专利名称：β-葡聚糖酶活力的测定方法
技术领域：
本发明涉及的是一种测定β -葡聚糖酶活力的方法，具体涉及用MBTH法测定 β-葡聚糖酶活力的方法尤其涉及测定过程中关键参数的选择。
背景技术：
β-葡聚糖是一类非淀粉类多糖，它是由β-1，3_葡萄糖苷键和/或β-1，4_葡萄糖苷键组成的链状多糖，是植物细胞壁的组成成分，存在于禾谷类(包括大麦、燕麦、黑麦和小麦等)的糊粉层和胚乳细胞壁中。葡聚糖酶对葡聚糖中的糖苷键具有重要的水解作用。目前，该酶已广泛用于啤酒、饲料、纺织、造纸、医药等行业。该酶活力的检测方法有粘度法、荧光法、显色底物法、凝胶扩散法、还原糖测定法等，其中最常采用的方法为还原糖测定法中的DNS法、铁氰化钾法和Somogyi-nelson法。由于这三种方法灵敏度较低， 很难测到酶解反应的初速度，因此，准确度较差。本发明以MBTH(3-甲基_2_苯并噻唑酮腙)试剂为显色剂来测β _葡聚糖酶的活力。该法不受低浓度醋酸盐和丁二酸盐缓冲液的干扰，所得酶浓度曲线与酶解反应速度在较宽的酶浓度范围内呈线性相关。
发明内容
针对已有技术的不足，本发明提供一种葡聚糖酶活力的测定方法，该方法采用3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法来测定β -葡聚糖酶的活力。以下详细介绍本发明一种葡聚糖酶活力的测定方法，Α，制作用MBTH法测得的葡萄糖吸光度值与其相应浓度的标准对应关系曲线；B，用MBTH法检测待测β-葡聚糖酶水解β -葡聚糖后产生的相当于葡萄糖的吸光度值；根据上一步骤制作的葡萄糖浓度与测得的相应吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测β-葡聚糖酶的酶解产物中在单位时间内所产生的相当于葡萄糖的还原糖的含量，以此来推算葡聚糖酶的活力。优化地；上述步骤A的具体步骤是；作用MBTH法测得的葡萄糖吸光度值与其相应浓度标准对应关系曲线；分别取6-15组不同浓度(0-30 μ g/mL)的葡萄糖标准溶液0. 6mL, 加入0. 6mL 0. 5当量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH试剂0. 6mL于75-85 °C水浴加热 5-20min后趁热加入硫酸铁铵试剂1. 2mL，室温冷却后于波长620-680nm处测定葡萄糖的吸光度值；每个浓度做三个平行样；以上加量可按比例增减；根据每组葡萄糖浓度与测得的相应吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；优化地；上述步骤B的具体步骤是；用MBTH法检测β -葡聚糖酶的活力；将浓度为l_5mg/mL的预热至测定温度的β -葡聚糖溶液，加入至预热至测定温度的β _葡聚糖酶溶液中进行酶解反应，测定温度为25-40°C，水解时间为60min以内，取水解液迅速与等体积的0. 5当量的NaOH溶液充分混勻以终止反应(可在反应过程中分时间段取样检测)， 取1. 2mL加入到试管中(做三个平行样)，再加入MBTH试剂0. 6mL于75-85°C水浴加热 5-20min后趁热加入硫酸铁铵试剂1. 2mL,室温冷却后于波长620-680nm处测定吸光度值，以上加量可按比例增减。根据上一步骤制作的葡萄糖的浓度与测得的相应吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测葡聚糖酶的活力；葡聚糖酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应体系中，每分钟产生Inmol相当于葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。其中MBTH试剂的制法是;3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫苏糖醇溶液等体积混合即得，现用现配，一天内有效。优化地；上述硫酸铁铵试剂的制法是0. 5% (FeNH4(SO4)2) · 12Η20,0. 5%氨基磺酸，
0.5当量盐酸。优化地；上述β -葡聚糖以50mM的丁二酸缓冲溶液或醋酸缓冲溶液为溶剂。优化地；上述测定吸光度值的最佳波长为650nm。本发明的优点是本发明用MBTH法对β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖后所产生的葡萄糖端基的数量进行检测以此来确定葡聚糖酶的活力；葡萄糖以及低聚葡聚糖是 β -葡聚糖酶水解的产物，因此对葡萄糖端基含量检测的灵敏度直接决定着对β -葡聚糖酶活力检测的灵敏度。该方法比比浊法简便、快速、准确、价廉。检测限和工作浓度范围都明显低于DNS法和铁氰化钾法，所以本方法的灵敏度明显高于DNS法和铁氰化钾法。
具体实施例方式实施例1 主要仪器水浴恒温振荡器，SHZ-82型，国华电器有限公司；电热恒温水浴锅， ΗΗ-4型，国华电器有限公司；数字酸度计，梅特勒-托利多公司；UV2100紫外分光光度计， 上海UNICO仪器有限公司；β-葡聚糖酶，宁夏和氏璧生物技术有限公司；β-葡聚糖，百特纯大分子科技有限公司；移液器，Finnpipette芬兰雷勃。溶液配置MBTH显色液3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫苏糖醇溶液等量混合即得，现用现配，一天内有效。葡萄糖标准溶液(30yg/mL)精确称取干燥至恒质量的葡萄糖0. 3000g，用 50mMpH5. 5的醋酸缓冲溶液溶解、转移并定容至IOOmL,配成3. 00mg/mL的葡萄糖标准溶液； 从中取ImL葡萄糖溶液，转移并定容至IOOmL,即得30 μ g/mL的葡萄糖标准溶液。硫酸铁铵试剂的制法是0. 5% (FeNH4(SO4)2) · 12H20，0. 5%氨基磺酸，0. 5当量盐酸。步骤A，制作用MBTH法测得的葡萄糖吸光度值与其相应浓度的标准对应关系曲线.
一入 ，分别加入8组不同浓度的葡萄糖标准溶液0. 5mL,加入0. 5mL 0. 5当量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH试剂0. 5mL于80°C水浴加热11-I^iin后趁热加入硫酸铁铵试剂lmL， 室温冷却后于波长650nm处测定葡萄糖的吸光度值；每个浓度做三个平行样；根据每组葡萄糖溶液浓度与测得的相应吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；B,用MBTH法检测的β -葡聚糖酶活力；将5mL β -葡聚糖溶液其浓度为ang/mL，pH值为5. 5，加入到锥形瓶中于30°C的水浴摇床中预热lOmin，加入待测的β-葡聚糖酶溶液5mL进行水解反应，为确定合适的待测 β-葡聚糖酶浓度可以将待测的β-葡聚糖酶溶液稀释成不同浓度梯度逐个检测，水解时间为60min以内，取水解液2mL (可在反应过程中分时间段取样检测)，迅速加入2mL 0. 5当量的NaOH溶液中(做三个平行样)，混勻，取ImL加入到试管中，再加入MBTH试剂0. 5mL于 80°C水浴加热ll-l^iiin后趁热加入硫酸铁铵试剂1. 2mL,室温冷却后于波长650nm处测定吸光度值，根据上一步骤制作的葡萄糖浓度与测得的相应吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测的葡聚糖酶的酶解产物中所含有的相当于葡萄糖的还原糖的量。葡聚糖酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应体系中每分钟产生Inmol相当于葡萄糖的量的酶量为一个酶活力单位，从而根据酶活力定义来推算木葡聚糖酶的活力。实施例2 主要仪器电热恒温水浴锅，ΗΗ-4型，国华电器有限公司；数字酸度计，梅特勒-托利多公司；UV2100紫外-可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；葡聚糖酶，武汉新华扬生物有限责任公司；葡聚糖，百特纯大分子科技有限公司；移液器， Finnpipette芬兰雷勃集团。溶液配置MBTH显色液3mg/mL的3_甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫苏糖醇溶液等量混合即得，现用现配，一天内有效。葡萄糖标准溶液(30yg/mL)精确称取干燥至恒质量的葡萄糖0. 3000g，用 50mMpH4. 0的醋酸缓冲溶液溶解、转移并定容至IOOmL,配成3. 00mg/mL的葡萄糖标准溶液； 从中取ImL葡萄糖溶液，如前法操作并定容至IOOmL,即得30 μ g/mL的葡萄糖标准溶液。硫酸铁铵试剂的制法是0. 5% (FeNH4(SO4)2) · 12H20，0. 5%氨基磺酸，0. 5当量盐酸。步骤A，制作用MBTH法测得的葡萄糖吸光度值与其相应浓度的标准对应关系曲线；分别加入8组不同浓度的葡萄糖标准溶液lmL，加入ImL 0. 5当量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH试剂ImL于80°C水浴加热1 l-i;3min后趁热加入硫酸铁铵试剂2mL，室温冷却后于波长650nm处测定葡萄糖的吸光度值；每个浓度做三个平行样；根据每组葡萄糖溶液浓度与测得的相应吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；B,用MBTH法检测β -葡聚糖酶的活力；将0. 25mLi3 -葡聚糖溶液(其浓度为ang/mL，pH值为5. 5)，加入试管中于30°C 的水浴锅中预热lOmin，加入待测的已预热至30°C的β _葡聚糖酶溶液0. 25mL进行水解反应，为确定合适的待测β-葡聚糖酶浓度可以将待测的β-葡聚糖酶溶液稀释成不同浓度梯度逐个检测，水解时间为30分钟，迅速加入0. 5mL 0. 5当量的NaOH溶液充分混勻以终止反应，加入0. 5mL MBTH试剂，充分混勻，于80°C水浴加热后趁热加入硫酸铁铵试剂lmL，室温冷却后于波长650nm处测定吸光度值，如法做三个平行样，根据上一步骤制作的葡萄糖浓度与测得的相应吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测的β-葡聚糖酶的酶解产物中所含有的相当于葡萄糖的还原糖的量。β-葡聚糖酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应体系中每分钟产生Inmol相当于葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位， 从而根据酶活力定义来推算木葡聚糖酶的活力。当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述操作，所有在本发明的实质范围内作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种β-葡聚糖酶活力的测定方法，其特征是；Α，制作用MBTH法测得的葡萄糖的吸光度值与其相应浓度的标准对应关系曲线；B，用MBTH法检测待测β -葡聚糖酶水解β -葡聚糖后产生的相当于葡萄糖的吸光度值；根据上一步骤制作的葡萄糖浓度与测得的相应的吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测葡聚糖酶的酶解产物中在单位时间内所产生的相当于葡萄糖的还原糖的含量， 以此来推算葡聚糖酶的活力。
2.根据权利要求1所述的葡聚糖酶活力的测定方法，其特征是；上述步骤A的具体步骤是；分别取6-15组具有不同浓度的葡萄糖标准溶液0. 6mL,浓度范围在0_30微克/ 毫升之间，加入0. 6mL 0. 5当量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH试剂0. 6mL于75_85°C水浴加热8-20min后趁热加入硫酸铁铵试剂1. 2mL,室温冷却后于波长620-680nm处测定吸光度值；每个浓度做三个平行样；以上加量可按比例增减；根据每组葡萄糖浓度与测得的吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；
3.根据权利要求1或2所述的葡聚糖酶活力的测定方法，其特征是；上述步骤B 的具体步骤是；将终浓度为l_5mg/mL的预热至测定温度的β _葡聚糖溶液，加入到预热至相应温度的β -葡聚糖酶溶液中开始水解反应，酶解温度为25-40°C，水解时间为60min以内，将该酶解液与等体积的0. 5当量的NaOH溶液迅速混合以终止反应，可在反应过程中分阶段取样，从中取1. 2mL加入到试管中做三个平行样，再加入MBTH试剂0. 6mL于75_85°C水浴加热5-20min后趁热加入硫酸铁铵试剂1. 2mL,室温冷却后于波长620-680nm处测定吸光度值，根据步骤A制作的葡萄糖浓度与测得的相应吸光度值之间的标准对应关系曲线确定酶解产物中所含有的相当于葡萄糖的还原糖浓度，以此来推算β-葡聚糖酶的活力；β-葡聚糖酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应体系每分钟产生Inmol相当于葡萄糖的量所需的酶量为一个酶活力单位；其中MBTH试剂的制法是:3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫苏糖醇溶液等体积混合即得，现用现配，一天内有效。
4.根据权利要求3所述的葡聚糖酶活力的测定方法，其特征是；上述硫酸铁铵试剂的制法是0. 5% FeNH4(SO4)2 · 12Η20，0. 5%氨基磺酸，0. 5当量盐酸。
5.根据权利要求3所述的葡聚糖酶活力的测定方法，其特征是；上述葡聚糖酶溶液以50mM的丁二酸或醋酸溶液为溶剂。
6.根据权利要求3所述的葡聚糖酶活力的测定方法，其特征是；上述测定吸光度值的最佳波长为650nm。
全文摘要
本发明公开了一种β-葡聚糖酶活力的测定方法，A、制作用MBTH法测得的葡萄糖吸光度值与其相应浓度的标准对应关系曲线；B、用MBTH法检测待测β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖后产生的相当于葡萄糖的吸光度值；根据上一步骤制作的葡萄糖浓度与测得的相应吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测β-葡聚糖酶的酶解产物中在单位时间内所产生的相当于葡萄糖的还原糖的含量，以此来推算β-葡聚糖酶的活力。该方法测定葡萄糖的检测限和工作浓度范围都明显低于DNS法、铁氰化钾法和Somogyi-Nelson，所以本方法的灵敏度明显高于这三种方法，而且，采用本方法使底物β-葡聚糖的用量大大降低，因此可大大降低实验成本。
文档编号G01N21/31GK102174644SQ20091001695
公开日2011年9月7日 申请日期2009年6月30日 优先权日2009年6月30日
发明者叶庆国, 张 杰, 张永勤, 张洪妮, 曾凡伟, 王哲平, 王斐 申请人:青岛科技大学