专利名称：一种具有脑神经保护作用的灯盏细辛活性成分筛选方法
技术领域：
本发明涉及中药活性筛选方法，具体来说提供了一种筛选灯盏细辛中具有脑神经 保护作用活性成分的方法。
背景技术：
灯盏细辛又名灯盏花，为菊科植物短葶飞蓬[Erigeron breviscapus (Vant.) hand-Mazz.]的干燥全草，是临床广为应用的单味中药。对于灯盏细辛的化学成分和药理 活性已经进行了较多的基础研究，发现灯盏细辛及其提取物可扩张冠状动脉，增加心肌血 流，减少血小板积聚、改善微循环、改善冠心病心绞痛；改善急性脑梗死临床症状、增强急性 缺血性脑卒中患者神经功能的恢复、对脑缺血有明显保护作用。国内市场上已开发出该药 的冻干粉针、注射液、胶囊剂、片剂、滴丸等单味药制剂，主要用于心脑血管疾病的治疗。近 年来研究发现，灯盏细辛可用于治疗青光眼等眼科疾病，其作用机制与对视神经的保护有 关(张静，张艺，杨文宇等，华西药学杂志，2007，22 (2) :121 123)。发明人最近的研究表 明，灯盏细辛具有脑神经保护作用，表现为上调神经型尼古丁受体的表达、降低乙酰胆碱酯 酶活性和抗神经毒性作用(齐晓岚，黄勇，王永林等，时珍国医国药，2009，20(1) :69 71)。神经型尼古丁受体是神经系统中一类非第2信使介导性神经递质结合的离子通 道，与学习和记忆关系密切，是一类明确的具有神经保护功能的受体，其减少与阿尔茨海默 氏病(Alzheimerg disease，简称AD)的发生有关。AD病是一种主要在老年期发生的以进 行性痴呆为主要特征的神经元退行性变疾病，其主要临床表现为进行性认知功能障碍、记 忆力衰退、性格和行为改变等。AD病人脑内尼古丁受体-配体结合率降低，其亚基的蛋白表 达水平也降低。目前寻找可上调神经型尼古丁受体且副作用小的药物是治疗AD药物研究 的方向之一。同时迄今为止，在AD的治疗上，世界上最为成熟和成功的方法是采用胆碱酯 酶抑制剂，以提高患者脑内乙酰胆碱的水平、补偿胆碱能功能的缺失。由此可见，灯盏细辛具有脑神经保护作用，对于AD的治疗具有一定的作用，经深 入研究有望开发出灯盏细辛治疗老年性痴呆病的有效治疗药物。但目前对灯盏细辛具脑神 经保护的有效成分的研究未见报道。为了有效开发利用灯盏细辛的药用价值，快速准确地 筛选出灯盏细辛中具有脑神经保护作用的活性组分及成分具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于建立一种快速、简便、准确地筛选灯盏细辛中具有脑神经保护 作用的活性组分及成分的方法。本发明是通过以下技术方案实现的灯盏细辛中具有脑神经保护作用活性成分的筛选方法。该方法包括如下步骤(1)采用现代分离技术将分为不同极性的组分；(2)将各组分按不同配比组成组合物； (3)对组合物进行指纹图谱分析；
(4)对组合物进行神经细胞受损模型保护作用试验；(5)将指纹图谱化学信息和药理活性信息数据经统计学处理，筛选出灯盏细辛中 活性组分及活性成分。灯盏细辛提取物是采用0-95%乙醇水溶液提取，回收溶剂，冷藏，滤除不溶物，即得。灯盏细辛提取物可采用MCI 柱、大孔树脂吸附柱、聚酰胺吸附柱、硅胶柱将其分为 不同极性的组分，再将不同极性的各组分按正交设计、均勻设计、析因设计组成配比不同的 组合物。灯盏细辛组分不同配比的组合物可采用HPLC或UPLC进行指纹图谱分析。灯盏细辛组分不同配比的组合物的药理活性测试，可采用神经母细胞瘤细胞株 (SH-SY5Y)神经细胞，经毒性蛋白(如β淀粉样肽)处理，复制类似阿尔茨海默氏病(AD) 模型，以细胞MTT还原率、脂质过氧化产物(丙二醛，MDA)、神经型尼古丁受体α 7蛋白表达 等为活性指标，检测灯盏细辛各组分的不同配比组合物对抗β淀粉样肽(Αβ)对神经细胞 的毒性作用。灯盏细辛各组合物活性信息与其相应的指纹图谱化学信息可采用方差分析和相 关性分析进行谱效相关性研究，灯盏细辛中、低极性组分段具有明显活性，其中所含的绿 原酸、灯盏花苷、野黄芩苷、3，4-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、灯盏甲素、4， 5-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰与抗β淀粉样肽对神经细胞毒性作用呈现正相关，为灯盏细 辛脑神经保护作用的药效物质基础。与现有技术相比，本发明具有以下优点(1)本发明在国内首次进行了灯盏细辛指纹图谱特征和药效相关性研究，利用数 理统计方法将灯盏细辛不同配比组合物在指纹图谱上所体现的化学成分的变化和药效的 变化建立了相关性。(2)本发明在国内首次完成了灯盏细辛具有脑神经保护作用活性组分及活性成 分的筛选，灯盏细辛中、低极性组分段具有明显活性，其中所含的绿原酸、灯盏花苷、野黄芩 苷、3，4-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、灯盏甲素、4，5-二咖啡酰基奎宁酸色 谱峰为灯盏细辛脑神经保护作用的活性成分，经深入研究有望开发出灯盏细辛治疗老年性 痴呆病的有效治疗药物，具有良好应用前景。
图1、灯盏细辛药材全样指纹图谱(2.飞蓬苷、4.绿原酸、7.灯盏花苷、8.野黄芩 苷、9. 3,4- 二咖啡酰氧基奎宁酸、10. 3，5- 二咖啡酰氧基奎宁酸、11.灯盏甲素、12. 4，5- 二 咖啡酰氧基奎宁酸)图2、灯盏细辛药材高极性组分指纹图谱图3、灯盏细辛药材中极性组分指纹图谱图4、灯盏细辛药材低极性组分指纹图谱
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
1 材料1. 1药物与试剂灯盏细辛药材产于贵阳市花溪区，由贵阳医学院生药学研究室鉴 定为菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus (Vant.) hand-Mazz.的干燥全草；野黄芩 苷、3，5-二咖啡酰氧基奎宁酸、绿原酸购于中国药品生物制品鉴定所，飞蓬苷、灯盏花苷、灯 盏甲素、3，4_ 二咖啡酰氧基奎宁酸、4，5_ 二咖啡酰氧基奎宁酸等由贵阳医学院药学院提供 (经H-NMR，C-NMR结构鉴定，HPLC归一化纯度> 95% )。乙腈(色谱纯，美国天地公司)；MCI GEL树脂(CHP20P，日本三菱化学)。D-MEM培养液购自Gibco Invitrogen公司(英国)；源于 人脑的神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y细胞)购于German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司(德国)；羊抗α7及鼠抗β-肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体 及HRP标记的抗羊及抗鼠二抗购自Santa Cruz Biotechnology Inc (美国)。聚乙烯二氟 (PVDF)膜、ECL-Plus发光试剂、高效显影胶片购自Amersham公司。1. 2仪器WATERS超高效液相色谱(UPLC) ACQUITY系统，包括二元超高压溶剂系统、 二极管阵列检测器、Empowerf色谱工作站。1.3灯盏细辛组分由贵阳医学院药学院制备提供，灯盏药材以乙醇提取，回收溶 齐U，加水定容为Ig生药· mL—1，冷藏，滤除不溶物。提取药液采用MCI树脂(甲醇-水梯度 系统)划分为相对的高中低极性组分段，回收溶剂后，水定容到3g生药^L-1备用(A组分、 B组分、C组分)。2方法与结果2. 1供试样品制备按表1正交试验设计，调配9组由灯盏细辛各极性组分段所组成 的配伍组分，混合均勻后统一定容到相同体积即可。表IL9 (34)正交试验因素水平
权利要求
1.一种具有脑神经保护作用的灯盏细辛活性成分筛选方法，包括如下步骤(1)采用现代分离技术将分为不同极性的组分；(2)将各组分按不同配比组成组合物；(3)对组合物进行指纹图谱分析；(4)对组合物进行神经细胞受损模型保护作用试验；(5)将指纹图谱化学信息和药理活性信息数据经统计学处理，筛选出灯盏细辛中活性 组分及活性成分。
2.根据权利要求1的筛选方法，其特征在于灯盏细辛提取物是采用0-95%乙醇水溶 液提取，回收溶剂，冷藏，滤除不溶物，即得。
3.根据权利要求1-2的筛选方法，其特征在于灯盏细辛提取物可采用MCI柱、大孔树 脂吸附柱、聚酰胺吸附柱、硅胶柱将其分为不同极性的组分。
4.根据权利要求1-3的筛选方法，其特征在于将不同极性的各组分按正交设计、均勻 设计、析因设计组成配比不同的组合物。
5.根据权利要求1-4的筛选方法，其特征在于可采用HPLC或UPLC对组合物进行指 纹图谱分析；
6.根据权利要求1-5的筛选方法，其特征在于采用神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y) 神经细胞，经毒性蛋白(如β淀粉样肽)处理，复制类似阿尔茨海默氏病(AD)模型，以细 胞MTT还原率、脂质过氧化产物(丙二醛，MDA)、神经型尼古丁受体α 7蛋白表达等为活性 指标，检测灯盏细辛各组分的不同配比组合物对抗β淀粉样肽(Αβ)对神经细胞的毒性作用。
7.根据权利要求1-6的筛选方法，其特征在于将灯盏细辛各组合物活性信息与其相 应的指纹图谱化学信息进行方差分析和相关性分析；利用谱效相关性研究发现，灯盏细辛 中、低极性组分段具有明显活性，其中所含的绿原酸、灯盏花苷、野黄芩苷、3，4_ 二咖啡酰基 奎宁酸、3，5_ 二咖啡酰基奎宁酸、灯盏甲素、4，5_ 二咖啡酰基奎宁酸色谱峰与抗β淀粉样 肽对神经细胞毒性作用呈现正相关，为灯盏细辛脑神经保护作用的药效物质基础。
全文摘要
本发明涉及中药活性筛选方法，具体来说提供了一种筛选灯盏细辛中具有脑神经保护作用活性成分的方法。该方法包括如下步骤采用现代分离技术将灯盏细辛提取物分为不同极性的组分；将各组分按不同配比组成组合物；对组合物进行指纹图谱分析和神经细胞受损模型保护作用试验，将指纹图谱化学信息和药理活性信息数据经统计学处理，利用谱效相关性研究筛选出灯盏细辛中活性组分及活性成分。本发明可以快速、简便、准确地筛选灯盏细辛中具有脑神经保护作用的活性组分及成分，筛选效率高且成本较低，经深入研究有望开发出灯盏细辛治疗老年性痴呆病的有效治疗药物，具有良好应用前景。
文档编号G01N33/68GK102043020SQ20091010281
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月26日 优先权日2009年10月26日
发明者何迅, 傅晓钟, 兰燕宇, 刘童, 周雯, 官志忠, 廖尚高, 李勇军, 王永林, 王爱民, 郑林, 黄勇, 齐晓岚 申请人:贵阳医学院