专利名称：一种人白细胞抗原hla-b27基因荧光定量pcr快速检测方法及其试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种检测人白细胞抗原HLA-B27 (Human Leukocyte Antigen B27)基 因的方法，尤其涉及使用荧光定量PCR技术，通过提取人外周血基因组DNA对HLA-B27进行 检测的方法。本发明进一步涉及用于人白细胞抗原HLA-B27基因检测的试剂盒。本发明属 于生物医药领域。
背景技术：
人类白细胞抗原(HLA)是人类主要组织相容性复合体(Major Histocompatibity Complex,MHC)的表达产物。HLA基因位于第6对染色体的短臂上，约4000kb。根据功能和 产物的不同，HLA基因分为三类经典的HLA基因、免疫功能相关基因和免疫无关基因等。 HLA基因包括A、B、C、D、DR、DQ、DP等座位，这几类基因座位内又有不同的位点，是迄今为止 发现多态性最高的基因系统之一，截止目前检出的HLA基因已经超过1000种。HLA呈现多 态性，即多数的HLA座位有大量的等位基因存在。经典的HLA基因分为I类和II类基因包 含A、B、C等座位，HLA-I类基因位于HLA复合体远着丝粒端，其表达的产物称为HLA-I类 分子(或抗原)，由各等位基因编码的重链和15号染色体非HLA基因编码的轻链β 2-Μ共 同构成；HLA-II类基因坐落在复合体近着丝粒短，其表达的产物称为HLA-II类分子(或抗 原)，是由分子量相近的α链和β链组合而成的二聚体。HLA-II类基因在其座位和数量 组成方面比I类基因更为复杂。HLA分子主要与同种异体移植中的排斥反应有密切的关系。HLA-I类分子在大多 数有核细胞表面均有表达，体液中也存在大量的HLA-I类分子。它在免疫识别过程中起到 了识别异源性抗原的作用，并经抗原呈递给T淋巴细胞。HLA-I类分子在病毒和肿瘤细胞 的杀伤过程中起到重要作用。HLA-II类分子主要与来源于传统的内吞降解途径产生的多 肽相结合。体外实验证实，供受体HLA-II类分子不同时，供体的II类抗原能够直接刺激受 体⑶4阳性的T细胞增殖和淋巴因子分泌。因此在器官移植的匹配中II类抗原比I类抗 原更为重要。HLA分子在免疫应答过程中还起到限制性作用，表现为I类分子结合的是内源 性通道的小片段分子，并将抗原呈递给CD8阳性的细胞毒性T细胞。而二类分子结合的是 外源性片段，并将抗原呈递给CD4阳性的辅助性T细胞。此外HLA分子还在个体的自我识 别、生殖、疾病等方面起到一定作用。HLA基因及其分子与疾病的相关性研究始于20世纪60年代。1966年Lilly等在 小鼠体内发现了一个抗Gross白血病病毒基因，定位在小鼠H-2基因的k端。此研究开启了 人们对HLA与疾病相关性研究的探索先河。后来Amiel研究发现，HLA在某些家族中与霍奇 金病有一定的相关性。这是世界上第一次发现HLA与肿瘤的相关性。1973年Terasaki等 首次报道了在强直性脊柱炎患者人群中HLA-B27基因的出现率远高于对照组，在强直性脊 柱炎患者中，88-96%的病人HLA-B27基因为阳性，在正常对照人群中，HLA-B27阳性率仅有 4-8%。分子统计学方法证实，HLA-B27阳性的人群罹患强直性脊柱炎的风险性是HLA-B27
3阴性人群的162倍。这一研究发现引起了国际医学界的高度关注，并引发了世界范围内HLA 抗原与疾病相关性的研究。在国内曾有学者报道了 21例强直性脊柱炎患者，其中20例呈 HLA-B27阳性。阳性率达95. 24%。孔繁华等曾对514例AS患者进行研究，HLA-B27阳性的 为453例，阳性率为88. 13%。上述各种研究充分说明了 HLA-B27与AS的高度相关性。另 据报道，世界上不同种族不同地区的人群HLA-B27与强直性脊柱炎均有较高的相关性。国内有学者对人白细胞抗原HLA-B27有更深入的研究，对强直性脊柱炎患者的 HLA-I类基因进行限制性片段多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)，EcoRI8. lkb、EcoRI5. 2kb 和XbaI21. 9kb 出现的频率远高于健康人群。而EcoRI8. Ikb 可能含有强直性脊柱炎易感基因或者与易感基因有连锁的不平衡关系。粟占国等对67例 病人进行研究，结果发现，HLA-B27阳性患者发生强直性脊柱炎的年龄比HLA-B27阴性者早 5年。国外Sachs等研究发现，强直性脊柱炎患者不仅HLA-B27阳性率高于对照组，而且Cwl 和Cw2的比例也明显升高。采用等点聚焦电泳的方法对强直性脊柱炎患者人白细胞抗原HLA-B27进一步 可以分为 9 种亚型HLA-B*2701、HLA_B*2702、HLA_B*2703、HLA_B*2704、HLA_B*2705、 HLA-B*2706、HLA_B*2707、HLA_B*2708、HLA_B*2709 等，而汉族人中 HLA_B*2704、 HLA-B*2705这两种等位基因的发生频率较高，是汉族人群中强直性脊柱炎的高度关联基 因。这些等位基因序列具有较高的同源性，他们的表达产物各代表一种亚型，彼此仅相差几 个氨基酸序列。关于HLA-B27与强直性脊柱炎发生的关联机制，有以下几种学说1.免疫 应答基因假说，该学说认为HLA-B27基因就是强直性脊柱炎的易感基因，病人的各种症状 和实验室检查提示免疫功能有异常。2.基因连锁假说，该学说认为HLA-B27是一种疾病相 关基因的遗传标志，参与强直性脊柱炎的发生。3.模拟分子假说，认为对于强直性脊柱炎患 者，HLA分子与病原体的抗原性存在交叉，而宿主对相应的病原体有免疫耐受性，从而导致 该病原体的免疫逃避而致病。4.关节致病肽假说，该假说认为关节致病肽是一种存在于关 节中的多肽，该抗原由HLA-B27呈递，当机体免疫功能紊乱时，HLA-B27对这种多肽的呈递 性增强，从而引发自身组织损伤。鉴于人白细胞抗原HLA-B27与强直性脊柱炎的高度相关性，加之该病症状隐匿， 而且与其它关节疾病症状相似容易漏诊和误诊，所以实验室辅助检查尤为重要。目前针对 HLA-B27检测的方法有一是HLA-B27基因检测，主要是PCR扩增的方法；另一种是检测B27 抗原，主要是流式细胞法，或者ELISA法；第三种是微量淋巴细胞毒的方法，用于检测细胞 表面的B27抗原。前一种方法是采用序列特异性引物对HLA-B27进行PCR扩增，检测到特 异性片段。后两种主要是检测HLA-B27分子，流式细胞法主要使用一种荧光标记的特异性 抗体对细胞表面的HLA-B27分子进行检测，该法具有较好的特异性，但是需要特殊仪器，而 且操作繁琐，检测成本较高。而微量淋巴细胞毒的方法其原理是用针对HLA-B27的抗体和 补体孵育待检测的淋巴细胞，并用相应的荧光染料对阳性细胞进行标记，在荧光显微镜下 观察进行检测。该法操作流程复杂，容易出现假阳性和假阴性，不宜在临床上推广。荧光定量PCR技术其原理是在常规PCR扩增系统中加入一段与靶基因特异互补的 荧光标记探针。探针的5'端标记有报告基团，如FAM、VIC等，3'端标记有荧光淬灭基团， 如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不 到荧光信号。随着PCR扩增的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针就会将探
4针切断产生荧光信号。在PCR过程中，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。当信号 增强到某一阈值，此时的循环次数(用循环阈值Ct表示)就被记录下来。CT值和PCR体系 中起始模板的对数之间有着严格的线性关系，利用阳性定量标准品扩增的Ct和标准曲线， 再根据待测样品的Ct值就可以准确定出起始模板核酸的数量。本发明的“一种人白细胞抗 原HLA-B27基因荧光定量PCR快速检测方法及其试剂盒”就是依据该技术原理实现的，起到 了对HLA-B27基因快速准确检测的目的。由于该方法引入了特异性扩增引物和荧光探针， 使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高和 容易漏诊、误诊的问题。
发明内容
本发明提供了检测人白细胞抗原HLA-B27基因方法，特别是提供了一种使用荧光 定量RT-PCR技术快速准确的检测出全血或者组织标本中HLA-B27基因的方法。本发明进 一步提供了用于该基因检测的试剂盒。本发明具体步骤包括⑴样品的采集和DNA的提取；⑵荧光定量PCR体外扩增 法对样本进行检测；(3)扩增反应结束后根据每个扩增反应的荧光强度对相应样本进行分 析，从而判断HLA-B27基因的存在。检索Genbank上的人白细胞抗原HLA-B27基因序列，用生物新信息学的方法，进 行比对分析，并采用人生长激素基因(HGH)作为内参照基因，设计序列特异性引物(SSP， Sequence Specific Primer)和荧光探针如下人白细胞抗原HLA-B27 上游引物5，-CTTCATCACCGTGGGCTACG-3，(SEQID NO. 1)下游引物5，-TATCCACGGCGCCCGCGGCT-3，(SEQID NO. 2)荧光探针FAM-5，GACGACACGCTGTTCGTGAGGTTCG3，-TAMRA(SEQ ID NO. 3)人生长激素基因HGH 上游引物5，-AGGATCCCAAGGCCCAACT-3，(SEQID NO. 4)下游引物5，-GGAGCCTGTAGCCATTGCA-3，(SEQID NO. 5)荧光探针FAM-5，ACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTC3，-TAMRA(SEQ ID NO. 6)根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的人白细胞抗原HLA-B27包括了与强 直性脊柱炎相关的HLA-B27基因的所有亚型，其检测也是针对HLA-B27各亚型。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的HLA-B27基因荧光定量PCR快速检 测方法，引入了人生长激素基因HGH作为实验中的内参照基因。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的荧光标记是指检测HLA-B27和检测 内参照基因HGH的探针的荧光标记为FAM，淬灭基团为TAMRA。根据本发明的一个优选实施方案，为了完成本发明的检测方法首先采集标本，该 检测方法适用标本类型为EDTA或柠檬酸钠抗凝的人外周血l_2ml左右，需要立即送检，如 不能立即送检需要低温保存。根据本发明的一个优选实施方案，为了完成本发明的检测方法对上述标本提取 DNA，然后进行扩增检测。根据本发明的一个优选实施方案，为了完成本发明的检测方法，HLA-B27和HGH荧光PCR扩增体系(PCR MIX)分别按照如下方式配制，上游引物(IOuM)=Iul下游引物(IOuM)=Iul荧光探针(IOuM)0. 5ulPCR 反应液 21.5ul_Total24. 0 μ 1根据本发明的一个优选实施方案，上述PCR反应液包含FQ buffer (由 5 XFQbuffer经双蒸水稀释为IX作为工作浓度)、四种核苷酸单体(dNTPs)等成分。根据本发明的一个优选实施方案，上述1 XFQ buffer工作液各主要成分和浓度如 下50mM Tris-HCl (pH8.0)、5mM MgC12、50mM KC1、0. 01 %的明胶等。本发明的另一个目的是提供一种用于快速检测人白细胞抗原HLA-B27基因的试 剂盒，该试剂盒包括(1)核酸提取试剂；(2) Taq酶系；(3) PCR反应体系(PCR MIX) ； (4)阳 性和阴性质控品。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的荧光定量PCR反应体系(PCRMIX)包 括HLA-B27PCR MIX和HGH PCR MIX，分别是由相应特异性上游和下游引物、荧光探针(Fam 荧光标记)、荧光定量PCR反应缓冲液(FQ-Buffer，内含镁离子、Tris-HCl等)、四种核苷酸 单体(dNTPs)、PCR扩增增强剂和去离子水等成分构成的反应体系。根据本发明的一个优选实施方案，用于检测HLA-B27及其内参照基因的反应体系 设置为30ul，具体配制方法是上述PCR-MIX24ul、Taq耐热DNA聚合酶2ul加入提取的DNA 或者阳性质控品或者阴性质控品分别4ul。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的阳性质控品是指HLA-B27的特 异性扩增片段，经过克隆连接到T载体上，构建成的重组质粒，经过绝对定量其浓度为 107copies/mL· HLA-B27和HGH基因普通PCR的扩增结果见图1。对阳性质控品进行梯度 稀释，其扩增的动力学曲线和标准曲线如图2和3。根据本发明的一个优选实施方案，稀释阳性质控品(107COpieS/ml)，浓度梯度为 每 mil. 0X106、1. 0X105、1. 0X104、1. 0X103、1. 0X102、1. OX IO1Copies,进行灵敏度实验， 结果证实本试剂盒检测灵敏度为1. OX 102COpieS/ml，该荧光定量PCR方法的灵敏度和精 确性优于普通PCR方法。为了完成本发明的方法，首先采集标本，用无菌注射器抽取受检者静脉血1-2 毫升，注入无菌EDTA(或柠檬酸钠)抗凝管，立即混勻。标本可立即用于检测，也可保存 于-20°C待检，保存期为6个月。2-8°C保存时不应超过24小时。标本运送时应采用0°C冰 壶。然后进行DNA提取将抗凝血摇勻，取500 μ 1转至一洁净的1. 5ml离心管中，加入Iml 红细胞裂解液(RCLB)，剧烈震荡30s，3000g离心5min，弃上清。重复上述操作两次至无明 显红色沉淀。加入Iml生理盐水，剧烈震荡15s，IOOOOg离心5min，弃上清。沉淀加50ul核 酸提取液100°C恒温IOmin, 13，OOOg离心3min,取上清4 μ 1进行PCR反应。根据本发明的再一个优选实施方案，取出HLA-B27和HGH PCR MIX、Taq酶系，室 温融化并振荡混勻后，10，OOOrpm离心10s。对于每个标本都设定一个HGH内参照检测，内 参照和HLA-B27同步进行，同时设置一个阳性对照和阴性对照。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混勻，10，OOOrpm离心10s，向设定的PCR反应管中分别加 入PCR MIX和Taq酶系，向每管中加入处理后样品(所获得的DNA样品)或HLA-B27阳性 质控品和阴性质控品4 μ 1，10，OOOrpm瞬时离心30秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反 应槽内，按对应顺序设置阴性控品、阳性质控品、内参照以及未知标本，并设置样品名称、标 记荧光基团种类(报告基团为FAM，猝灭基团为TAMRA)和循环条群ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000、ABI PRISM 7300/7500 和 MJ Opticon 等仪器循环条件 930C- 2分钟，后93°C 30秒一55°C 45秒，采集荧光信号，40个循环。LightCycler等使用 毛细管的仪器循环条件93°C— 2分钟，后93°C 5秒一56°C 45秒，采集荧光信号，共40个 循环。反应结束后，使用手动调整阈值使阴性质控品Ct值在40以上，Ct值小于35个循 环的为阳性；Ct值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果 Ct值仍然在35-40个循环之间，判断为阳性，没有荧光值增长为阴性。判断结果时应当注 意阳性对照的Ct值均应小于30，且呈标准S型扩增曲线。阴性质控品应当全部阴性，曲 线不呈S型增长。以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效，全部试验应重新进行。根据本发明的一个优选实施方案，用已知标本对该试剂盒进行特异性实验，结果 证实，本试剂盒特异性较好，吻合度为100%。本发明的试剂盒经过多次不同的重复实验证实，具有良好的重复性和稳定性。 在-20°C条件下试剂盒可有效期可以达12个月。
四
图1显示常规PCR扩增特异性片段，2%的琼脂糖凝胶电泳，经PCR扩增后，其扩增 产物经2%的琼脂糖凝胶电泳在紫外灯下观察，可看到与目的片段大小一致的电泳条带，从 左到右依次是分子量Marker、人白细胞抗原HLA-B27、内参基因HGH和阴性对照PCR的扩增 结果。图2显示阳性质控品扩增动力曲线，梯度稀释；图3为阳性质控品标准曲线。
五具体实施例方式实施例1 :HLA_B27检测标本的采集和运送用无菌注射器抽取受检者静脉血1-2毫升，注入无菌EDTA (或柠檬酸钠)抗凝管， 立即混勻。标本可立即用于检测，也可保存于-20°C或者-70°C冰箱。标本2-8°C保存下不 应超过24小时；-20°C保存期为6个月；-70°C以下可以长期保存。标本避免反复冻融，标本 运送时应采用0°C冰壶。实施例2 基因组DNA的提取用本试剂盒配备的DNA提取试剂，将抗凝血摇勻，取500 μ 1转至一洁净的1. 5ml 离心管中，编号标记。加入Iml IX红细胞裂解液(RCLB，由本试剂盒配备10XRCLB经双蒸 馏水按1 9比例配制成1 XRCLB)，剧烈震荡30s，3000g离心5min，弃上清。重复上述步 骤两次至无明显红色沉淀。若红色沉淀仍比较明显，需要再重复上述步骤一次。加入Iml 生理盐水，剧烈震荡15s，IOOOOg离心5min，弃上清。沉淀加50 μ 1试剂盒配备的核酸提取 液，100°C恒温IOmin, 13，OOOg离心3min,取上清4 μ 1进行PCR反应。实施例3 本检测方法及试剂盒的适用仪器
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适用仪器主要包括ABIGeneAmp PCR System7700、ABI GeneAmp PCR System7500、 ABI PRISM 7300等，以及LightCycler等使用毛细管的仪器、MJOpticon系列或取得资格认 证的定量PCR仪。实施例4 人白细胞抗原HLA-B27基因的检测从试剂盒中取出用于检测人白细胞抗原HLA-B27和内参基因HGH的PCRMIX、Taq 酶系，室温融化并振荡混勻后，10，OOOrpm离心10s。设所需要的PCR反应管管数为N则N =样本数+1管阴性对照+1管阳性对照+等样本数的内参基因检测)，每个HLA-B27和内参 基因HGH测试反应体系分别按照如下表配制
试剂PCR MIXTaq酶系用量24 μ 12μ 1计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混勻，10，OOOrpm离 心10s，每个PCR反应管中分别加入26 μ 1反应液(包含Taq酶系)，向每管中加入处理后 样品(所获得的DNA样品)或HLA-B27阳性质控品和阴性质控品4 μ 1，10，OOOrpm瞬时 离心30秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性控品、阳性质 控品、内参照基因以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团种类(报告基团为FAM， 猝灭基团为 TAMRA)和循环条件:ABI PRISM7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp7000、ABI PRISM 7300/7500、MJ Opticon等使用薄壁管的仪器，循环条件93°C— 2分钟，后93°C 30 秒一550C 45秒，采集荧光信号，40个循环；LightCycler等使用毛细管的仪器，循环条件 93°C — 2分钟，后93 °C 5秒一56 °C 45秒，采集荧光信号，共40个循环。实施例5 结果分析和判定反应结束后，使用手动调整阈值使阴性质控品Ct值在40以上，Ct值小于35个循 环的为阳性；Ct值在35-40个循环之间为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct 值仍然在35-40个循环之间判断为阳性，没有荧光值增长为阴性。判断结果时应当注意阳性对照Ct值均应小于30，且阳性对照和内参照基因检测 呈标准S型扩增曲线。阴性质控品应当全部阴性，曲线不呈S型增长。否则，如果阳性对照 或者内参基因检测不呈标准S型扩增曲线，或者阴性对照呈标准S型扩增曲线，此次试验均 应视为无效，全部试验应重新进行。实施例6 本发明方法试剂盒的推广应用使用本发明的方法和试剂盒，对大量标本进行定量PCR检测，并最终经测序实验 验证。结果显示本发明方法的试剂盒，灵敏度为102copies，准确性和特异性达100%，重 复性和稳定性较好，本试剂盒的保存条件和有效期为-20°C，12个月。本方法的发明可为人 白细胞抗原HLA-B27的检测提供准确快速的方法，并作为强直性脊柱炎等HLA-B27相关疾 病的辅助诊断。六、序列表SEQUENCE LISTING<110>北京索奥生物医药科技有限公司<120> 一种人白细胞抗原HLA-B27基因荧光定量PCR快速检测方法及其试剂盒
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<130><160>6<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1cttcatcacc gtgggctacg 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>2tatccacggc gcccgcggct 20<210>3<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>3gacgacacgc tgttcgtgag gttcg 25<210>4<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>4aggatcccaa ggcccaact19<210>5<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>5ggagcctgta gccattgca19<210>6<211>26<212>DNA<213>人工合成<400>6accactcagg gtcctgtgga cagctc 26
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权利要求
本发明为一种使用荧光定量PCR的技术检测人白细胞抗原HLA B27(Human LeukocyteAntigenB27)基因的方法，通过提取人外周血基因组DNA，设计人白细胞抗原HLA B27序列特异性引物(SSP，Sequence Specific Primer)和特异性荧光探针，配以PCR反应缓冲液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTPs)等成分，通过PCR体外扩增法对人白细胞抗原HLA B27基因进行快速实时定量检测。本发明的成果是一种用于检测人白细胞抗原HLA B27基因的试剂盒，可用于强直性脊柱炎等疾病的辅助诊断。
2.根据权利要求1所述的一种检测人白细胞抗原HLA-B27荧光定量PCR检测方法及其 试剂盒，特征在于试剂盒中同时引入了人生长激素(HGH，Human Growth Hormone)基因作为 实验过程中的内参照。
3.根据权利要求1所述的双色荧光PCR检测方法及其试剂盒，所设计的用于检测人白 细胞抗原HLA-B27的SSP弓丨物(序列特异性引物)和荧光探针序列为上游引物5’ -CTTCATCACCGTGGGCTACG-3，； 下游引物5，-TATCCACGGCGCCCGCGGCT-3，； 荧光探针FAM-5，GACGACACGCTGTTCGTGAGGTTCG3，-TAMRA。所设计的作为人白细胞抗原HLA-B27检测的内参照的HGH基因的特异性引物和荧光探 针序列为上游引物5，-AGGATCCCAAGGCCCAACT-3，； 下游引物5，-GGAGCCTGTAGCCATTGCA-3，； 荧光探针FAM-5，ACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTC3，-TAMRA。 其中探针荧光标记均为FAM，淬灭基团均TAMRA。
4.根据权利要求1所述用于检测人白细胞抗原HLA-B27和HGH的单份荧光PCR扩增体 系分别按照如下方式配制，上游引物(10uM) :lul 下游引物(10uM) :lul 荧光探针(10uM) 0. 5ul PCR 反应液 21.5ulTotal24. 0 u 1上述 PCR 反应液包含各 200uM dNTPs,50mM Tris-HCl (pH8. 0)、5mM MgC12、50mM KC1、 0. 01%的明胶等。在PCR反应液加入2ulTaq酶系和4ul提取物即可以对HLA-B27基因进 行扩增检测。
5.根据权利要求1所述体外扩增法其扩增适用仪器和扩增条件为ABI PRISM 7700、 ABIPRISM5700、ABIGeneAmp7000、ABI PRISM 7300/7500、MJ Opticon 等扩增仪，93°C—2 分钟，然后93°C 30秒一55°C 45秒(采集荧光信号)，40个循环；LightCycler等扩增仪， 93°C— 2分钟，然后93°C 5秒一56°C 45秒(采集荧光信号)，共40个循环。
全文摘要
本发明提供了一种使用荧光定量PCR技术(PCR-荧光探针法)从人外周血样品中快速准确的检测与强直性脊柱炎高度相关的人白细胞抗原HLA-B27基因的方法。该方法包括(1)采集样品；(2)样本预处理和提取DNA；(3)荧光探针体外扩增法对样本进行检测；(4)扩增反应结束后根据每个扩增反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断患者是否携带与强直性脊柱炎高度相关的人白细胞抗原HLA-B27基因，作为临床强直性脊柱炎的辅助诊断，实现了对人白细胞抗原HLA-B27基因的实时快速检测。
文档编号G01N21/64GK101928768SQ20091014819
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月25日 优先权日2009年6月25日
发明者任美峰, 刘健翊, 史成军, 徐贵峰 申请人:北京索奥生物医药科技有限公司