专利名称：氧化锌量子点标记抗体的溶出伏安法免疫测定方法
技术领域：
本发明属于免疫测定技术领域，涉及一种利用氧化锌量子点进行免疫测定的方法。
背景技术：
纳米结构氧化锌除了独特的半导体光电特性之外，还具有对生物安全无毒、能与 蛋白质等生物分子以氢键或其他方式螯合并能很好的保持其生物活性、具有较高等电 点等优异的性能，这使其在生物/化学传感器方面具有重要的应用。
目前，低浓度抗原的检测是临床医学和诊断学面临的重要课题。能成功检测低浓 度的抗原，可以为相应的疾病早期诊断和治疗提供科学的依据。抗原浓度检测的传统 手段是先进行病毒培养以提高疾病抗原的浓度，然后辅以光化学检测法或其他检测方 法确定抗原浓度并推算出原始浓度。这种方法的局限性在于其周期长，精确度差等， 可能延误疾病的发现和最佳治疗时机。利用纳米材料构建生物/化学传感器进行电化学 检测抗原的方法因其检测限低、检测快速、选择性好等优点正逐渐受到越来越多的重 视，但由于早期疾病期相应抗原的浓度极低，因此如何使低浓度的抗原产生明显的检 测信号是这种方法亟待解决的重要问题之一。
发明内容
技术问题本发明针对上述技术问题，提供一种氧化锌量子点标记抗体的溶出伏 安法免疫测定方法，该方法利用氧化锌标记抗体检测低浓度抗原，对相应抗原的检测 限低、选择性好、灵敏度高、稳定性好。
技术方案在本发明中，利用简单的液相反应制备氧化锌量子点，得到了粒径均 一，分散性好的氧化锌量子点，把量子点标记到抗体上。同时在载片上固定化一层抗 体，在特定浓度的待测抗原溶液中，使标记了氧化锌量子点的抗体和载片上的抗体均 与抗原进行特异性结合，把标记在抗体上的氧化锌量子点连接到载片上。然后用酸性 溶液把氧化锌量子点溶解为锌离子，用溶出伏安法测定溶出的锌离子的浓度，建立锌离子浓度与抗原浓度之间的关系，从而确定待测抗原浓度。本发明的技术解决方案 为
氧化锌量子点标记抗体的溶出伏安法免疫测定方法，具体方法过程如附图1， 测定步骤描述为-
第一步0.055-0.6克二水合乙酸锌加25毫升乙醇，60 80。C回流2.5 4小时，
溶解，冷至室温。
第二步将0.0148-0.15克一水合氢氧化锂加25毫升乙醇，超声10分钟溶解。
第三步将第一步和第二步所得溶液混合，加乙醇稀释0 10倍，置于高压釜 中，密封，使其能承受压力不小于2xl()Spa，加热至60 10(TC，保持0.5~3小时，自 然冷却至室温，取出，离心，用去离子水清洗三次，得到氧化锌量子点。
第四步将0.5~5毫克氧化锌量子点分散到50~200微升5~10微克/毫升的抗体 溶液中，33 37。C震荡1~3小时，离心，用pH6.8~7.5磷酸盐缓冲溶液清洗三次。再加 5%牛血清蛋白(BSA) 0.5~1.5毫升，33 37。C震荡1~3小时，离心，用pH6.8 7.5磷 酸盐缓冲溶液清洗三次。最终分散于0.5 1.5毫升pH6.8 7.5磷酸盐缓冲溶液中，不用 时保存于冰箱保温层。
第五步载片修饰，分两类载片，①金片，浸于等摩尔浓度的5~15毫摩尔/升 的ll一巯基一^^一烷酸(MUA)和ll一巯基一十一烷醇(MU)的乙醇溶液中， 0-8'C保持18小时，取出用去离子水清洗。②二氧化硅片或玻璃片，浸于5 15毫摩尔 /毫升3 —胺基一三乙氧基硅丙烷(APTS)的乙醇溶液中，35 45。C保持2 5小时，用 去乙醇清洗，再浸于5 15毫摩尔/毫升戊二醛水溶液中1~3小时，取出，用去离子水 清洗。
第六步将载片安装在一个孔径小于载片边长的电解池中，向电解池中加 50~150微升5~10微克/毫升的抗体溶液，33 37'C保持1 3小时，用pH6.8~7.5磷酸盐 缓冲溶液注入清洗。再加入5% BSA溶液，33 37'C保持1~3小时，用pH6.8~7.5磷酸 盐缓冲溶液注入清洗。
第七步向电解池中注入50-150微升0.1 200U的抗原溶液，33 37'C保持1 3 小时，用pH6.8 7.5磷酸盐缓冲溶液注入清洗。
第八步向电解池中注入50 150微升的标记了氧化锌量子点的抗体溶液， 33 37'C保持1~3小时，用pH6.8~7.5磷酸盐缓冲溶液注入清洗。
第九步向电解池中注入pHl 3的盐酸溶液溶解载片上的氧化锌量子点，并用
5pHl 3盐酸溶液洗三次，合并溶解液和洗液，加pH7.0磷酸盐溶液至1~3毫升。
第十步用铂电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，汞膜电极为工作电
极，一0.8 一1.5伏富集卯 150秒，用方波伏安法测锌的溶出峰，电位约在一l.l伏。 第十一步改变第七步抗原浓度，重复第七、八、九、十步，测定一系列抗原
浓度相对应的锌的溶出伏安峰的峰值电流，建立峰值电流与抗原浓度之间的对应关系。
以上过程测得的锌的溶出伏安峰值电流与抗原浓度之间的对应关系是本发明方 法的重要的基础数据，为用此发明方法进行实际临床检测提供浓度判定的理论依据， 对利用本发明方法进行快速、准确的临床检测有着极其重要的意义。
上述抗体与抗原为肝癌首选标志物a—胎蛋白(AFP)及其对应抗体，肺癌结 肠癌首选标志物(CEA)及其对应抗体，胰腺癌首选标志物(CA19—9)及其对应抗 体，卵巢癌首选标志物(CA125)及其对应抗体。
上述载片为金片、二氧化硅片或玻璃片。
有益效果与现有技术相比，本发明具有以下优点
1. 本发明液相法制备氧化锌量子点设备和工艺简单，制得的氧化锌量子点粒径 均一，条件可控，重复性好。
2. 本发明氧化锌量子点对抗体的标记过程与溶出过程，操作简单，条件温和， 量子点与抗体的结合稳定牢固。非常有利于保持抗体的生物活性。
3. 本发明运用溶出伏安法测锌离子浓度，易于锌在汞电极上的富集，锌的溶出 峰易测且峰值电流强，易于建立准确的峰值电流与抗原浓度之间的曲线关 系。有利于降低抗原检测的检测限，提高检测灵敏度。使快速准确检测低浓 度抗原成为可能。
图l是本发明的技术流程图。 图2是本发明的实例流程图。
具体实施方式
(如图2)
第一步0.55克二水合乙酸锌加25毫升乙醇，8(TC回流3小时，乙酸锌溶解，冷至室温。
第二步将0.148克一水合氢氧化锂加25毫升乙醇，超声10分钟溶解。 第三步将第一步和第二步所得溶液混合，加乙醇稀释10倍，置于高压釜中，
密封，使其能承受压力不小于2xl()Spa，加热至70'C，保持1小时，自然冷却至室 温，取出，离心，用去离子水清洗三次，得到氧化锌量子点。
第四步将5毫克氧化锌量子点分散到100微升5微克慮升的CA19 — 9抗体溶 液中，35。C震荡l小时，离心，用pH7.4磷酸盐缓冲溶液清洗三次。最终分散于l毫 升pH7.4磷酸盐缓冲溶液中，不用时保存于冰箱保温层。
第五步lxl厘米二氧化硅片浸于10毫摩尔/毫升APTS的乙醇溶液中，40'C保 持3小时，用乙醇清洗，再浸于10毫摩尔/毫升戊二醛水溶液中40'C保持3小时，取 出，用去离子水清洗。
第六步将第五步得到的二氧化硅片安装到孔径为5毫米的电解池中，向电解 池中注入100微升5微克/毫升的CA19—9抗体溶液，35'C保持1小时，用pH7.4磷酸 盐缓冲溶液注入清洗。
第七步向电解池中注入50微升10U的CA19—9抗原溶液，35"C保持1小 时，用pH7.4磷酸盐缓冲溶液注入清洗。
第八步取IOO微升第四步制得的标记了氧化锌量子点的CA19 — 9抗体溶注入 到电解池中，35'C保持1小时，用pH7.4磷酸盐缓冲溶液注入清洗。
第九步向电解池中注入pH2的盐酸溶液将载片上的氧化锌量子点溶解，并用 pH2的盐酸溶液洗两次，合并溶解液和洗液并加pH7.0磷酸盐缓冲溶液至3毫升。
第十步用铂电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，汞膜电极为工作电 极，一1.0伏富集120秒，用方波伏安法测锌的溶出峰，电位约在一1.2伏。
第十一步改变第七步抗原浓度，使抗原浓度每次增加20U，重复第七、八、 九、十步，直到抗原浓度增加至300U。测定一系列抗原浓度相对应的锌的溶出伏安峰 的峰值电流，建立峰值电流与抗原浓度之间的对应关系。绘制锌的溶出峰电流与抗原 浓度之间的关系曲线，为样品实测提供标准依据。
权利要求
1、一种氧化锌量子点标记抗体的溶出伏安法免疫测定方法，其特征在于利用液相反应制备氧化锌量子点，得到粒径均一、分散性好的氧化锌量子点，把该量子点标记到抗体上；同时在电解池中的载片上固定化一层抗体，在一系列已知浓度的待测抗原溶液中，使标记了氧化锌量子点的抗体和载片上的抗体均与抗原进行特异性结合，把标记在抗体上的氧化锌量子点连接到载片上；然后用酸性溶液把氧化锌量子点溶解为锌离子，用溶出伏安法测定溶出的锌离子的浓度，建立锌离子浓度与抗原浓度之间的关系，从而确定待测抗原浓度；用实际样品检测时得到的氧化荧光强度与此标准对应关系相对照即可确定实际样品的抗原浓度。
2、 根据权利要求1所述的氧化锌量子点标记抗体的溶出伏安法免疫测定方法，其特征在于具体测定方法为第一步二水合乙酸锌与乙醇按2 : 1~25 : l克/升混合，60 80。C回流2.5 4小时，溶解，冷至室温；第二步 一水合氢氧化锂与乙醇按0.6 : 1~6 : l克/升混合，超声溶解；第三步将第一步和第二步所得溶液混合，置于高压釜中，密封，使其能承受压力不小于2xl(^Pa，加热至60 10(TC，保持0.5 3小时，自然冷却至室温，取出，离心，用去离子水清洗三次，得到氧化锌量子点；第四步将氧化锌量子点分散到抗体溶液中，氧化锌量子点质量与抗体溶液体积比为2.5 : 1 ~25 : 1克/升，33 37。C震荡1~3小时，离心，用pH6.8~7.5瞵酸盐缓冲溶液清洗三次；最终分散于？116.8~7.5磷酸盐缓冲溶液中，不用时保存于冰箱保温层；第五步载片修饰，分两类载片，①金片，浸于等摩尔浓度的5~15毫摩尔/升的11—巯基一十一垸酸(MUA)和ll一巯基一十一烷醇(MU)的乙醇溶液中，0~8°C保持18小时，取出用去离子水清洗；②二氧化硅片或玻璃片，浸于5~15毫摩尔/毫升3—胺基一三乙氧基硅丙烷(APTS)的乙醇溶液中，3545。C保持2 5小时，用去乙醇清洗，再浸于5 15毫摩尔/毫升戊二醛水溶液中1~3小时，取出，用去离子水清洗；第六步将第五步得到的二氧化硅片安装到孔径不大于载片边长的电解池中，电解池中注入抗体溶液，使注入的抗体溶液体积至少能全部浸没反应液腔内的载片面积且至多不溢出反应液腔，33 37'C保持1~3小时，用pH6.8~7.5磷酸盐缓冲溶液注入清洗；第七步向电解池中注入抗原溶液，使抗原溶液体积至少能全部浸没反应液腔内的载片面积且至多不溢出反应液腔，33 37'C保持1~3小时，用pH6.8~7.5磷酸盐缓冲溶液注入清洗；第八步将第四步制得的标记了氧化锌量子点的抗体溶液注入电解池中，使使注入的溶液体积至少能全部浸没反应液腔内的载片面积且至多不溢出反应液腔，33 37'C保持1~3小时，用pH6.8~7.5磷酸盐缓冲溶液注入清洗；第九步向电解池中注入pH2的盐酸溶液将载片上的氧化锌量子点溶解，并用pH2的盐酸溶液洗两次，合并溶解液和洗液并加pH7.0磷酸盐缓冲溶液至3毫升；第十步:用铂电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，汞膜电极为工作电极，一1.0伏富集120秒，用方波伏安法测锌的溶出峰，电位约在一1.2伏；第十一步改变第七步的抗原溶液浓度，重复第七、八、九、十步，测定一系列抗原浓度相对应的氧化锌量子点的荧光强度，建立荧光强度与抗原浓度之间的关系。
3、根据权利要求2所述的氧化锌量子点标记抗体的溶出伏安法免疫测定方法，其特征在于所述载片为金片、二氧化硅片或玻璃片。
全文摘要
氧化锌量子点标记抗体的溶出伏安法免疫测定方法是将用氧化锌量子点标记的抗体与固定在裁片上的抗体通过抗原的特异性反应结合在一起，然后用酸性溶液把固定在载片上的氧化锌量子点溶解为锌离子，利用溶出伏安法测定溶出的锌离子的浓度，建立溶出的锌离子浓度与抗原浓度之间的关系的标准曲线，从而定量的确定实测样品抗原浓度的方法。本发明方法制备的氧化锌量子点粒径均一，分散性好，与抗体结合稳定，检测结果稳定可靠，重现性好，为医学临床早期检测疾病抗原提供了一条快速可靠的检测途径。在临床早期诊断方法应用有着巨大的应用潜力。
文档编号G01N33/543GK101672845SQ200910035829
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月23日 优先权日2009年9月23日
发明者刘松琴, 徐春祥, 朱光平, 王明亮, 谷保祥 申请人:东南大学