专利名称：检测血液抗环瓜氨酸多肽抗体的试纸条及制备方法
技术领域：
本发明属于医学免疫应用领域，具体涉及到利用胶体金免疫层析技术检测抗环瓜 氨酸肽抗体的试纸条及其制备方法。
背景技术：
类风湿性关节炎又称类风关(RA)，RA是一种以关节组织或关节翳的异常生长而 引起的慢性多关节损伤为特征的系统炎症性疾病，导致无规则的关节丧失功能。最近的研 究显示RA患者的关节损伤出现在疾病开始两年后，早期有效治疗可以预防这一疾病的随 后进展。因此，早期诊断和早期治疗已成为重点。然而，RA患者在疾病早期并不总是显示 出典型的症状和现象，因为它们可能并不完全符合RA诊断标准，这就使得诊断变得困难起 来。RA因RF对应的IgG Fc段的自身抗体，以及其他抗体的出现而被划分为系统性自身免 疫性疾病中，迄今，RF是应用于临床的RA唯一血清学标志物。然而RF在RA中的敏感性在 60-80%之间，其特异性也相当低，因为RF在其他疾病中也可以被广泛而频繁地识别出来， 包括各种结缔组织疾病，慢性肝脏疾病和感染性疾病，甚至少数健康人群当中。因此RF被 应用于RA的诊断标准，然而它的早期诊断价值并不令人满意。最近几年，几个新的抗体已在RA患者中被发现，其临床特点和可能的病理角色也 已经呈现出来。特别是新的抗瓜氨酸蛋白自身抗体如filaggrin和它的环化形式(即环瓜 氨酸肽CCP)在RA患者中可以接受的敏感性和高度的特异性而备受关注，因此成为早期诊 断的标志物和关节损伤的前兆因子。最近研究已证实RA患者不但产生RF因子也会有其他 各种不同的抗体。尽管大多数抗体对于RA并非特异的，但瓜氨酸蛋白自身抗体(APF、AKA、 抗filaggrin抗体、抗CCP抗体和抗Sa抗体)仅在RA中被识别出来，抗CCP抗体因其高 度的敏感性和特异性尤其引起关注。抗CCP抗体是诊断RA，特别是早期RA的首选指标，适 用于难以确诊的RA和需鉴别诊断RA及其他炎症性关节炎和其他形式的多关节炎的诊断， 同时可以确认血清学RF阴性的RA。具体表现在以下四个方面1.抗CCP抗体对临床诊断 RA的准确性特异性95%，敏感性80% [1] ；2.抗CCP抗体可在多数首次就诊的RA患者检 出-出现在早期RA患者[2] ；3.抗CCP抗体滴度与疾病活动性相关-预示转归[3] ；4.持 续监测抗CCP抗体作为早期RA侵蚀性的进展指标[4]。目前抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体的检测方法为酶联免疫吸附法(ELISA)，目前市场 上商品化抗CCP抗体检测试剂盒主要为ELISA试剂盒。ELISA法操作程序烦琐，完成整个实 验过程需三小时左右，亦需要专业免疫学技术人员在实验室中进行实验操作，并且需经酶 标仪检测后读取实验结果，这在基层医疗机构的实验室和小型门诊中较难实现该项目的实 验检测，同时基于ELISA方法学易受各种温度和孵育时间等环境条件因素的影响，对试验 带来诸多不便。胶体金免疫层析法(gold-immunochromatography assay, GICA)是应用胶体金标 记技术，以胶体金作为示踪物，以条状纤维层析材料为固相，通过毛细效应使样品溶液在层 析条上泳动，使样品中的待测物与结合垫上胶体金标记物发生免疫反应，并与条状纤维层析材料上的抗原(或抗体)发生免疫反应而被截留，进而形成肉眼可见的紫红色条带，得到 直观的实验结果，达到快速检测的目的[5]。使用时只需要把样品加样到试纸条的样品垫 上，数分钟就根据检测线上紫红色条带出现与否来判断阴阳性结果。与其他检测方法相比， 稳定性好，操作人员无需培训，操作简便、快速，无需低温保存，储运方便。目前尚未有检测抗CCP抗体胶体金免疫层析法检测用试纸条。本发明将环瓜氨酸 肽引入到试纸条中，实现了高特异性、高灵敏度、高准确度的检测性能。判读结果简便，仅需 数分钟；为快速筛选RA实现早期诊断早期治疗提供条件；满足基层实验室、即时检测、床边 检测的需求。相比上述优点，现有的检测抗环瓜氨酸肽抗体的方法存在如下不足之处1.检测步骤烦琐，检测时间长；2.检测试剂需要冷藏运输和保存；3.检测需要特殊的仪器设备。例如，ELISA法需要酶标仪；4.不适合单人份操作，对于ELISA法需同时做标准品和阴阳性对照品，多人份同 时检测才能节省检测成本。
发明内容
本发明为了克服以上方法学的不足，将胶体金层析法应用到抗环瓜氨酸肽抗体的 检测中，同时首次将环瓜氨酸肽应用到胶体金层析法中，采用间接法来实现血浆以及血清 样本中的抗环瓜氨酸肽抗体的检测，大大降低了经济成本，实现高特异性、高灵敏度、高准 确性的检测性能，能快速、便捷地辅助诊断早期类风湿关节炎(RA)。本发明第一方面提供一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的试纸条，所述试纸条包括水平 方向上依次相互搭接粘贴在底板上的结合垫和硝酸纤维素膜，其中，所述结合垫包被有金 标抗体(a)和金标抗体(b)，所述硝酸纤维素膜有检测线和质控线，检测线包被可与抗环瓜 氨酸肽抗体特异性结合的检测抗原，质控线包被质控抗体(c)；其中，抗体(a)仅在与抗环瓜氨酸肽抗体结合的情况下与检测抗原结合；其中，抗体(b)不与抗环瓜氨酸肽抗体以及检测抗原结合。在一优选实施例中，所述试纸条还包括样品垫和/或吸水垫。在一优选实施例中，所述试纸条包括底板和从水平方向上看顺次相互搭接粘贴在 该底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。在一优选实施例中，所述结合垫上金标抗体(a)和金标抗体(b)的OD比为5 1 至 1 1，优选为 0D50 100/0D 10 40。在一优选实施例中，所述抗体(a)、(b)和(C)选自单克隆抗体或多克隆抗体，所 述单克隆抗体为鼠源或兔源，所述多克隆抗体为鼠源、兔源、马源、羊源或豚鼠源，其中抗体 (a)还可以为葡萄球菌A蛋白或链球菌G蛋白。在一优选实施例中，所述抗体(a)选自鼠抗人IgG、葡萄球菌A蛋白、链球菌G蛋白 和羊抗人IgG。在一优选实施例中所述抗体(b)和(c)选自选自羊IgG和抗羊IgG、兔IgG和抗兔 IgG、和鼠IgG和抗鼠IgG。在一优选实施例中，所述检测抗原为环瓜氨酸肽与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、亲合素、链霉亲合素、甲状腺球蛋白、匙孔血蓝蛋白、卵蛋白和人工合成的多聚赖氨酸。在一优选实施例中，所述抗原包括2 8个环瓜氨酸肽和连接所述肽的多聚赖氨 酸核心基质(MAP)，MAP可与载体蛋白连接，其中，各环瓜氨酸肽可为相同或不同的抗原表 位。优选为MAP-载体蛋白偶联物。本发明第二方面提供一种制备本发明试纸条的方法，所述方法包括以下步骤1)提供底板；2)提供结合垫，并用金标抗体(a)和金标抗体(b)包被该结合垫；3)提供硝酸纤维素膜，其中，所述硝酸纤维素膜有检测线和质控线，用可与抗环瓜 氨酸肽抗体特异性结合的检测抗原包被该检测线，用质控抗体(C)包被该检测线；和4)在所述底板上顺次相互搭接粘贴所述硝酸纤维素膜和结合垫，从而得到所述试 纸条。本发明也提供一种试剂盒，该试剂盒包括本发明的试纸条、加样器、和说明书。与现有的试纸条和检测方法相比，本发明优点包括 1.本发明首次将环瓜氨酸肽弓I入胶体金层析试纸条中，实现了快速简便地对早期 类风湿关节炎的辅助诊断。2.本发明所使用的检测抗原中，分枝环瓜氨酸肽的抗原决定族可不一样，检测抗 原表位多样化，提高了检测特异性。3.本发明的环瓜氨酸肽抗原很好地模拟了天然的表位构象，从而提高其对类风湿 关节炎的检测敏感度。4.本发明将环瓜氨酸肽与载体蛋白偶联形成大分子蛋白，使其能很好的包被于膜 上。另外，载体蛋白的引入，大大增加了瓜氨酸的表位空间，减少了免疫反应的空间位阻，提 高了检测灵敏度。5.与已公开的用于抗环瓜氨酸肽抗体检测的检测方法相比，将样品直接加样于试 纸条的样品垫后，5 IOmin即可观测结果；不需要任何特殊仪器，可实现床边检测和门诊 即时检测；操作简便，只需一步反应，操作人员无需培训，因此检测成本低；对温度无特殊 要求，无需冷冻，储存运输方便，室温下可保存12个月。
图1为本发明的侧面结构示意图。该试纸条是在支撑胶板(7)上顺次相互搭接地 粘贴样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(6)。所述的硝酸纤维素膜(3)有 检测线⑷和质控线(5)，检测线(4)包被有检测抗原，质控线(5)包被有抗体(C)。图2为本发明的检测结果示意图。加样后，反应3 5分钟后，如图2a和2b所 示，结果为阳性，表明血清中含有抗环瓜氨酸肽抗体；如图2c显示，结果为阴性，说明血清 中不含抗环瓜氨酸肽抗体；如图2d、2e显示，结果为试纸条失效，即质控线处不出现紫红色 条带，无论检测线处是否有条带出现，都说明试纸条失效。
具体实施例方式本发明第一方面涉及一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的试纸条，所述试纸条包括水平方向上依次相互搭接粘贴在底板上的结合垫和硝酸纤维素膜，其中，所述结合垫包被有金 标抗体(a)和金标抗体(b)，所述硝酸纤维素膜有检测线和质控线，检测线包被可与抗环瓜 氨酸肽抗体特异性结合的检测抗原，质控线包被质控抗体(C)；其中，抗体(a)仅在与抗环 瓜氨酸肽抗体结合的情况下与检测抗原结合；其中，抗体(b)不与抗环瓜氨酸肽抗体以及 检测抗原结合。在一优选实施方式中，本发明的试纸条还包括样品垫和/或吸水垫。可以采用本领域现有技术已知的各种材料来制备本发明所使用的底板、样品垫、 结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。可从市场上购得以下规格的产品，用于制备本发明的试纸 条
权利要求
一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括水平方向上依次相互搭接粘贴在底板上的结合垫和硝酸纤维素膜，其中，所述结合垫包被有金标抗体(a)和金标抗体(b)，所述硝酸纤维素膜有检测线和质控线，检测线包被可与抗环瓜氨酸肽抗体特异性结合的检测抗原，质控线包被质控抗体(c)；其中，抗体(a)仅在与抗环瓜氨酸肽抗体结合的情况下与检测抗原结合；其中，抗体(b)不与抗环瓜氨酸肽抗体以及检测抗原结合。
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条还包括样品垫和/或吸水垫。
3.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板和从水平方向上看 顺次相互搭接粘贴在该底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。
4.如权利要求1-3中任一项所述的试纸条，其特征在于，所述结合垫上金标抗体(a)和 金标抗体(b)的OD比为5 1至1 1。
5.如权利要求1-3中任一项所述的试纸条，其特征在于，所述抗体(a)、(b)和(c)选自 单克隆抗体或多克隆抗体，所述单克隆抗体为鼠源或兔源，所述多克隆抗体为鼠源、兔源、 马源、羊源或豚鼠源，其中抗体(a)还可以为葡萄球菌A蛋白或链球菌G蛋白。
6.如权利要求5所述的试纸条，其特征在于，所述抗体(a)选自鼠抗人IgG、葡萄球菌 A蛋白、链球菌G蛋白和羊抗人IgG。
7.如权利要求5所述的试纸条，其特征在于，所述抗体(b)和(c)选自选自羊IgG和抗 羊IgG、兔IgG和抗兔IgG、和鼠IgG和抗鼠IgG。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的试纸条，其特征在于，所述检测抗原为环瓜氨酸 肽与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、亲合素、链霉亲合素、甲状腺球 蛋白、匙孔血蓝蛋白、卵蛋白和人工合成的多聚赖氨酸。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的试纸条，其特征在于，所述抗原包括2 8个环瓜 氨酸肽和连接所述肽的多聚赖氨酸核心基质，其中，各环瓜氨酸肽可为相同或不同的抗原 表位。
10.一种制备权利要求1中所述的试纸条的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)提供底板；2)提供结合垫，并用金标抗体(a)和金标抗体(b)包被该结合垫；3)提供硝酸纤维素膜，其中，所述硝酸纤维素膜有检测线和质控线，用可与抗环瓜氨酸 肽抗体特异性结合的检测抗原包被该检测线，用质控抗体(c)包被该检测线；和4)在所述底板上顺次相互搭接粘贴所述硝酸纤维素膜和结合垫，从而得到所述试纸
全文摘要
本发明公开了胶体金层析法检测抗环瓜氨酸肽抗体的试纸条及其制备方法。所述试纸条包括底板(7)上顺次相互搭接地粘贴硝酸纤维素膜(3)、结合垫(2)、样品垫(1)、吸水垫(6)。硝酸纤维素膜上有检测区(4)和质控区(5)，检测区包被环瓜氨酸肽抗原，质控区包被可作为质控物的抗体，结合垫包被两种不同的胶体金标记抗体。本发明试纸条引入分枝环瓜氨酸肽，对样品垫和结合垫预处理进行工艺改进，发明了高灵敏度、特异性强的抗环瓜氨酸肽抗体试纸条，能快速筛选出阳性样本，对早期辅助诊断RA和疾病监测起重要作用。
文档编号G01N33/558GK101988924SQ20091005572
公开日2011年3月23日 申请日期2009年7月31日 优先权日2009年7月31日
发明者司徒维娜, 孙宏彬, 左宗宝, 张玥, 杨超文, 钱杰, 韩永俊, 高成秀 申请人:上海科新生物技术股份有限公司