专利名称：肺炎支原体抗体检测方法及金标快速检测卡和制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于诊断、检测肺炎支原体抗体(IgG/IgM)的方法，以及用于该方法的肺炎支原体金标快速检测卡和其制备方法。
背景技术：
金标免疫层析技术是二十世纪九十年代发展起来的一项快速检测诊断技术，由于该技术具有快速、简便、不需任何仪器设备、结果阅读简单，已成为各种检测世纪的开发热点。到目前为止，该项技术已应用到多种疾病的检测诊断中。 肺炎支原体(MP)主要引起人非典型肺炎、气管炎及支气管炎，多经口和呼吸道等途径传播，多发于儿童和青年人。MP感染已占小儿呼吸道疾病30%以上，且有增加趋势。MP肺炎与一般呼吸道感染和肺炎的临床症状没有明显区别，MP感染早期诊断有利于MP肺炎的治疗。虽然MP感染诊断有多种方法，但目前研究表明，感染者血清MPP1蛋白抗体检测是最理想早期诊断方法之一。
本发明的公开 本发明的第一目的是为了提供一种肺炎支原体抗体(IgG/IgM)的检测方法，该方法为"一步法"快速检测方法，灵敏度高、特异性强而且速度快，操作简便，无需专门设施，适用于临床检测、流行病学调查等。 本发明的第二目的是为了一种肺炎支原体抗体(IgG/IgM)快速检测卡，该检测卡针对肺炎支原体抗体(IgG/IgM)检测提供一种简便、快速而且直接的"一步法"检测卡，利用该检测卡检测肺炎支原体抗体(IgG/IgM)的灵敏度高、特异性强；而且速度快，操作简便，无需专门设施。 本发明的第三个目的是为了提供一种肺炎支原体抗体(IgG/IgM)金标快速检测卡的制备方法，该方法简便、稳定性好、重复性好。
本发明的第一 目的可通过如下措施来实现 —种肺炎支原体抗体(IgG/IgM)检测方法，包括下述步骤(1)将胶体金标记的抗人球蛋白Ig(IgG/IgM)载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金载体相连的硝酸纤维膜(NC)载体上包被基因工程表达肺炎支原体P1蛋白抗原形成的检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线；(2)取人血清滴于胶体金标记的载体上，如血清中有肺炎支原体抗体(IgG/IgM)则在检测载体上形成检测线，检测载体上检测线、控制线双线为阳性，否则为阴性。
本发明的第二目的可通过如下措施来实现 —种肺炎支原体抗体(IgG/IgM)金标快速检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内。 所述的检测条是在衬板上设有加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端吸水层之间设有金标抗人Ig(IgG/IgM)抗体层；在检测层上包被有由基因工程表达肺炎支原体P1蛋白抗原形成的检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线。
本发明的第三个目的可通过如下措施来实现
—种肺炎支原体抗体(IgG/IgM)金标检测卡的制备方法主要包括金标抗体层和检测层及其上包被控制线和检测线的制备，以及检测条和检测卡的组装。 所述的金标抗体层的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备在浓度为0. 004% 0. 012%的氯金酸中加入其体积的1. 3% 2% 、浓度为1 % 3%的柠檬酸三钠，煮沸10 20分钟，可得到15 50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记抗人IgG/IgM单克隆抗体，在胶体金溶液中用0. 2m碳酸钾溶液调0 8. 4，按4 12mg/100ml加入抗人IgG/IgM单克隆抗体，搅拌后，再在溶液中按O. 1 0. 6g/100ml加入动物血清蛋白，4t:静置2 4小时；iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10 15分钟，去沉淀物，得上清液；iv将上清液经10000转/分钟离心60 80分钟离心得沉淀物；v将沉淀物按4 10ml/100ml溶于0. 02MPh7. 4Tris-Hcl缓冲液得胶体金溶液，该缓冲液中含0. 2% 0. 6%的动物血清蛋白和0. 01% 0. 06%叠氮钠；vi将上述胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止，37t:干燥过滤形成金标抗体层。 所述的检测层的制备，在制备的纯化兔或羊抗鼠IgG抗体和基因工程表达的肺支抗原MPP1中加入固定剂，用专用喷膜机在纤维素膜上形成控制线和检测线；其制备方法是在浓度为0. 8-2. 4mg/ml的抗原或抗体溶液中加入0. 1% -0. 3%的固定剂，利用专用喷膜机将抗原或抗体在NC膜上喷线，喷膜后37t:干燥，再用含10%小牛血清的0. 01mPH7. OPBS液封闭30分钟，O. 01mPH7. OPBS漂洗、37。C干燥得检测层。
所述的固定剂选自甲醛、丙酮中的一种。
本发明相比现有技术具有如下优点 1、本发明的检测肺炎支原体抗体(IgG/IgM)的方法为一步法，具有高度的特异性
和高灵敏度，其检测快速，结果判定在3 15分钟内完成，无需专门设施。 2、本发明的检测卡检测肺炎支原体抗体(IgG/IgM)时具有高度的特异性和高灵
敏度，检测过程操作迅速、快捷，方便，适合肺炎支原体感染人群的临床诊断和流行病学调查。 3、本发明的检测卡的制备方法简便、稳定性好、重复性好。
图面说明
图1是本发明检测卡的结构示意图 1-检测卡 2-加样孔 3-观察孔 图2是本发明检测卡的内部结构示意图 4-加样端吸水层 5-金标抗体层6-控制线 7-检测线 8-检测层 9-吸水端吸水层 10- *寸禾反 本发明的实施方式 本发明还将结合实施例作进一步详述
实施例一 —种肺炎支原体抗体IgG检测方法，包括下述步骤(1)将胶体金标记的抗人球蛋白Ig(IgG)载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金载体相连的硝酸纤维膜(NC)载体上包被基因工程表达肺炎支原体P1蛋白抗原形成的检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线；(2)取人血清滴于胶体金标记的载体上，如血清中有肺炎支原体抗体IgG则在检测载体
4上形成检测线，检测载体上检测线、控制线双线为阳性，否则为阴性。
参照图1 ， 一种肺炎支原体抗体IgG金标检测卡1 参照图2，所述肺炎支原体抗体IgG金标检测卡1是在衬板10上设有加样端吸水层4、检测层8和吸水端吸水层9，在检测层8和吸水端吸水层9之间设有金标抗人IgG抗体层5 ;在检测层8上包被有检测线7和控制线6。其中加样端吸水层4由多层玻璃纤维或无纺布制成；吸水端吸水层9由多层滤纸制成；检测层8为纤维素膜，该纤维素膜可为硝酸纤维素膜、醋酸纤维膜；金标抗体层为玻璃纤维或无纺布浸取胶体金标记抗体制成。
—种肺炎支原体抗体IgG金标检测卡的制备方法包括金标抗体层5和检测层8上检测线7和控制线6的包被，然后在衬板10上组合肺炎支原体抗体IgG金标检测卡1。在塑料垫板10的两端分别粘贴加样端吸水层4和吸水端吸水层9 ;在其中断粘贴包被检测线和控制线的检测层8，在加样端吸水层4与检测层8的交接部位，夹贴金标抗体层5纤维载体，纤维载体4/5部分夹在加样吸水层4中间，1/5部分叠在检测层8上。然后按4-5毫米宽、8厘米长规格切条，在组装在塑料卡盒内，盒盖上加样孔2正对检测条加样端吸水层4，观察孔3正对检测层8。 所述的金标抗体层5的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备，取100mg氯金酸溶于1000ml三蒸水中，加入15ml、在浓度为1%的拧檬酸三钠，煮沸15分钟，可得到15 50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记抗人IgG单克隆抗体，取100ml胶体金溶液，用0. 2m碳酸钾溶液调4，入6mg抗人IgG单克隆抗体，搅拌20分钟，再加入240mg牛血清白蛋白(BSA)，继续搅拌5分钟，4t:静置2 4小时；iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10 15分钟，去沉淀物，得上清液；iv将上清液经10000转/分钟离心60分钟离心得沉淀物；v将沉淀物溶于4ml 0. 02M 4Tris-Hcl缓冲液得胶体金溶液，该缓冲液中含0. 25%BSA和0. 02%叠氮钠；vi将胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止，37t:干燥2小时形成金标抗体层5。 所述胶体金标记抗体为抗人IgG单克隆抗体。 所述的检测层8是在硝酸纤维膜(NC)上设有基因工程表达肺炎支原体P1蛋白抗原构成的检测线7和有羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线6。其制备方法是取基因工程表达肺炎支原体P1蛋白抗原，调浓度为lmg/ml，加入0.2X甲醛，用专用喷膜机在NC膜中断喷检测线7 ;取羊、兔抗鼠IgG抗体，调浓度为2mg/ml，加入0.2X甲醛，用专用喷膜机在NC膜中断，距检测线0. 5cm处喷控制线6，检测线和控制线均按20ul/ml设置喷量，喷膜在37°C干燥2小时，再用含10%小牛血清的0. 01mPH7. OPBS液封闭37°C 30分钟，O. 01mPH7. OPBS漂洗、37t:干燥。
实施例二 肺炎支原体抗体检测方法及其金标快速检测卡与例一同。 该检测卡的制备方法除制备胶体金标记抗体为抗人IgG单克隆抗体外，其他条件
与例一同。
权利要求
一种肺炎支原体抗体(IgG/IgM)检测方法，包括下述步骤(1)将胶体金标记的抗人球蛋白Ig(IgG/IgM)载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金载体相连的硝酸纤维膜(NC)载体上包被基因工程表达肺炎支原体P1蛋白抗原形成的检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线；(2)取人血清滴于胶体金标记的载体上，如血清中有肺炎支原体抗体(IgG/IgM)则在检测载体上形成检测线，检测载体上检测线、控制线双线为阳性，否则为阴性。
2. —种肺炎支原体抗体(IgG/IgM)金标快速检测卡(l)，其特征在于该检测卡由检测 条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内。
3. 如权利要求2所述的肺炎支原体抗体(IgG/IgM)金标快速检测卡，其特征在于所述 肺炎支原体抗体(IgG/IgM)金标快速检测卡(1)是在衬板(10)上设有加样端吸水层(4)、 检测层(8)和吸水端吸水层(9)，在检测层(8)和吸水端吸水层(9)之间设有金标抗人IgG 抗体层(5);在检测层(8)上包被有检测线(7)和控制线(6)。
4. 如权利要求2所述的肺炎支原体抗体(IgG/IgM)金标检卡的制备方法，其特征在于 包括金标抗体层(5)和检测层(8)及其上包被检测线(7)和控制线(6)的制备，在衬板(10) 上组合肺炎支原体抗体(IgG/IgM)金标检测条和检测卡(1)。
5. 如权利要求4所述的肺炎支原体抗体(IgG/IgM)金标检测卡的制备方法，其特征在 于所述的金标抗体层(5)的制备方法包括下列步骤i胶体金的制备在浓度为0. 004% 0.012%的氯金酸中加入其体积的1. 3 % 2 % 、浓度为1 % 3 %的柠檬酸三钠，煮沸10 20分钟，可得到15 50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记抗人IgG/IgM单克隆抗体，在胶 体金溶液中用0. 2m碳酸钾溶液调0 8. 4，按4 12mg/100ml加入抗人IgG/IgM单 克隆抗体，搅拌后，再在溶液中按0. 1 0. 6g/100ml加入动物血清蛋白，4t:静置2 4小 时；iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10 15分钟，去沉淀物，得上清液；iv将 上清液经10000转/分钟离心60 80分钟离心得沉淀物；v将沉淀物按4 10ml/100ml 溶于0. 02MPh7. 4Tris-Hcl缓冲液得胶体金溶液，该缓冲液中含0. 2% 0. 6%的动物血清 蛋白和0. 01% 0. 06%叠氮钠；vi将上述胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始 渗出为止，37t:干燥过滤形成金标抗体层。
6. 如权利要求4获5所述的肺炎支原体抗体(IgG/IgM)金标检测卡的制备方法，特征 在于所述胶体金标记抗体为抗人Ig(IgG、 IgM)。
7. 如权利要求4所述的肺炎支原体抗体(IgG/IgM)金标检测卡的制备方法，其特征在 于所述的检测层(8)是在硝酸纤维膜上设有基因工程表达的肺炎支原体Pl蛋白抗原构成 的检测线(7)和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线(6)。
8. 如权利要求7所述的肺炎支原体抗体金标检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述 的肺炎支原体抗原为基因工程表达的肺炎支原体P1蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种肺炎支原体抗体(IgG/IgM)检测方法及快速检卡和制备方法，其检测方法包括(1)将胶体金标记的抗人球蛋白Ig(IgG/IgM)载于载体上，并在与胶体金载体相连的检测载体上包被基因工程表达肺炎支原体P1蛋白抗原形成的检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线；(2)取人血清滴于胶体金标记的载体上，如血清中有肺炎支原体抗体(IgG/IgM)则在检测载体上形成检测线，检测载体上检测线、控制线双线为阳性，否则为阴性。该检测卡包括加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端吸水层之间设有金标抗人Ig(IgG/IgM)抗体层。在检测层上包被有由基因工程表达肺炎支原体P1蛋白抗原形成的检测线和由抗鼠IgG抗体形成的控制线；本发明的方法为“一步法”快速检测方法，灵敏度高、特异性强；且快速、简便，无需专门设施。
文档编号G01N33/558GK101699290SQ200910022139
公开日2010年4月28日 申请日期2009年4月3日 优先权日2009年4月3日
发明者李克生, 杜惠芬 申请人:李克生