专利名称:一种用于裂解液分析的整体床的合成方法
技术领域:
本发明涉及一种用于裂解液分析的整体床的合成方法,属于生物分子分析技术及色谱分 析领域。
背景技术:
基因治疗和DNA疫苗在癌症、单基因遗传病、艾滋病、心血管疾病、关节炎等重大疾病 的诊断和治疗方面的应用研究正日益引起越来越广泛的关注。目前质粒逐渐成为基因治疗的 最重要的基因传递系统,因此应用于基因治疗的药用质粒的大规模制备成为其基础。而药用 质粒的大规模制备过程的关键之一在于如何监测质粒纯度、监测质粒制备过程的性能,评价 最终产品质量以及产品的规格等,这对于过程开发、认证、产品批准非常重要。
典型的质粒大规模制备过程包括发酵、细胞收获、细胞裂解、澄清与浓縮和纯化等步骤。 其中裂解步骤可以去除全部细胞碎片,去除部分gDNA、 RNA、蛋白等杂质,所得到的裂解 液除了含有各种拓扑形态的质粒异构体、变性DNA (变性gDNA、变性质粒)之外,仍含有 人量杂质,如gDNA、高分子量RNA、低分子量RNA、蛋白、内毒素等。该过程对质粒收率 和质粒产品的质量影响很大,是目前研究者关注的焦点。在质粒制备过程流分析中因碱裂解 液中杂质含量高,其分析最为困难。
目前应用于裂解液分析的色谱法包括反相色谱、疏水相互作用色谱、体积排阻和离子交 换色谱等多种模式。离子交换色谱在裂解液分析中应用最为广泛。应用于裂解液分析过程的 阴离子交换型色谱介质均为商业化产品,其中大多数是为蛋白质分离分析而开发,主要有多 孔微球、灌注色谱填料、非多孔色谱填料和薄壳色谱填料等,为提高传质性能而开发的各种 新型色谱介质是其中的主体。裂解液分析是质粒制备过程流分析中重要且难于分析的部分。 因裂解是质粒制备过程的第一个步骤,而且该步骤对质粒的收率影响很大,该部分是目前质 粒制备研究的重点之一。裂解液中通常除目标质粒外,还含有高分子量RNA、低分子量RNA、 gDNA、蛋白和内毒素。将质粒和蛋白、RNA、 gDNA等杂质有效分离是色谱柱准确定量质粒 的前提。质粒与蛋白和低分子量RNA的分离比较容易,但是质粒与高分子量RNA的分离比较 困难,特别是未经纯化的裂解液,因样品中高分子量RNA含量很高,与质粒共洗脱形成宽峰, 一般的色谱柱均无法实现分离。为精确定量裂解液中质粒含量,通常采用RNase酶解将高分 子量RNA降解为寡核苷酸。目前尚未见采用色谱柱直接对含有大量RNA样品的裂解液进行分 析的报道。
3发明人在"Zhang M L, Sun Y. Poly(glycidyl methacrylate ~divinylbenzene -triallylisocyanurate) continuous-bed protein chromatography. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHYA. 2001,912(1): 31-38"和"张敏莲,白姝,孙彦.聚(GMA-DVB-TAIC) 型连续床的制备及其对蛋白质的色谱分离性能.离子交换与吸附,2003, 16(3) : 199 206"
中曾针对蛋白质分离分析开发了聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯一二乙烯基苯一三聚异氰尿酸三 烯丙酯)型整体床,该整体床具有良好的亲水性能。但由于该整体床针对蛋白分离分析开发, 整体床中的孔径为l 2nm,虽然在蛋白分离中可以具有良好的传质性能,但因质粒的长度可 达几百纳米,窄的部分可达十几纳米,而裂解液中还含有大量的高分子量杂质,如高分子量 RNA和gDNA,因此该类型整体床在裂解液分析中传质性能差,易出现色谱柱堵塞,而无法 应用于裂解液的分析。
发明内容
针对目前裂解液分析中需要对其进行预处理、传质性能差和色谱柱易污染的问题,本发 明的目的是提供一种具有适宜修饰密度、不易被污染、具有大量质粒可以进入的孔道、传质 速度快,背压低,可直接用于裂解液分析的整体床的合成方法。实现该发明的关键点在于控 制整体床的孔结构和修饰密度,即选取适宜的聚合条件和修饰条件。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的
一种用于裂解液分析的整体床的合成方法,其特征在于该方法包括如下步骤
1) 将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与交联剂、致 孔剂和引发剂混合,得到反应混合物,其中
a. 所述交联剂与单体的物质的量的比为0.05 0.2;
b. 所述致孔剂用量占反应混合物体积含量的40 80%;
c. 所述引发剂与单体的物质的量的比为0.005 0.03;
2) 将上述反应混合物超声混和均匀,加入到色谱柱管中,原位聚合形成整体床,聚合 温度控制在50 6(TC之间,反应时间为12 72小时;
3) 聚合反应结束后,利用有机溶剂冲洗整体床;
4) 利用溶于有机溶剂的胺类修饰剂对整体床进行改性,其中胺类修饰剂的体积含量为 25 75%,修饰温度控制在50 6(TC之间,反应时间为3 9小时;
5) 修饰反应结束后,利用有机溶剂冲洗整体床。
上述技术方案中,所述交联剂采用含有两个双键的化合物和三个双键的化合物的混合 物,两类交联剂的物质的量的比为0.25 4;所述的致孔剂采用饱和烷烃和芳烃中的至少一种; 所述的引发剂采用偶氮类物质;所述的有机溶剂为醇类和环醚类中的任一种。
所述含有两个双键的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷和双甲基丙烯酸乙二醇 酯中的任一种;所述含有三个双键的化合物采用三聚异腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯和三甲基丙烯酸丙三醇酯中的任一种。所述偶氮类物质采用偶氮二异丁腈和偶氮二异庚腈中的任一 种。所述饱和烃采用正庚烷、正辛垸和正壬垸中的任一种;所述芳烃采用甲苯、乙苯和二甲 苯中的任一种。所述醇类采用乙醇或甲醇;所述环醚类采用四氢呋喃或二噁烷。所述胺类修 饰剂采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一种。
本发明与现有技术中裂解液分析方法相比,具有以下优点及突出性效果该种类型的整 体床具有适宜的修饰密度、不易被污染、具有大量质粒可以进入的孔道、传质速度快、背压 低、可以对于未经预处理的含有大量杂质的裂解液进行多个批次的分析而分析柱性能无明显 改变,在裂解液分析中具有良好的耐污染能力,分析过程方便快捷,成本低。
具体实施例方式
本发明提供一种用于裂解液分析的整体床的合成方法,其特征在于该方法包括如下歩骤:
1) 将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与交联剂、致 孔剂和引发剂混合,得到反应混合物,其中
a. 所述交联剂与单体的物质的量的比为0.05 0.2;
b. 所述致孔剂用量占反应混合物体积含量的40 80%;
c. 所述引发剂与单体的物质的量的比为0.005 0.03;
2) 将上述反应混合物超声混和均匀,加入到色谱柱管中,原位聚合形成整体床,聚合 温度控制在50 6(TC之间,反应时间为12 72小时;
3) 聚合反应结束后,利用有机溶剂冲洗整体床;
4) 利用溶于有机溶剂的胺类修饰剂对整体床进行改性,其中胺类修饰剂的体积含量为 25 75%,修饰温度控制在50 6(TC之间,反应时间为3 9小时;
5) 修饰反应结束后,利用有机溶剂冲洗整体床。 所述交联剂采用含有两个双键的化合物和三个双键的化合物的混合物,两类交联剂的物
质的量的比为0.25 4;所述的致孔剂采用饱和烷烃和芳烃中的至少一种;所述的引发剂采用 偶氮类物质;所述的有机溶剂为醇类和环醚类中的任一种。
所述含有两个双键的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷和双甲基丙烯酸乙二醇 酯中的任一种;所述含有三个双键的化合物采用三聚异腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯和三甲 基丙烯酸丙三醇酯中的任一种。所述偶氮类物质采用偶氮二异丁腈和偶氮二异庚腈中的任一 种。所述饱和烃采用正庚垸、正辛烷和正壬烷中的任一种;所述芳烃采用甲苯、乙苯和二甲 苯中的任一种。所述醇类采用乙醇或甲醇;所述环醚类采用四氢呋喃或二噁垸。所述胺类修 饰剂采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一种。
利用合成的整体床进行裂解液分析的过程如下采用水和缓冲液A (10mMTris-HCl, lmMEDTA,pH8.0)冲洗整体床。所采用的溶液为缓冲液A,缓冲液B(缓冲液A+2MNaCl)。 盐梯度为0-5min 30-50%缓冲液B; 5-5.01min 50-30%缓冲液B; 5.01-15min 30%缓冲液B。将裂解液加入到整体床中,在0.2 0.6 mol/L盐浓度下将RNA和蛋白等杂质从整体床中洗脱 下来,然后在0.7 1.0mol/L盐浓度下将质粒组分洗脱下来,从而实现对裂解液的分析。下面通过几个具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例l:称取单体甲基丙烯酸縮水&油酯、交联剂二乙烯基苯和三聚异腈尿酸三烯丙酯(1:0.04:0.01 mol/mol/mol);致孔剂甲苯和正庚烷(致孔剂/反应混合物80 vol%,甲苯/正庚烷3: 2vol/vol);引发剂偶氮二异丁腈(引发剂/单体0.005:1 mol/mo1),混合均匀,装入一端密封 的50x4.6mm不锈钢管中,将另一端密封,于50。C反应72小时。将整体床连接到泵上,乙醇 冲洗。然后利用二乙胺为修饰剂,溶剂采用乙醇,二乙胺的体积含量为25%,修饰反应控制 在5(TC,反应时间为9小时。反应结束后,采用乙醇冲洗整体床。本发明所合成的整体床中 75%以上的孔其孔径在十微米以上,整体床的修饰密度约为1.1mmol/g整体床。 实施例2:称取单体甲基丙烯酸环氧乙酯、交联剂双甲基丙烯酸乙二醇酯和三乙烯基苯(l: 0.03:0.06 mol/mol/mol);致孔剂乙苯和正辛烷(致孔齐U/反应混合物75 vol%,乙苯/正辛烷1: 1 vol/vol); 引发剂偶氮二异丁腈(引发剂/单体0.01:1 mol/mo1),混合均匀,装入一端密封的50x4.6mm 不锈钢管中,将另一端密封,于55'C反应36小时。将整体床连接到泵上,四氢呋喃冲洗。 然后利用二甲胺为修饰剂,溶剂采用四氢呋喃,二甲胺的体积含量为75%,修饰反应控制在 6(TC,反应时间为3小时。反应结束后,采用四氢呋喃冲洗整体床。本发明所合成的整体床 中75%以上的孔其孔径在十微米以上,整体床的修饰密度约为0.5mmol/g整体床。实施例3:称取单体丙烯酸縮水甘油酯、交联剂二乙烯基苯和三聚异腈尿酸三烯丙酯(1: 0.06:0.03 mol/mol/mo1);致孔剂二甲苯(致孔剂/反应混合物60 vol% );引发剂偶氮二异庚腈(弓I发剂/ 单体0.02:1 mol/mo1),混合均匀,装入一端密封的50x4.6mm不锈钢管中,将另一端密封, 于6(TC反应12小时。将整体床连接到泵上,甲醇冲洗。然后利用乙胺为修饰剂,溶剂采用 甲醇,乙胺的体积含量为30%,修饰反应控制在55'C,反应时间为6小时。反应结束后,采 用甲醇冲洗整体床。本发明所合成的整体床中75%以上的孔其孔径在十微米以上,整体床的 修饰密度约为0.9mmol/g整体床。实施例4:称取单体丙烯酸环氧乙酯、交联剂二乙烯基苯基甲垸和三甲基丙烯酸丙三醇酯(1:0.04:0.16 mol/mol/mol);致孔剂正壬垸(致孔剂/反应混合物40 vol%);引发剂偶氮二异庚腈 (引发剂/单体0.03:1 mol/mo1),混合均匀,装入一端密封的50x4.6mm不锈钢管中,将另一 端密封,于6(TC反应12小时。将整体床连接到泵上,二噁烷冲洗。然后利用乙二胺为修饰 剂,溶剂采用二噁烷,乙二胺的体积含量为50%,修饰反应控制在55'C,反应时间为4小时。反应结束后,采用二噁烷冲洗整体床。本发明所合成的整体床中75%以上的孔其孔径在十微 米以上,整体床的修饰密度约为0.7mmol/g整体床。
权利要求
1.一种用于裂解液分析的整体床的合成方法,其特征在于该方法包括如下步骤1)将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与交联剂、致孔剂和引发剂混合,得到反应混合物,其中a.所述交联剂与单体的物质的量的比为0.05~0.2;b.所述致孔剂用量占反应混合物体积含量的40~80%;c.所述引发剂与单体的物质的量的比为0.005~0.03;2)将上述反应混合物超声混和均匀,加入到色谱柱管中,原位聚合形成整体床,聚合温度控制在50~60℃之间,反应时间为12~72小时;3)聚合反应结束后,利用有机溶剂冲洗整体床;4)利用溶于有机溶剂的胺类修饰剂对整体床进行改性,其中胺类修饰剂的体积含量为25~75%,修饰温度控制在50~60℃之间,反应时间为3~9小时;5)修饰反应结束后,利用有机溶剂冲洗整体床。
2. 按照权利要求1所述的一种用于裂解液分析的整体床的合成方法,其特征在于所 述交联剂采用含有两个双键的化合物和三个双键的化合物的混合物,两类交联剂的物质的量的比为0.25 4;所述的致孔剂采用饱和烷烃和芳烃中的至少一种;所述的引发剂采用偶氮类物质;所述的有机溶剂为醇类和环醚类中的任一种。
3. 按照权利要求2所述的一种用于裂解液分析的整体床的合成方法,其特征在于所 述含有两个双键的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲垸和双甲基丙烯酸乙二醇酯中的 任一种;所述含有三个双键的化合物采用三聚异腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯和三甲基丙烯 酸丙三醇酯中的任一种。
4. 按照权利要求2所述的一种用于裂解液分析的整体床的合成方法,其特征在于所 述偶氮类物质采用偶氮二异丁腈和偶氮二异庚腈中的任一种。
5. 按照权利要求2所述的一种用于裂解液分析的整体床的合成方法,其特征在于所 述饱和烃采用正庚烷、正辛垸和正壬垸中的任一种;所述芳烃采用甲苯、乙苯和二甲苯中的 任一种。
6. 按照权利要求2所述的一种用于裂解液分析的整体床的合成方法,其特征在于所述醇类采用乙醇或甲醇;所述环醚类采用四氢呋喃或二噁烷。
7. 按照权利要求2所述的一种用于裂解液分析的整体床的合成方法,其特征在于所述胺类修饰剂采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一种。
全文摘要
一种用于裂解液分析的整体床的合成方法,属于生物分子分析和色谱分析技术领域。该方法将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与交联剂、致孔剂和引发剂混合,得到反应混合物;然后将上述反应混合物超声混和均匀,加入到色谱柱管中,原位聚合形成整体床;聚合反应结束后,利用有机溶剂冲洗整体床;利用溶于有机溶剂的胺类修饰剂对整体床进行改性;修饰反应结束后,利用有机溶剂冲洗整体床。实现该发明的关键点在于控制整体床的孔结构和修饰密度。采用本方法所合成的整体床在裂解液分析中可以对于未经预处理的含有大量杂质的裂解液进行分析,分析过程方便快捷,成本低。
文档编号G01N30/00GK101625346SQ20091009037
公开日2010年1月13日 申请日期2009年8月7日 优先权日2009年8月7日
发明者张敏莲, 青 徐, 花秀夫 申请人:清华大学