专利名称：：一种纤维蛋白封闭剂的质量控制方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物药品或器械质量分析方法，具体是涉及一种测定以猪血为原料制备的纤维蛋白封闭剂中猪血纤维蛋白原和/或猪血白蛋白的含量的方法，属生物
技术领域：
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背景技术：
：纤维蛋白封闭剂(Fibrinsealant,FS)即纤维蛋白胶(FibrinGlue,简称FG)也叫生物胶，是一种生物蛋白制剂，最早应用于伤口止血。1909年Bergel首次报道了纤维蛋白粉的止血功能。以后纤蛋白封闭剂被广泛地在临床上使用，不仅用于出血控制，而且用于各种手术场合的手术室辅助物。近20年来，纤维蛋白胶逐渐应用于促进伤口愈合、封闭组织缺损、防止组织粘连,尤其作为某些药物的缓释载体,其作用日益受到人们重视。随着研究的深入，其作用机制也逐步被人们认识。FS是模拟人体自身凝血反应最后阶段，其成分组成及作用原理现今生产的纤维蛋白封闭剂，含A、B两种蛋白组份，组份A:包括纤维蛋白封闭剂主体胶及主体胶溶解液两部分，主要含高浓度的纤维蛋白原、白蛋白、凝血因子XIII;组份B则包括纤维蛋白封闭剂催化剂及催化剂溶解液，主要含白蛋白、凝血酶原和氯化钙。当B试剂的溶解液和催化剂混合后，Ca2+便将凝血酶原激活转化为凝血酶，凝血酶能水解纤维蛋白原，使之转化为纤维蛋白单体。单体由于负电荷减少，自发聚合成不稳定的可溶性纤维蛋白多聚体。同时，在Ca2+存在的条件下,凝血酶能激活因子XIII。因子xm能催化某些肽链间的残基共价结合,最后形成稳定的不溶性纤维蛋白多聚体。多聚体形成后，通过以下机理发挥止血、封闭、粘合作用(l)多聚体交织成网状，能网住红细胞及血小板，形成血凝块，发挥止血作用；(2)不溶性纤维蛋白多聚体形成后,其机械强度显著增强,可粘合组织及封闭缺损，同时能剌激毛细血管内皮细胞及成纤维细胞生长，并以纤维蛋白网为支架形成肉芽组织，从而促进伤口愈合；(3)纤维蛋白胶在创面形成的膜状凝胶能防止坏死组织细胞内溶酶体酶向细胞外泄漏,避免周围组织进一步受损，同时因减少创面出血，减轻机化程度,能防止组织粘连。此外，纤维蛋白胶还具有缓释作用的特性，可用纤维蛋白胶对药物进行缓释作用。纤维蛋白胶是模拟人体自身凝血反应最后阶段形成具有稳定三维结构的纤维蛋白多聚体，其三维网状结构也提供了较大的承载药物的表面积，其网眼间隙使药物按一定速率恒定释放,其吸收时间大约在2周左右，提供了足够长的药物局部支持时间,提高局部药物浓度，减少进入血液循环的药量。纤维蛋白封闭剂是一种从血液中提取的新型生物止血材料。目前，国外同类产品以人血为原料，本申请人首创开发出以猪血为原料的产品，避免了人血制品所带来的艾滋病、肝炎等血液传染病传播的危险。同时猪血资源丰富，猪的基因序列同人的基因序列极为相似，而携带人类的传染性疾病传播风险极小，极大的降低了成本，使产品具有很强的市场竞争力。但纤维蛋白封闭剂为蛋白质、多肽及无机盐组成，而该类产品目前质量控制在蛋白含量及纯度等技术指标方面水平较低，产品的蛋白含量多为以总氮量测定来反映总蛋白含量，对具体蛋白分子的含量不清楚，产品缺乏较为准确的量化数据。
发明内容本发明的目的在于提供一种新的纤维蛋体胶白封闭剂制剂的有效成分的含量测定方法。本发明的目的通过以下技术方案来实现的一种纤维蛋白封闭剂的质量控制方法，是通过高效液相色谱法测定纤维蛋白封闭剂的主体胶制剂、催化剂制剂中猪血纤维蛋白原和/或猪血白蛋白的含量。上述方法包括以下步骤进行一、供试品溶液的制备(l)纤维蛋白封闭剂的主体胶制剂供试品溶液的制备取580mg纤维蛋白封闭剂主体胶制剂，以每1mg加0.12.0ml量流动相溶解并定溶，摇匀即得；(2)纤维蛋白封闭剂催化剂供试品溶液的制备取360mg纤维蛋白封闭剂催化剂制剂，以每lmg加O.12.0ml量流动相溶解并定溶，摇匀，即得；二、对照品溶液的制备取猪血纤维蛋白原和/或猪血白蛋白对照品，加流动相溶解并定溶，摇匀，配成每lml分别含0.32.Omg、0.11.5mg的猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白或每lml含0.32.Omg的猪血纤维蛋白原或每lml含0.11.5mg的猪血白蛋白的溶液为对照品溶液；三、测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定，计算，即得主体胶制剂、催化剂制剂中猪血纤维蛋白原和/或猪血白蛋白的含量。所述的高效液相色谱测定法中色谱条件为以二醇键合相硅胶为填充剂；理论板数按猪血纤维蛋白原或猪血白蛋白峰计算，均不低于2000;以紫外光200-280nm检测，或差示折光率检测器检测；柱温为2040。C，流动相的流速0.21.0ml/min，最佳柱温25°C,最佳流动相的流速0.4ml/min。所述的步骤一至三中，流动相采用磷酸盐水溶液或磷酸盐缓冲水溶液，以20raraol/L磷酸钠水溶液作流动相为最佳条件。由上述方法确定得到每lg纤维蛋白封闭剂主体胶制剂中猪血纤维蛋白原与猪血白蛋白的标准含量分别为195.88416.33mg、84.24103.38mg;每lg纤维蛋白封闭剂催化剂制剂中猪血白蛋白的标准含量为225.82432.21mg。含量低于此标准含量的产品，在其他性状方面会出现质量问题。本发明的有益效果该含量测定方法能准确的测定原料、中间品、半成品及成品中的猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白的含量或二者之一的含量，可作为该产品质量控制的方法和依据，方法简便，可操作性强，重现性高，是控制纤维蛋白封闭剂主体胶与催化剂质量的有效方法。图l是猪纤维蛋白原、猪血白蛋白对照品HPLC色谱图2是生物纤维蛋白胶主体胶HPLC色谱图；图3是猪血白蛋白对照品HPLC色谱图；图4是生物纤维蛋白胶催化剂HPLC色谱图。具体实施例方式为了更加有效地控产品质量，本发明是对以猪血为原料制备的纤维蛋白封闭剂产品，用高效液相色谱法对产品中含量较高的成分猪血纤维蛋白原与猪血白蛋白的含量进行了测定研究，并且建立含量测定方法，用于控制产品质量。有关生物纤维蛋白封闭剂的质量研究报导不多，特别是用高效液相色谱法测定猪血为原料的纤维蛋白封闭剂中蛋白类成分的含量未见报导。为了有效地控制纤维蛋白封闭剂质量，本发明对纤维蛋白封闭剂中蛋白类成分的含量的HPLC测定方法进行了研究，并制定了其含量范围。猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白是纤维蛋白封闭剂产品中含量较高的二种成分，特别是猪血纤维蛋白原的含量可直接影响产品的成胶性能。所以建立纤维蛋白封闭剂制剂中猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白或其中之一的含量测定方法是控制其质量的一种有效方法。下面通过实施例进一步说明本发明的技术方案，但本发明并不限于此特定例子。实施例1高效液相色谱法测定纤维蛋白封闭剂的主体胶中猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白含量的方法的研究(1)仪器与试药仪器LC-IOAT高效液相色谱议(日本岛津公司)；色谱柱Protein-Pak頂300SW分子排阻色谱柱(美国Waters公司)；SPD-10A紫外检测器(日本岛津公司)；试药猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白对照品(广州倍绣生物技术有限公司制备提供)，纯度大于98%;蒸馏水(自制)，磷酸钠(分析纯，广东光华化学厂有限公司)；纤维蛋白封闭剂主体胶，编号081101、081103、081115、081213，广州倍绣生物技术有限公司制备提供，其它试剂均为分析纯。(2)对照品溶液与供试品溶液的制备对照品溶液的制备精密称取对照品猪血纤维蛋白原29.458mg、对照品猪血白蛋白9.825mg,置25ml的量瓶中，加流动相20nimol/L磷酸钠的水溶液溶解并定溶至刻度，摇匀，0.48um滤膜滤过，取续滤液，即得对照品溶液。供试品溶液制备精密称取50.421mg纤维蛋白封闭剂主体胶，置25ml的量瓶中，加流动相20mmol/L磷酸钠的水溶液溶解并定溶至刻度，摇匀，0.48ym滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；(3)色谱条件测定波长的选择取含量分别为0.1%的猪血纤维蛋白原与猪血白蛋白对照品溶液，分别置紫外光谱仪中，在200400nm范围内扫描，结果猪血纤维蛋白原与猪血白蛋白均在200280nm处有吸收，在220nm附近有较大吸收，考滤避免溶剂千扰作用，故选择220nm作为最佳检测波长。色谱柱Protein-Pak300SW，7.5X300mm，10ym(美国Waters公司)；流动相为20mraol/L磷酸钠的水溶液；流速0.4ml/min;紫外光220nm检测。图l是猪纤维蛋白原、猪血白蛋白对照品HPLC色谱图，其中A峰为猪血纤维蛋白原峰，B峰为猪血白蛋白峰；图2是生物纤维蛋白胶主体胶HPLC色谱图。(4)线性关系考察精密量取含猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白对照品溶液(1.178mg/ml、0.393mg/ml)，5、10、15、20、25ul,分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以进样量(yg)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表l。表l猪血纤维蛋白原线性关系实验数据(n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>A:Y=1848139.9X-2468082.5,R=0.9991B:Y=1300368.2X-161697.8，R=0.9996以上结果表明猪血纤维蛋白原在5.892Pg29.458ug范围内、猪血白蛋白在1.965lig9.825ug范围内，呈良好的线性关系。(5)精密度试验精密吸取猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白对照品溶液(1.178mg/ml、0.393mg/ml)20yl，重复进样6次，猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白峰面积值的RSD<2%，结果见表2。表2精密度试验数据(n=6)试验次数猪血纤维蛋白原平均值x猪血白蛋白平均值x1418406181051012524194237510603288341866542418904811057097310548458441910190105215745418742631054632964190889710538461RSD=0.09%RSD二O.32%试验证明，精密度良好。(6)稳定性试验取样品供试液分别于0小时，1小时，4小时，8小时，12小时，24小时，分别进样20ul，测得样品中猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白12小时内稳定，样品中猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白峰面积的RSD〈2M，结果见表3。表3稳定性试验数据(n=6)测定时间猪血纤维蛋白原平均值X猪血白蛋白平均值X018674952557645911851058955701664184568471842355955685125544333818535400549414312179400055512387RSD=1.53%RSD=0.69%试验结果表明，样品供试液在12小时内稳定性良好。(7)重现性试验照含量测定方法项下操作，对同一批样品(批号081101)6份进行测定，求得猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白的RSD分别为0.20%、0.19%。见表4表4重现性试验数据<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>24.492.5222.5885.139101.79试验结果表明猪血纤维蛋白原回收率在99.47—104.20%之间、猪血白蛋白回收率在95.03—102.12%之间，加样回收良好。(9)纤维蛋白封闭剂主体胶中猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白含量测定照上述含量测定的方法操作，测定了3批纤维蛋白封闭剂主体胶中猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白的含量，结果见表7。表7样品中猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白的含量测定结果(n=2)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>测得三批纤维蛋白封闭剂主体胶中每lg含猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白的含量分别在195.88416.33mg、84.24103.38mg之间。实施例2纤维蛋白封闭剂催化剂中猪血白蛋白的含量测定方法的研究(1)仪器与试药仪器LC-IOAT高效液相色谱议(日本岛津公司)；色谱柱Protein-PakTM300SW分子排阻色谱柱(美国Waters公司)；SPD-10A紫外检测器(日本岛津公司)；试药猪血白蛋白对照品(广州倍绣生物技术有限公司制备提供)，纯度大于98%;蒸馏水(自制)，磷酸钠(分析纯，广东光华化学厂有限公司)；纤维蛋白封闭剂催化剂，编号081101、081103、081115、081123、081213，广州倍绣生物技术有限公司制备提供，其它试剂均为分析纯。(2)对照品溶液与供试品溶液的制备-对照品溶液的制备精密称取对照品猪血白蛋白12.288mg,置25ml的量瓶中，加流动相20mmol/L磷酸钠的水溶液溶解并定溶至刻度，摇匀，0.48wm滤膜滤过，取续滤液，即得对照品溶液。供试品溶液制备精密称取20.520mg纤维蛋白封闭剂催化剂，置25ml的量瓶中，加流动相20mmol/L磷酸钠的水溶液溶解并定溶至刻度，摇匀，0.48um滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。(3)色谱条件测定波长的选择取含量为0.1%的猪血白蛋白对照品溶液，置紫外光谱仪中，在200400nm范围内扫描，结果猪血白蛋白在200280nm处有吸收，在220nm附近有较大吸收，考虑避免溶剂干扰作用，故选择220mn作为最佳检测波长。色谱柱Protein-Pak300SW，7.5X300面，10Pm(美国Waters公司)；流动相为20mmo1磷酸钠的水溶液；紫外光220ran检测；流速0.4ml/min。图3是猪血白蛋白对照品HPLC色谱图，B峰为猪血白蛋白峰；图4是生物纤维蛋白胶催化剂HPLC色谱图。(4)线性关系考察精密量取猪血白蛋白对照品溶液(0.4915mg/ml)，5、10、15、20、25nl，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以进样量(wg)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表8。表8猪血白蛋白线性关系实验数据(n=5)猪血白蛋进样量(Ug)2.4584.9157.3739.83012.288白峰面积2956791656560998825321281559116002852C:Y=1316056.4X-58345.4，R=0.9993以上结果表明猪血白蛋白在2.458ng12.288ug范围内呈良好的线性关系。(5)精密度试验精密吸取猪血白蛋白对照品溶液(0.4915mg/ml)20ul，重复进样6次，猪血白蛋白峰面积值的RSD〈2M,结果见表9。表9精密度试验数据(n=6)试验次数猪血白蛋白平均值X11281012521280328831280097312803458412801574512806329612798461RSD=0.33%试验证明，精密度良好。(6)稳定性试验:取样品(081101)供试液分别于0小时，1小时，2小时，4小时，8小时，12小时，24小时，分别进样20ul，测得样品中猪血白蛋白12小时内稳定，猪血白蛋白峰面积的RSD〈2呢，结果见表IO。表10稳定性试验数据(n=6)10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>20.496.9506.65313.46297.88试验结果表明猪血白蛋白回收率在97.41—101.34%之间，加样回收良好。(9)纤维蛋白封闭剂催化剂中猪血白蛋白含量测定照上述含量测定的方法操作，测定了3批纤维蛋白封闭剂催化剂中猪血白蛋白的含量，结果见表13。表13样品中猪血白蛋白的含量测定结果(n=2)(mg/g)样品081103081115081123猪血白蛋白含量(mg/g)225.82432.21339.66测得三批纤维蛋白封闭剂催化剂中每lg含猪血白蛋白的含量在225.82432.21mg之间。实施例3纤维蛋白封闭剂主体胶中猪血纤维蛋白原含量测定用高效液相色谱法测定色谱条件用二醇键合相硅胶为填充剂；色谱柱Protein-Pak300SW，7.5X300mm，10um;柱温25°C;流动相20咖ol/L磷酸钠的水溶液；流速0.4ml/min，紫外光220nm检测；理论板数按猪血纤维蛋白原峰计算，大于2000;对照品溶液的制备:取猪血纤维蛋白原对照品28.04mg,置25ml的量瓶中，加20mmol/L磷酸钠的水溶液溶解并稀释至刻度，0.48um滤膜滤过，取续滤液，制成每lml分别含1.122mg的溶液，即得对照品溶液；供试品溶液的制备精密称取纤维蛋白封闭剂主体胶(批号081213)45.32mg，置25ml量瓶中，加流动相20mmol/L磷酸钠的水溶液溶解，并稀释至刻度，摇匀，0.48nm滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液；测定结果分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20ul，注入高效液相色谱仪，测定，计算，即得。每lg纤维蛋白封闭剂主体胶中含猪血纤维蛋白原387.93mg。实施例4纤维蛋白封闭剂催化剂中猪血白蛋白含量测定色谱条件用二醇键合相硅胶为填充剂；色谱柱Protein-PakTM300SW，7.5X300mm，10nm;柱温30。C;流动相20mraol/L磷酸钠的水溶液；流速0.4ml/min，紫外光220nm检测；理论板数按猪血纤维蛋白原峰计算，大于2000;对照品溶液的制备精密称取猪血白蛋白对照品11.49mg，置25ml的量瓶中，加流12动相20Miiol/L磷酸钠的水溶液溶解，并稀释至刻度，摇匀，0.48um滤膜滤过，取续滤液，即得每lml含0.460mg、的溶液，即得对照品溶液；供试品溶液的制备精密称取纤维蛋白封闭剂催化剂(批号081213)12.72mg，置25ml量瓶中，加流动相流动相20mmol/L磷酸钠的水溶液溶解，并稀释至刻度，摇匀，0.48ym滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；测定结果分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20ul，注入高效液相色谱仪，测定，计算，即得。每lg纤维蛋白封闭剂催化剂中含猪血白蛋白347.57mg。权利要求1.一种纤维蛋白封闭剂的质量控制方法，其特征是通过高效液相色谱法测定纤维蛋白封闭剂的主体胶制剂、催化剂制剂中猪血纤维蛋白原和/或猪血白蛋白的含量。2.根据权利要求1纤维蛋白封闭剂的质量控制方法，其特征是包括以下步骤-(一)供试品溶液的制备(1)纤维蛋白封闭剂的主体胶制剂供试品溶液的制备取纤维蛋白封闭剂主体胶制剂，以每lmg加O.12.0ml量流动相溶解并定溶，摇匀即得；(2)纤维蛋白封闭剂催化剂供试品溶液的制备取纤维蛋白封闭剂催化剂制剂，以每lmg加O.12.0ml量流动相溶解并定溶,摇匀，即得；(二)对照品溶液的制备取猪血纤维蛋白原和/或猪血白蛋白对照品，加流动相溶解并定溶，摇匀，配成每lml分别含0.32.Omg、0.11.5mg的猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白或每lml含0.32.Omg的猪血纤维蛋白原或每lml含0.11.5呢的猪血白蛋白的溶液为对照品溶液；(三)测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定，计算，即得主体胶制剂、催化剂制剂中猪血纤维蛋白原和/或猪血白蛋白的含量。3.根据权利要求2纤维蛋白封闭剂的质量控制方法，其特征是所述步骤(三)的高效液相色谱测定法中，以二醇键合相硅胶为填充剂。4.根据权利要求2纤维蛋白封闭剂的质量控制方法，其特征是所述步骤(三)的高效液相色谱测定法中，理论板数按猪血纤维蛋白原或猪血白蛋白峰计算，均不低于2000。5.根据权利要求2纤维蛋白封闭剂的质量控制方法，其特征是所述步骤(三)的高效液相色谱测定法中，以紫外光200-280nm检测，或差示折光率检测器检测。6.根据权利要求2纤维蛋白封闭剂的质量控制方法，其特征是所述步骤(三)的高效液相色谱测定法中，柱温为204(TC，流动相的流速0.21.0ml/min。7.根据权利要求2纤维蛋白封闭剂的质量控制方法，其特征是所述的步骤(一)至(三)中，流动相采用磷酸盐水溶液或磷酸盐缓冲水溶液。8.根据权利要求1-7中任一权利要求所述的纤维蛋白封闭剂的质量控制方法，其特征是由上述方法测得每lg纤维蛋白封闭剂主体胶制剂中猪血纤维蛋白原与猪血白蛋白的标准含量分别为195.88416.33mg、84.24103.38mg;每lg纤维蛋白封闭剂催化剂制剂中猪血白蛋白的标准含量为225.82432.21mg。全文摘要本发明公开了一种纤维蛋白封闭剂的质量控制方法，其是用高效液相色谱法测定纤维蛋白封闭剂产品中猪血纤维蛋白原、猪血白蛋白或其中之一含量。本发明的含量测定方法可准确控制产品的质量，可操作性强，重现性高，特异性强。文档编号G01N33/68GK101576538SQ20091004001公开日2009年11月11日申请日期2009年6月5日优先权日2009年6月5日发明者春向,李吉来,江彩霞,潘小宁,肖尚志,星黄申请人:广州倍绣生物技术有限公司