷贝数的含有四型HPV目的扩增片段的重组质粒连续10倍倍比稀释，加入到荧光定量PCR主反应液中，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline)，进行结果分析，制备标准曲线；(7)临床标本检测用已知HPV基因型别和病毒载量的临床标本病毒DNA提取液作为模板，进一步用步骤(5)和(6)的方法和条件进行四重荧光定量PCR扩增。2.根据权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法，其特征是，所述的特异性的保守基因，指的是HPV-6的衣壳蛋白基因，HPV-ll的衣壳蛋白基因，HPV-16的E6蛋白基因和HPV-18的LI基因。3.根据权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法，其特征是，所述的待检靶基因特异性核酸序列，指的是针对每一种亚型病毒基因所特有的一段基因序列。4.根据权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法，其特征是，所述的特异性荧光定量PCR引物，指的是长度为20±3Nt的寡核苷酸链，与四型HPV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补。5.根据权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法，其特征是，所述的特异性荧光定量PCR荧光探针，指的是长度为20±3Nt的寡核苷酸链，与四型HPV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补，所有探针的5'端和3'端均使用AllGlo探针进行标记，AllGlo探针的每种染料既是报告基团又是粹灭基团。6.根据权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法，其特征是，步骤(1)、(2)所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列如下HPV-6:上游弓I物GTTATCGCCTCCCCCAAAT下游引物ATCTGGCTTTTCCTTTTCAGG探针URA-CCATTACCTGTCAAAAGCCCAC-URAHPV-11:上游引物TTGCGAAAGGAACAAATGTTT下游弓I物GGAAGACACCAATGAGCCACT探针MAR-TGGGGGAACCTGTGCC-MARHPV-16:上游引物AGGACCCACAGGAGCGAC下游引物AGTCATATACCTCACGTCGCAGT探针NEP-ATGCACAGAGCTGCAAACAA-NEPHPV-18:上游弓I物GGTTCAGGCTGGATTGCG下游引物TACACGCACACGCTTGGC探针JUP-TCGCAAACGTTCTGCTCC-JUPURA、MAR、NEP、JUP是AllGlo探针的四种不同荧光素。7.根据权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法，其特征是，所述的四重荧光定量PCR反应体系，指的是由四组引物、探针以及2XqPCRMix定量PCR试剂组成的混合液。8.根据权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法，其特征是，所述的标准分子，指的是利用基因克隆技术构建的人工重组质粒，每种质粒只重组一种特异待检靶基因序列。9.根据权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法，其特征是，所述的四重荧光定量PCR反应标准曲线，指的是不同稀释度标准质粒分子用四重荧光定量PCR反应液进行检测所得，标准曲线的r2均大于0.98，扩增效率在1.00-1.25之间，满足荧光定量PCR标准曲线的要求。全文摘要本发明公开了一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法。它包括一个以荧光定量PCR技术为基础的四重PCR反应体系，包含针对4种人乳头瘤病毒(HPV)基因型的正、反向引物和AllGlo荧光探针，在适合的PCR条件下可在一个反应管中同时检测最多包括HPV-6、-11、-16、-18的DNA载量，包括特异性引物及荧光探针的设计、标准分子的构建、标准曲线制备及临床标本检测。本发明可以简便快速地在一个反应管中同时、快速地检测临床常见四型HPV感染，实现了单管PCR同时分型检测四型HPV，且能够定量检测，操作简单快速，灵敏度高，特异性、重复性好，结果准确可靠，对尖锐湿疣及常见型HPV致妇女宫颈癌变的早期防治、阻断传染源、减少HPV感染、监测临床疗效均有很大的临床价值。文档编号G01N21/64GK101709335SQ200910155289公开日2010年5月19日申请日期2009年12月10日优先权日2009年12月10日发明者余道军,李兰娟申请人:浙江大学