专利名称：水环境中致病菌超敏感检测技术的利记博彩app
技术领域：
本发明属于微生物检测技术，尤其是对水环境中致病菌的超敏感检测技术范畴。 本发明涉及一套能够检测肠出血大肠杆菌0157 H7、沙门氏菌、志贺氏菌、嗜肺军团菌和 变形杆菌的技术，并且该套技术可用于实际水环境中的检测。
背景技术：
水是人类赖以生存的物质，不仅供人们饮用和生活用水，同时还是人和动物机体 排泄物、生产和生活污水等的排放场所，因此，水中的微生物多种多样。水中对人类健康威 胁最大的是致病菌历史上，曾发生过多次世界范围的霍乱大流行；在印度由于恒河水被 非0-1群霍乱弧菌(0139)污染而导致了新的霍乱流行；此外，由于自然灾害、战争、制裁、经 济落后所导致的卫生状况恶化、饮用水质下降而造成其它细菌性疾病(如伤寒、菌痢、腹泻 等)的暴发流行也十分常见。根据WHO年度报告，亚(不包括中国)、非、拉各洲仅小于5岁 的儿童每人每年发生腹泻2. 2次，细菌性腹泻的病例多达1. 5-2. 5亿人；而我国每年肠道传 染病的报告病例数多达100万人次(实际发病人数可能远超过这些)，占全部35种法定传 染病报告病例数总数的80%以上。目前，虽然城镇卫生水平有明显提高，但由于生活方式的 改变，仍然存在引起介水细菌学疾病的隐患，军团杆菌介空调冷却水进行传播和致病就是 其中一例。此外，据调查一些家庭使用纯水机、桶装水、矿泉水，由于其暴露时间长，导致二 次污染，仍有25%的水样细菌总数或大肠菌群超标。传统的细菌学检验方法主要是细菌培养和生化鉴定法，要经过前增菌、选择性培 养及生化反应鉴定等，完成这些检验需要数天时间，而且操作繁琐。有时在某些标本中，可 能因含有某些干扰物质而降低目标菌的检出率。免疫荧光技术、酶联免疫技术、放射免疫技 术等免疫学方法具有快速、特异等优点，但操作仍然比较复杂，或敏感性偏低、或存在放射 性污染等。分子生物学方法中的DNA探针杂交技术，虽然提高了检测的特异性，但操作步骤 较多，所需时间也较长。特别是肠道致病菌的属、种和型别很多，所以快速、系统的检出水中 肠道致病菌的方法尚有待建立。PCR技术以其敏感、特异、操作简便、快速等特点，一经建立就受到广泛重视和应 用。在微生物学检验方面已有较多的研究报道。但常规PCR —次只能检出一种或几种病源 微生物，而且常常集中于对模拟样品中的人工污染病源微生物的验证性检测。而水中往往 同时含有多种致病菌或病毒，如果遭到生物恐怖袭击则微生物相更复杂。病原微生物的超灵敏检测方法主要集中在致病菌的检测。实时荧光定量PCR(Real timePCR)不仅可以提高检测的敏感性(10 100CFU/ml)，而且可以进行定量检测，目前已 经用于致病细菌的检测。但存在的问题是，①水中致病细菌的检测敏感性偏低；②检测时需 要分离到纯菌落，若直接从水中提取核酸，则敏感性仍较低。最近，英国科学家在“新科学 家”杂质发布消息称英国科学家研制出一种基于玻璃银电极的免疫传感器，通过对流动样 品中的检测，可以在IOmin内检测到只有4个细胞的大肠杆菌0157 H7，但他们所检测的 样品是肉汤中的纯培养细菌，而不是实际样品。随着纳米技术的发展，人们建立了基于纳米技术的超灵敏微生物检测新技术。据报道，这一技术结合荧光标记技术，可以检测到单一的 致病菌，在微生物界引起了较大反响。然而，对于复杂样品中的致病菌，这一技术仍无法达 到实际应用的水平。
发明内容
本发明的目的是针对现有水环境中致病菌检测技术灵敏度不能满足现实需要，而 提供一种超敏感的检测水环境中致病菌技术，本发明的技术方案如下一种水环境中致病菌超敏感检测技术方法，由如下步骤组成(1)制备5种细菌的多克隆抗体分别利用大白兔和昆明小鼠制备5种致病菌的多克隆抗体，ELISA法测定效价 1 10000 1 200000，采用饱和硫酸铵法和金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)亲和层析法纯 化制备的多克隆血清；(2)免疫纳米磁颗粒的制备采用化学共沉淀法制备粒径为IOnm IOOnm的纳米磁颗粒，取纯化好的浓度为 0. 2mg/mL 1. Omg/mL某种致病菌兔多克隆抗体连接到ImL纳米磁颗粒上制成免疫纳米磁颗粒。(3)免疫胶体金的制备胶体金采用柠檬酸钠还原法制备，制备粒径为IOnm 20nm的胶体金，将浓度为 0. 2mg/mL 1. Omg/mL的羊抗兔IgG连接至胶体金上即为免疫胶体金。(4)压电传感器的检测①石英晶振用piranha液进行洗涤，取浓度为0. 2mg/mL 2. Omg/mL的SPA溶液 10 μ 1固定于压电传感器的石英晶振10 90min，检测频率变化。确定SPA的最佳固定浓 度和时间后，取浓度为0. lmg/mL 1. 8mg/mL的致病菌鼠多克隆抗体溶液10 μ 1固定于压 电传感器的石英晶振10 90min，检测频率变化。确定致病菌鼠多克隆抗体的最佳固定浓 度和时间。②按最佳固定浓度和最佳固定时间分别将SPA和抗体固定于压电传感器的石英 晶振上，将不同浓度的致病菌液滴加于石英晶振上，检测频率变化；取10μ 1免疫磁颗粒滴 加于石英晶振上，检测频率变化；取10 μ 1免疫胶体金滴加于石英晶振上，检测频率变化。 最后得出5种致病菌的检测限。本发明水环境中检测某种致病菌技术及应用，压电免疫传感器通过SPA法将抗体 固定于石英晶振上，两种免疫纳米颗粒借助不同的抗体连接于传感器上对检测频率信号进 行放大，从而提高检测灵敏度，达到对水中致病菌的超敏感检测。该发明具有于操作简便、 快速，而且只要更换检测中的抗体就可以检测不同的微生物的特点，在微生物的检测中具 有广阔的前景。
图1为本发明水环境中检测某种致病菌的示意图。图2为本发明的压电传感器的石英晶振固定了不同物质后在原子力显微镜下的 图片。
具体实施例方式下面结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。实施例1(1)制备肠出血大肠杆菌0157 H7的多克隆抗体制备肠出血大肠杆菌0157 H7抗原。兔耳缘静脉注射免疫兔子，每次注射抗原浓 度均为60亿/mL，首次注射1. OmL/只，第二、三次注射1. 5mL/只，第四、五次注射2. OmL/只， 每次间隔4天，末次注射后7天，耳静脉采血，用ELISA法测效价。当效价达到1 10000 1 120000，颈动脉采血。小鼠尾静脉注射免疫小鼠，每次注射抗原浓度均为60亿/mL，首 次注射0. ImL/只，第二、三次注射0. 2mL/只，第四、五次注射0. 4mL/只，每次间隔4天，末 次注射后7天，眼静脉采血，用ELISA法测效价。当效价达到1 10000 1 120000，断 头采血。采用饱和硫酸铵法和SPA亲和层析法纯化制备的多克隆血清，将纯化抗体浓度定 为2. Omg/mL保存。(2)免疫纳米磁颗粒的制备①将0. 7mol/L 的 FeCl3 · 6H20 水溶液 16mL 与 1. 6mol/L FeCl2 · 4H20 水溶液 4mL 混合，在氮气氛下，滴加至20mL的50%的葡聚糖T-40水溶液中，所述葡聚糖T-40水溶液 的浓度为g/mL百分比浓度，混合，60°C，水浴20min，在500rpm的搅拌下，20min内，向混合 液中滴加5mol/L的氨水40mL，温度保持60°C，并始终通氮气，制成悬液；然后用去离子水透 析24h。离心管离心，2100rpm，15min，保留上清(阻氧避光保存)，所制得的磁颗粒其核心 大小约为5nm，整个磁颗粒的大小约为50nm。②游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗 粒分离，洗脱平衡液为pH为7. 4的0. Olmol/L磷酸盐缓冲液，收集的颗粒冷冻干燥，使葡聚 糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/mL ；取葡聚糖纳米磁颗粒悬液1. OmL，加入20mmol/L NaIO4 水溶液0. 25mL, 150转/分钟避光阻氧震荡6h后，加入2mol/L乙二醇的水溶液0. 2ImL终 止氧化，PH为7. 4的0. 01mol/L磷酸盐缓冲液4°C透析24h，去除过量的NaIO4,使葡聚糖纳 米磁颗粒悬液的浓度为5. 5mg/mL ；③取(1)中制备的肠出血大肠杆菌0157 H7兔多克隆抗体0.3mL，其浓度为 0. 5mg/mL,加入到②中的ImL磁颗粒中，混勻后，放入冰箱过夜(避光)，次日，每mL颗粒加 0. 2mL的0. 5M甘氨酸溶液，过夜，备用。(3)免疫胶体金的制备取247. 5ml水放入500mL锥形瓶中，用微波炉加热5min ；然后迅速加入15ml的 柠檬酸三钠溶液，继续加热4min ；之后精确加入2. 5mL的氯化金贮备液加热6min。
取出锥形瓶，此时胶体金颜色为葡萄酒红色，其颗粒大小约为20nm，冷却后用0. 2%碳酸钾 溶液调PH值为8. 2，最后放入4°C冰箱中保存备用。利用试管观测法测得稳定胶体金最适 羊抗兔IgG量为18 μ g/mL。取调好pH值的胶体金25ml，加入浓度为0. 5mg/mL的羊抗兔 IgGO. 9ml，缓慢搅拌lOmin，加入牛血清白蛋白(BSA)，使其终浓度为1 %，继续搅拌IOmin以 上。将上面初步制得的胶体金探针以4000rpm离心20min，收集上清以IOOOOrpm 4°C离心 60min ；丢弃上清，留下管底为暗红色疏松状沉淀，沉淀用0. 005mol/L pH为7. 6的PB缓冲 液(含i%BSA，0.02%NaN3)重新悬浮，再同前离心洗涤一次。最后将沉淀用同前的PB缓冲液悬浮，置4°C冰箱保存备用(4)压电传感器的检测①先将石英晶振用piranha液(浓H2SO4M2O2 3/1，现用现配)进行洗涤，再用无 水乙醇和超纯水洗涤，每次5min，重复3次。石英晶振在固定物质之前在气相中进行基础频 率检测，固定物质之后进行洗涤，氮气吹干IOmin后在气相中进行频率检测，频率变化稳定 在+IHz间时计数。②石英晶振在检测基础频率&之后，取不同浓度的SPA溶液10 μ 1滴加于石英晶 振上，常温下固定60min。用超纯水洗涤石英晶振5min，再用PBS(0.01mol/L pH为7. 4)洗 涤5min，氮气吹干IOmin后进行频率测定，频率稳定后计数f\C，并计算其频移值(Δ f\C = f^-fo)。在确定SPA最佳固定浓度之后，取最佳浓度的SPA溶液10 μ 1滴加于石英晶振上， 固定不同时间后，进行频率测定，频率稳定后计数fj，并计算其频移值(Δ fj = fj-f0)，可 以得出SPA的最佳固定浓度和最佳固定时间分别为1. 2mg/mL和40min③按SPA最佳固定浓度和时间将SPA固定于石英晶振上，检测其频率为f1;取不同 浓度的肠出血大肠杆菌0157 H7鼠多克隆抗体溶液10 μ 1滴加于石英晶振上，置于水浴 锅中37°C下孵育60min，超纯水洗涤，氮气吹干IOmin后进行频率测定，计数为f2C，并计算 其频移值(Af2C = f2C-f\)。在确定抗体最佳固定浓度之后，取最佳浓度的抗体溶液10 μ 1 滴加于石英晶振上，固定不同时间后，进行频率测定，频率稳定后计数f2T，并计算其频移 值(Af2T = fj-fi)，可以得出抗体的最佳固定浓度和最佳固定时间分别为1.0mg/mL和 60mino④将SPA和肠出血大肠杆菌0157 H7鼠多克隆抗体分别固定于石英晶振上后， 氮气吹干进行频率检测，频率稳定后计数为f2。再在其上滴加BSA溶液10 μ 1进行封 闭，37°C下孵育60min后洗涤，氮气吹干进行频率检测，频率稳定后计数为f2'。取不同浓 度的肠出血大肠杆菌0157 H7菌悬液10 μ 1分别滴加于石英晶振上，37°C下反应60min 后洗涤，氮气吹干进行频率检测，频率稳定后计数为f3，并计算其频移值(Af3 = f3"f2')。 取制备好的免疫纳米磁颗粒10 μ 1滴加于石英晶振上，37°C下反应60min后洗涤，氮气吹干 进行频率检测，频率稳定后计数为f4，并计算其频移值(Δ f4 = f4-f3)，这是对检测频率信号 进行了 1级放大。继续利用免疫胶体金对检测频率信号进行2级放大，取制备好的免疫胶 体金10 μ 1滴加于石英晶振上，37°C下反应60min后洗涤，氮气吹干进行频率检测，频率稳 定后计数为f5，并计算其频移值(Δ f5 = f5-f4)。压电免疫传感器检测浓度为7. 8 X IO8Cfu/ ml的肠出血大肠杆菌0157 H7菌悬液时，引起了 227. 6Hz的频率值下降，而当利用免疫纳 米磁颗粒对检测频率信号进行放大时，又引起了 296. 5Hz的频率值下降，当再次利用免疫 胶体金对检测频率进行第2次放大时，再次引起了 122. 2Hz的频率值下降，压电免疫传感器 总的频率值下降了 646.3Hz。可见两种纳米颗粒在压电免疫传感器的检测过程中具有非常 大的放大作用。压电免疫传感器检测不同浓度的大肠杆菌0157 H7菌悬液，以及分别利 用两种纳米颗粒进行放大引起的频率变化(Af3，Af4, Af5)。压电免疫传感器在没有两种 纳米颗粒放大作用下，其检测限为104cfu/ml，而经过两级放大后，检测下限增至为IO1Cfu/ ml ο实施例2水环境中致病菌的超敏感检测的方法，步骤同实施例1，将其中的步骤(1)肠出血大肠杆菌0157 H7用沙门氏菌取代；步骤(2)肠出血大肠杆菌0157 H7兔多克隆抗体 用沙门氏菌兔多克隆抗体取代；步骤(3)中肠出血大肠杆菌0157 H7鼠多克隆抗体用沙 门氏菌抗体取代；步骤(4)中肠出血大肠杆菌0157 H7菌悬液用沙门氏菌悬液取代进行 检测。实施例3水环境中致病菌的超敏感检测的方法，步骤同实施例1，将其中的步骤(1)肠出血 大肠杆菌0157 H7用志贺氏菌取代；步骤(2)肠出血大肠杆菌0157 H7兔多克隆抗体 用志贺氏菌兔多克隆抗体取代；步骤(3)中肠出血大肠杆菌0157 H7鼠多克隆抗体用志 贺氏菌抗体取代；步骤(4)中肠出血大肠杆菌0157 H7菌悬液用志贺氏菌悬液取代进行 检测。实施例4水环境中致病菌的超敏感检测的方法，步骤同实施例1，将其中的步骤(1)肠出血 大肠杆菌0157 H7用嗜肺军团菌取代；步骤(2)肠出血大肠杆菌0157 H7兔多克隆抗 体用嗜肺军团菌兔多克隆抗体取代；步骤(3)中肠出血大肠杆菌0157 H7鼠多克隆抗体 用嗜肺军团菌抗体取代；步骤(4)中肠出血大肠杆菌0157 H7菌悬液用嗜肺军团菌悬液 取代进行检测。实施例5水环境中致病菌的超敏感检测的方法，步骤同实施例1，将其中的步骤(1)肠出血 大肠杆菌0157 H7用变形杆菌取代；步骤(2)肠出血大肠杆菌0157 H7兔多克隆抗体 用变形杆菌兔多克隆抗体取代；步骤(3)中肠出血大肠杆菌0157 H7鼠多克隆抗体用变 形杆菌抗体取代；步骤(4)中肠出血大肠杆菌0157 H7菌悬液用变形杆菌悬液取代进行 检测。沙门氏菌、志贺氏菌、和变形杆菌在中国医学细菌保藏管理中心保存，保藏号分别 为CMCC50013、CMCC 51073、CMCC49032。按规定程序，研究人员可以从该所获得。嗜肺军团杆菌在中国疾病预防控制中心流行病研究所有保存，但无保藏号。按规 定程序，研究人员可以从该所获得。
权利要求
水环境中致病菌超敏感检测技术及应用，其特征是由如下步骤组成(1)制备5种细菌的多克隆抗体分别利用大白兔和昆明小鼠制备5种致病菌的多克隆抗体，ELISA法测定效价在1∶10000～1∶200000，采用饱和硫酸铵法和金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)亲和层析法纯化制备的多克隆血清；(2)免疫纳米磁颗粒的制备采用化学共沉淀法制备粒径为10nm～100nm的纳米磁颗粒，取纯化好的浓度为0.2mg/mL～1.0mg/mL某种致病菌兔多克隆抗体连接到1mL纳米磁颗粒上制成免疫纳米磁颗粒。(3)免疫胶体金的制备胶体金采用柠檬酸钠改良法制备，制备粒径为10nm～50nm的胶体金，将浓度为0.2mg/mL～1.0mg/mL的羊抗兔IgG连接至胶体金上即为免疫胶体金。(4)压电传感器的检测①石英晶振用piranha液进行洗涤，取浓度为0.2mg/mL～2.0mg/mL的SPA溶液10μl固定于压电传感器的石英晶振10～90min，检测频率变化。确定SPA的最佳固定浓度和时间后，取浓度为0.1mg/mL～1.8mg/mL的致病菌鼠多克隆抗体溶液10μl固定于压电传感器的石英晶振10～90min，检测频率变化。确定致病菌鼠多克隆抗体的最佳固定浓度和时间。②按最佳固定浓度和最佳固定时间分别将SPA和抗体固定于压电传感器的石英晶振上，将不同浓度的致病菌液滴加于石英晶振上，检测频率变化；取10μl免疫磁颗粒滴加于石英晶振上，检测频率变化；取10μl免疫胶体金滴加于石英晶振上，检测频率变化。最后得出5致病菌的检测限。
2.根据权利要求1所述的水环境中致病菌超敏感检测技术及应用，其特征是所述的5 种致病菌的多克隆抗体，ELISA法测定效价在1 100000 1 120000。
3.根据权利要求1所述的水环境中致病菌超敏感检测技术及应用，其特征是所述的纳 米磁颗粒粒径约为50nm，连接的抗体浓度要求为0. 5mg/mL。
4.根据权利要求1所述的水环境中致病菌超敏感检测技术及应用，其特征是所述的 胶体金改良法为微波炉方法，制备的胶体金粒径约为20nm，连接的羊抗兔IgG浓度要求为 0. 5mg/mL。
5.根据权利要求1所述的水环境中致病菌超敏感检测技术及应用，其特征是所述的 SPA的最佳固定浓度和最佳固定时间分别为1. 2mg/mL和40min ；抗体的最佳固定浓度和最 佳固定时间分别为1. Omg/mL和60min。5种致病菌的检测限为Io1CFUAiLq
全文摘要
本发明公开了一种水环境中致病菌的超敏感检测方法，其主要技术特点(1)采用化学共沉淀法制备粒径大小约50nm的磁颗粒，包被上致病菌的兔多克隆抗体制成免疫纳米磁颗粒；(2)采用柠檬酸钠还原法制备粒径大小约为20nm的胶体金，包被上羊抗兔IgG制成免疫胶体金。(3)利用SPA法将致病菌鼠多克隆抗体固定于压电传感器上，在两种纳米免疫颗粒的放大效应下对水中致病菌进行检测，使其检测限达到101cfu/ml。
文档编号G01N33/569GK101930002SQ20091006939
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月23日 优先权日2009年6月23日
发明者李君文, 王新为, 王景峰, 谌志强, 邱志刚, 金敏, 陈照立 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所