专利名称：固定化pH梯度毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方法
技术领域：
本发明为固定化pH梯度毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方 法，属于生物分析领域。
背景技术：
微生物具有表面电荷和两性特性，具有等电点(pl)。微生物表面 电荷和等电点特性是由微生物细胞膜或细胞壁表面的氨基酸残基、糖 蛋白和脂类等分子的总体带电性质所决定。因此，不同微生物以及不 同生长代谢状态时的微生物均可用其表面电荷特性以及等电点特性 进行表征。研究微生物表面电荷的带电特征，可表征微生物自身的生 理生化特性，并对研究其生长代谢状态、检测和表征微生物表面的生 化反应等具有重要的理论和应用价值。目前生物学研究上尚没有确定 微生物等电点的测定方法报道。
毛细管等电聚焦可基于蛋白质等目标分子等电点的差异进行蛋 白质的分离和鉴定。近年来有报道将毛细管等电聚焦电泳应用于微生 物相关研究。已报道方法是将微生物样品与等电点标记物共同进行等 点聚焦，以初步分离等电点不同的微生物，并根据微生物样品和等电 点标记物的相对迁移时间估算其等电点范围。因所用两性电解质具有 很强的紫外背景吸收，且两性电解质在毛细管内分布不均，若使用电 渗流驱动微生物在管内迁移等将导致微生物的紫外检测信号不稳定 和高背景噪音信号，因此大大降低微生物检测的稳定性和灵敏度。目 前生物学上尚没有通用的确定微生物等电点的测定方法和报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决微生物问题，而提供一种固定化pH梯 度的毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的本发明的一种固定化pH梯度的毛细管等电聚焦测定微生物等电 点的方法，具体测量步骤为
1) 首先对毛细管进行预处理，依次用0.1MHC1冲洗10min以 上、水冲洗5min以上、1 M NaOH冲洗20min以上、0.1 M NaOH 冲洗20min以上、水冲洗20min以上及甲醇冲洗20min以上，氮气 吹干后备用；将异氰酸酯加入无水吡啶溶液后注入毛细管中，在 65 75"C反应12小时以上，使异氰酸酯键合于毛细管内壁；再依次 用甲苯，甲醇，三蒸水，20mM pH7.0的磷酸盐缓冲液冲洗毛细管内 壁，各冲洗10min以上；
其中毛细管为石英熔融毛细管，内径50 200|im，长度20 100cm， 其一端烧制检测窗口，通过紫外检测器检测样品，异氰酸酯与无水吡 啶溶液比例范围为0.3: 5~10。
2) 将载体两性电解质溶液(Ampholine)以1% 5%体积比溶于 20 mM磷酸盐缓冲液中，将混合溶液注入毛细管；将靠近检测窗口 的一端插入阴极缓冲液，另一端插入阳极缓冲液，然后加10~25KV 的恒定电压进行等电聚焦，待电流稳定后聚焦完成，将毛细管两端插 入去离子水中，静置反应12小时以上，使毛细管内壁上形成连续pH 梯度的两性电解质；
其中阴极缓冲液15~20mM的NaOH溶液，阳极缓冲液为 15~20mM的H3P04溶液。
3) 将上步制得的毛细管用pH7.0的磷酸盐缓冲液冲洗lh以上； 将样品微生物加入pH7.0的磷酸盐缓冲液中制备成浓度为 104~105cfu/ml样品溶液，将样品溶液注入毛细管中，采用10-25KV 的恒定电压等电聚焦；待电流平稳后，聚焦完成，停止加电压；用固 定气压，将毛细管内样品从聚焦段匀速推动经过检査窗口，记录对样 品开始加压到经过检测窗口的时间。
4) 再次注入样品，求出采用步骤3)中的固定气压使样品从毛 细管注入端流经检测窗口的时间，由于毛细管长度已知，从而得到该 固定气压下样品溶液在毛细管内的匀速迁移速度，再很据步骤3)得到的样品开始加压到经过检测窗口的时间，求出该固定气压下样品从 聚焦点到经过检测窗口的距离，即可求得聚焦点到进口端的距离L 差；
5) 根据pH梯度与毛细管长的线性关系，求出聚焦点的pH值
的表示公式
pH求二pH始+pH差(L差/L总)
其中"pH始"表示选用载体两性电解质溶液的pH最小值，"pH差" 表示选用载体两性电解质溶液的pH范围差；"L差"表示聚焦点到进 口端的距离；"L总"表示毛细管的总长度；
6) 将步骤4)求得的"L差"代入线性方程即可求出样品在聚焦点 出的pH值。
本发明的有益效果是
1) 采用固定化pH梯度，可以在毛细管内壁形成稳定连续的pH 梯度，避免在溶液中使用两性电解质形成动态pH梯度，避免使用pl 标记物进行管内等电点标定。压力驱动样品迁移，避免了两性电解质 共同迁移对微生物检测的干扰。
2) 使用气压驱动样品移动，不需使用电场及电渗流驱动，使样 品迁移速度加快，縮短检测时间，提高分析效率。
3) 该方法采用化学键合连接两性电解质，两性电解质被固定在 毛细管内壁，不随气压驱动而移动，因此检测基线平稳。固定化后的 pH等电聚焦，不需在毛细管内加入两性电解质，因此提高了对微生 物的紫外检测灵敏度。
4) 在特定分析仪器及条件下(固定毛细管长度，有效长度，聚 焦电压，气压等)，只需测定一个分析参数即微生物样品迁移至检测 窗口的时间，便可计算其等电点。测定方法简单快速，可以精确检测 样品等电点。可用于多种微生物同时在线检测，对于微生物等电点检 测具有普适性。
图h检测微生物在毛细管中迁移速度的原理图； 图2:检测微生物等电点的原理图； 其中l-检测窗口。
具体实施例方式
将熔融石英毛细管(lOOpm i.d.毛细管柱长38.5，有效长度30cm， 检测窗口距出口端8.5cm)依次用0.1 M HC1冲洗10min、水冲洗 5min、 1 M NaOH冲洗20min、 0.1 M NaOH冲洗20min、水冲洗20min 及甲醇冲洗20min，氮气吹干后备用。将0.3ml异氰酸酯加入5ml无 水吡啶，混匀后用手动泵注入毛细管中，70。C下反应12h，使异氰酸 酯键合于毛细管内壁。反应后，依次用甲苯，甲醇，三蒸水，磷酸盐 缓冲液(PBS，20mMpH7.0)冲毛细管各冲洗10min。用手动泵向毛细 管内壁注入载体两性电解质溶液(Ampholine pH 3.5-10.0，以4°/。体积 比溶于20 mM磷酸盐缓冲液溶液中)。阴极缓冲液为20 mM NaOH 溶液，阳极缓冲液为20mM H3P04溶液，15kV下聚焦。聚焦10min 后电流平稳，聚焦完成，将毛细管两端用三蒸水封闭，静置12h进行 反应，使pH梯度固定在毛细管内壁。
将E. coli JM83菌种接到普通LB培养基中，37"C摇床培养12 h。 培养好的样品经离心机分离(3400 r/ min , 5 min)，弃去上清液，加入 去离子水洗涤。离心、洗涤3次，以除去残留培养基。将沉淀的微生 物样品用PBS缓冲液制成菌悬液，即活菌微生物样品。
在固定化pH梯度毛细管柱进口端加入少量样品，加50mbar气 压，记录开始加压推动时间，记录样品到达检测窗口的时间t=3.1min。 已知毛细管进口端距离检测窗口的距离L，=30cm，可知恒定气压条件 下样品匀速运动的迁移速度V=L，/t=30cm/3.1min=9.68cm/min。(图1)
在恒定气压条件下，将微生物样品从毛细管进样端注满毛细管， 加15kV电压等电聚焦，聚焦10min后电流稳定，聚焦完成，停止电 压。用50mbar恒定压力，推动毛细管内样品经过检测窗口 。从开始 加压到微生物样品经过检测窗口的时间为T=1.2min。可计算样品聚焦点距离检测窗口的距离为L"= VxT=9.6xl.2=11.6cm。(图2)
等电聚焦的毛细管内存在稳定的连续的线性的pH梯度，即毛细 管长度和pH梯度存在线性关系。实验中pH梯度固定化后的毛细管 柱长为38.5cm、 pH范围3.5 10，求出线性关系为y=0.1688x+3.5。将 X=L-1;，=30-11.6=18.4，带入上述线性方程，求得聚焦点对应pH值 Y为6.6，即样品等电点为6.6。
权利要求
1、固定化pH梯度的毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方法，其特征在于具体测量步骤如下1)首先对毛细管进行预处理，依次用0.1M HCl冲洗10min以上、水冲洗5min以上、1MNaOH冲洗20min以上、0.1MNaOH冲洗20min以上、水冲洗20min以上及甲醇冲洗20min以上，氮气吹干后备用；将异氰酸酯加入无水吡啶溶液后注入毛细管中，在65～75℃反应12小时以上，使异氰酸酯键合于毛细管内壁；再依次用甲苯，甲醇，三蒸水，20mM pH7.0的磷酸盐缓冲液冲洗毛细管内壁，各冲洗10min以上；2)将载体两性电解质溶液(Ampholine)以1％～5％体积比溶于20mM磷酸盐缓冲液中，将混合溶液注入毛细管；将靠近检测窗口的一端插入阴极缓冲液，另一端插入阳极缓冲液，然后加10～25KV的恒定电压进行等电聚焦，待电流稳定后聚焦完成，将毛细管两端插入去离子水中，静置反应12小时以上，使毛细管内壁上形成连续pH梯度的两性电解质；其中阴极缓冲液15～20mM的NaOH溶液，阳极缓冲液为15～20mM的H3PO4溶液；3)将上步制得的毛细管用pH 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗1h以上；将样品微生物加入pH7.0的磷酸盐缓冲液中制备成浓度为104～105cfu/ml样品溶液，将样品溶液注入毛细管中，采用10～25KV的恒定电压等电聚焦；待电流平稳后，聚焦完成，停止加电压；用固定气压，将毛细管内样品从聚焦段匀速推动经过检查窗口，记录对样品开始加压到经过检测窗口的时间；4)再次注入样品，求出采用步骤3)中的固定气压使样品从毛细管注入端流经检测窗口的时间，由于毛细管长度已知，从而得到该固定气压下样品溶液在毛细管内的匀速迁移速度，再很据步骤3)得到的样品开始加压到经过检测窗口的时间，求出该固定气压下样品从聚焦点到经过检测窗口的距离，即可求得聚焦点到进口端的距离L差；5)根据pH梯度与毛细管长的线性关系，求出聚焦点的pH值的表示公式pH求＝pH始+pH差(L差/L总)其中“pH始”表示选用载体两性电解质溶液的pH最小值，“pH差”表示选用载体两性电解质溶液的pH范围差；“L差”表示聚焦点到进口端的距离；“L总”表示毛细管的总长度；6)将步骤4)求得的“L差”代入线性方程即可求出样品在聚焦点出的pH值。
2、如权利要求1所述的固定化pH梯度的毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方法，其特征在于其中毛细管为石英熔融毛细管，内径50 200|im，长度20 100cm，其一端烧制检测窗口，通过紫外检测器检测样 品；异氰酸酯与无水吡啶溶液比例范围为0.3: 5~10。
全文摘要
本发明涉及一种毛细管电泳用于微生物等电点的测定方法，属于生物分析领域。本发明首先将载体两性电解质溶液在毛细管内采用恒定电压进行等电聚焦，使毛细管内壁上形成连续pH梯度的两性电解质；其次将样品溶液注入毛细管中，采用恒定电压等电聚焦；然后采用固定气压，将毛细管内样品从聚焦段匀速推动经过检查窗口，可确定样品聚焦点的位置；最后根据pH梯度与毛细管长的线性关系，求出聚焦点的pH值。本方法可用于多种微生物同时在线检测，对于微生物等电点检测具有普适性。
文档编号G01N27/447GK101556260SQ20091008483
公开日2009年10月14日 申请日期2009年5月25日 优先权日2009年5月25日
发明者锋 屈, 蔡波太, 马文韬 申请人:北京理工大学