专利名称：一种刺槐属茎尖染色体的压片方法
技术领域：
本发明属于植物鉴定技术领域，涉及林木茎尖染色体压片的方法。特别适用于像 刺槐属等材质坚韧、分生组织细胞质和细胞间的果胶质含量丰富的林木茎尖染色体的 压片。
背景技术：
生物的许多性状都是由基因控制的，而基因主要是在细胞核内的染色体上。因此， 染色体发生形态结构或数量上的变化，都必然会引起生物的性状发生变异。远缘杂交、 辐射育种，单倍体育种、多倍体育种等是作物育种的重要途径之一，而鉴别其后代是 否真正的远缘杂种，属何种变异类型等，通过对染色体的遗传行为的分析，又是较为 准确和普遍的重要方法。因此，对植物细胞进行制片来观察染色体，是研究、识别生 物遗传及变异类型的重要手段和技术。研究表明染色体压片法是观察植物染色体最常 用的方法，也是研究染色体组型、染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的基 础。
有丝分裂期在整个细胞周期中所占的时间相对较短，有丝分裂制片的主要目的是 进行染色体鉴定，希望观察到更多分裂相，尤其是分裂中期相，通常要对材料进行不 同的预处理。预处理主要通过抑制和破坏纺锤丝的形成来获得更多的中期分裂相；同 时，预处理还可改变细胞质的粘度，促使染色体縮短和分散，便于压片和观察。常用 的预处理有物理法、化学法、混合处理法等。
植物细胞的细胞壁对细胞形态和结构起支撑和保护作用，分生组织的细胞壁结构 将分生细胞结合成一个整体，因此在压片之前需要采用适当方法软化或部分分解细胞 壁、除去细胞之间的果胶层使细胞间易于分离，这一操作称为解离。同时，解离也可 适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，便于观察染色体。
植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影响细胞分裂周期，同时不同植物有丝分裂高峰时间不尽相同。要经多次试验才能掌握某 一植物有丝分裂高峰期，以便得到更多的处于分裂中期的细胞。
根尖与茎尖是有丝分裂的高发部位，根尖由于取材方便，是观察植物染色体最常 用的材料。由于茎尖不好获得，且茎尖组织不易解离，较难制片。材质坚韧的林木茎 尖更难被解离，解离时间短，细胞不能很好的分散开；解离时间长，染色体会受到破 坏。目前根尖是制作染色体压片的常用材料，应用于剌槐属的茎尖制作染色体压片的 方法很少有文献报道。
发明内容
本发明的目的在于针对上述利用茎尖制作染色体压片的缺点与不足，提供一种刺 槐属茎尖染色体的压片方法。用于对不易解离的茎尖制备染色体压片。
本发明的方法特别适用于像刺槐属等材质坚韧、分生组织细胞质和细胞间的果胶 质含量丰富的林木茎尖染色体压片。
本发明所述的刺槐属包括二乔刺槐、8044、 8048、 83002、 3-1、金叶刺槐、韩 国四倍体、匈牙利四倍体、长叶刺槐等品种。
本发明的取材使用组织培养苗，通过压片和敲打使材料尽量分散。植物细胞分裂 周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影响细胞分裂周期，同 时不同植物有丝分裂高峰时间也不尽相同。
为实现上述目的本发明提供如下的技术方案
一种刺槐属茎尖染色体的压片方法，该方法包括如下步骤
(1) 取材将组织培养的刺槐幼苗茎尖，自茎尖处切取3-5毫米；
(2) 预处理将茎尖放到0. 002-0. 004M 8-羟基喹啉中，处理3-5小时；
(3) 固定用卡诺氏固定液固定24小时；
(4) 解离从固定液中取出刺槐茎尖，用蒸馏水漂洗，再放到IN HC1中，在60 'C水浴中解离6-8分钟；解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化 或部分分解，使细胞分散开呈单个分布，细胞质呈透明状，使染色体更好的被观察， 染色体也容易被分散压平，更好计数。
4(5)压片用蒸馏水漂洗解离后的材料，将材料移至清洁的载玻片上，用刀片自茎 尖处切取l毫米左右，以十字压片法覆以载玻片，然后分开两玻片。其中所述的十字 压片法指的是两个载玻片呈十字交叉、垂直放置，这样便于将两个载玻片分开，分开 后的两个载玻片上都有材料，可以制成两张片子，目的是让材料尽量分散，便于观察。 (6)染色在两玻片上各滴l-2滴卡宝品红染液进行染色，20-30分钟后加上盖玻
片，用吸水纸吸去多余的染液；
(7) 敲打在盖玻片上覆一层吸水纸，然后敲打l-2分钟；
(8) 镜检先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察、记数或拍照。 本发明所述的刺槐幼苗为生长旺盛的刺槐组培苗。当培养室温度在22 — 25'C时，
下午3_4时刺槐组培苗的细胞处于分裂旺盛期。
本发明所述的步骤(3)从预处理液转到固定液之前用蒸馏水漂洗3-5次。 本发明所述的步骤(4)中解离前将材料用蒸馏水漂洗3-5次。 本发明所述的步骤(7)中的敲打是指用带橡皮头的铅笔垂直敲打盖玻片。 本发明所述的方法可用于刺槐属等材质坚韧、分生组织细胞质和细胞间的果胶质 含量丰富的林木茎尖染色体压片。主要是因为材质坚韧的林木分生组织细胞间的果胶 质含量丰富，用HCL解离的时间短，不易将果胶质分解，致使细胞粘连在一起，不易 解离，在显微镜下观察不到染色体；用HCL解离的时间长，染色体会受到损坏，导致 染色体着色浅、不完整。而刺槐属等材质坚韧的林木需要解离很长时间，细胞才会呈 单个分布，这样染色体就遭到严重损坏。
本发明详细的刺槐属茎尖染色体压片方法包括如下步骤
1. 取材组织培养室温度在22 — 25'C时，于下午3 — 4时采取组织培养的刺槐幼 苗茎尖，用镊子将茎上的叶片及叶柄去除，自茎尖处切取3-5毫米。
2. 预处理将茎尖放到8-羟基喹啉0.002-0. 004M中，处理3-5小时。
3. 固定将从预处理液中取出的茎尖用蒸馏水冲洗3 — 5次，放入固定液中固定 24小时。如不立即进行压片，可将固定材料转入70%酒精中，在4。C冰箱中保存，保 存时间最好不超过二个月。所述的固定液为卡诺氏固定液，即用3份无水酒精，加入l份冰醋酸(现配现用)。
4.解离将从固定液中取出的茎尖用蒸馏水冲洗3 — 5次，再放到1NHC1中，在 60'C水浴中解离6-8分钟。
5. 压片用蒸馏水漂洗解离后的材料，移至清洁的载玻片上，用刀片自茎尖处切 取1毫米左右，以十字压片法覆以载玻片，用拇指用力下压使细胞充分分散(不要使 盖片移动)，分开两玻片。
6. 染色各滴1-2滴染液进行染色。染色20-30分钟后加上盖玻片，注意不要产 生气泡，用吸水纸吸去多余的染液。所述的染色液为卡宝品红染色液，其配制方法如
下
1) 原液A:称取3g碱性品红(Basic fuchsin)溶于100ml7(^乙醇中(可永久保 存)；
2) 原液B:取10ml原液A加入90ml5呢的苯酚水溶液，在37。 C条件下温育2-4h(该 溶液不稳定，应在2周内使用)；
3) 原液C:取55ml原液B加入6ml冰乙酸和6ml甲醛，充分混匀；
4) 卡宝品红染液取10-20ml原液C加入约80ml45W的冰乙酸和lg山梨醇(可 永久保存)。
7. 敲打在盖玻片上覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打(注意勿使玻片搓 动)l-2分钟，使材料分散压平，便于观察。
S.镜检先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察、记数或拍照。 调节可调节可变光栏与反光镜，使光线明暗合适，视场亮度适中。
本发明方法制作的染色体压片具有如下优点
1. 可操作性好，重复度高。
2. 使染色体压片中处于分裂中期的细胞多。
3. 可解决材质坚韧林木的茎尖染色体压片中材料的难解离、细胞不呈单个分布的 问题。
4. 使染色体压片中的染色体分散均匀、容易计数。5.染色均匀清晰，可解决材质坚韧林木的茎尖染色体压片中染色体染色颜色浅、 染色体不完整等问题。
图1刺槐组织培养苗茎尖染色体压片，解离6-8分钟，细胞呈单个分布，处于分 裂中期的众多细胞中期分裂相。
图2刺槐组织培养苗茎尖染色体压片，处于分裂前期的细胞和处于分裂中期姊妹 染色单体成对存在的细胞。
图3刺槐组织培养苗茎尖染色体压片，处于分裂中期姊妹染色单体成对存在的细胞。
图4、图5刺槐组织培养苗茎尖染色体压片，处于分裂中期，姊妹染色单体已经 分开，将要被拉向两极的细胞。
图6、图7刺槐大田苗茎尖染色体压片，解离30分钟，细胞连在一起，不呈单个 分布，大多处于细胞分裂间期，处于分裂中期的细胞少。由于组织不易解离，解离的 时间长，染色体受到破坏。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅为解释性的，决不意味着它 以任何方式限制本发明的范围。
其中卡宝品红染色液，其配制方法如下1)原液A:称取3g碱性品红(Basic fuchsin)溶于100ml7(^乙醇中(可永久保存)；2)原液B:取10 ml原液A加入90ml5% 的苯酚水溶液，在37° C条件下温育2-4h(该溶液不稳定，应在2周内使用)；3)原 液C:取55ml原液B加入6ml冰乙酸和6ml甲醛，充分混匀；4)卡宝品红染液取 10-20ml原液C加入约80ml45M的冰乙酸和lg山梨醇。 实施例1
二乔刺槐组培苗茎尖染色体压片
本例以二乔刺槐组培苗茎尖为样本来制备茎尖染色体压片，具体包括如下步骤
l.茎尖的取材组织培养室温度为25'C,于下午3时采取组织培养的二乔刺槐幼
7苗茎尖，用镊子将茎上的叶片及叶柄去除，自茎尖处切取3-5毫米。
2. 茎尖的预处理将茎尖放到8-羟基喹啉0.0035M中，处理3小时。
3. 茎尖的固定用镊子将茎尖从预处理液中取出，用蒸馏水冲洗3-5次，将茎尖 放入固定液中固定24小时。
4. 茎尖的解离用镊子将茎尖从固定液中取出，用蒸馏水冲洗3-5次，再放到 1NHC1中，在6(TC水浴中解离6分钟。
5. 茎尖的压片用镊子将茎尖从1NHC1中取出，用蒸馏水冲洗3-5次，用镊子 将茎尖移至清洁的载玻片上，用刀片自茎尖处切取l毫米左右，以十字压片法覆以载 玻片，用拇指用力下压使细胞充分分散，分开两载玻片。
6. 染色在两载玻片有材料的地方各滴1-2滴卡宝品红染液进行染色。染色20 分钟后加上盖玻片。
7. 敲打在盖玻片上覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打1分钟；使材料 分散压平，便于观察.
8. 镜检先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察、记数或拍照。 调节可调节可变光栏与反光镜，使光线明暗合适，视场亮度适中，其结果详见图l-4。 实施例2
二乔刺槐组培苗茎尖染色体压片
1. 茎尖的取材组织培养室温度为22'C，于下午4时采取组织培养的二乔刺槐幼 苗茎尖，用镊子将茎上的叶片及叶柄去除，自茎尖处切取3-5毫米。
2. 茎尖的预处理将茎尖放到8-羟基喹啉0.0025M中，处理5小时。
3. 茎尖的固定用镊子将茎尖从预处理液中取出，用蒸馏水冲洗3-5次，将茎尖 放入固定液中固定24小时。
4. 茎尖的解离用镊子将茎尖从固定液中取出，用蒸馏水冲洗3-5次，再放到 1NHC1中，在60'C水浴中解离8分钟。
5. 茎尖的压片用镊子将茎尖从1NHC1中取出，用蒸馏水冲洗3-5次，用镊子 将茎尖移至清洁的载玻片上，用刀片自茎尖处切取l毫米左右，以十字压片法覆以载
8玻片，用拇指用力下压使细胞充分分散，分开两载玻片。
6. 染色在两载玻片有材料的地方各滴1-2滴卡宝品红染液进行染色。染色30
分钟后加上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染液。
7. 敲打在盖玻片上覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打l分钟，使材料 分散压平，便于观察。
S.镜检先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察、记数或拍照。 调节可调节可变光栏与反光镜，使光线明暗合适，视场亮度适中，其结果详见图5。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述 申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施 例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明 亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。
权利要求
1、一种刺槐属茎尖染色体的压片方法，该方法包括如下步骤(1)取材采取组织培养的刺槐幼苗茎尖，自茎尖处切取3-5毫米；(2)预处理将茎尖放到0.002-0.004M8-羟基喹啉中，处理3-5小时；(3)固定用卡诺氏固定液固定24小时；(4)解离从固定液中取出刺槐茎尖，用蒸馏水漂洗，再放到1N HCl中，在60℃水浴中解离6—8分钟；(5)压片用蒸馏水漂洗解离后的材料，将材料移至清洁的载玻片上，用刀片自茎尖处切取1毫米左右，以十字压片法覆以载玻片，然后分开两玻片；(6)染色在两玻片上各滴1-2滴卡宝品红染液进行染色，20-30分钟后加上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染液；(7)敲打在盖玻片上覆一层吸水纸，然后敲打1-2分钟；(8)镜检先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察、记数或拍照。
2、 如权利要求1所述的压片方法，其中所述的刺槐幼苗为生长旺盛的刺槐组培苗。
3、 如权利要求1所述的压片方法，其中所述的取材为当组织培养室的温度为22-25 "C时，于下午3 — 4时取材；
4、 如权利要求1所述的压片方法，其中步骤(3)从预处理液转到固定液之前用蒸馏 水漂洗3-5次。
5、 如权利要求1所述的压片方法，其中步骤(4)中解离前将材料用蒸馏水漂洗3-5次。
6、 如权利要求1所述的压片方法，其中步骤(7)所述的敲打是指用带橡皮头的铅 笔垂直敲打盖玻片。
7、 如权利要求1所述的压片方法可用于材质坚韧、分生组织细胞质和细胞间的果 胶质含量丰富的林木刺槐属茎尖染色体的压片。
全文摘要
本发明提供了一种刺槐属茎尖染色体的压片方法，包括取材、预处理、固定、解离、压片、染色、敲打、镜检等步骤，其特点是在培养室温度22-25℃时，于下午3-4时采取长势旺盛的刺槐组培苗的茎尖，这时的细胞处于分裂旺盛期；预处理采用8-羟基喹啉0.002-0.004M处理3-5小时；用十字压片法压片；卡宝品红染色；用铅笔头敲打材料，使细胞尽量分散均匀。本发明的压片方法，操作容易，制片效率高，节省药物消耗，染色体分散均匀，易计数，很容易观察到染色体的中期分裂相，染色均匀清晰，特别适用于材质坚韧的林木材料的染色体压片。
文档编号G01N21/84GK101482515SQ200910067769
公开日2009年7月15日 申请日期2009年1月22日 优先权日2009年1月22日
发明者刘建华, 娜 张, 朱延林, 田淑芬, 苗博瑛, 黄建全 申请人:天津市林业果树研究所