显微术成像仿真模型的利记博彩app

专利名称：显微术成像仿真模型的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及用于确认、优化和校准用于分析显微镜图像的显微术仪器和软件的成 像仿真模型(imaging phantom)。
背景技术：
成像仿真模型(生物样品的合成模型)通常用于用于对动物和人成像的X-射 线、CT、PET、超声和MRI仪器在宏观尺寸上的3D成像中(Pogue, B. W.和Patterson, Μ. S.， J. Biomed. Opt. , (2006), 11 (4), 041102 ； J. Neurosurg. , (2004)，101 (2)，314-22)。仿真模 型可以发展和确认新的成像应用，并提供用于仪器校准的不变样本。在显微镜领域，校准和成像标准件发展的较为不好。已经进行了一些工作使用 光源来替代用于校准的荧光样本(Lerner, J. Μ.，Zuckerm, R. Μ.，Cytometry Α.，(2004)， 62(1)，8_34)，也可以使用经设计用于流式细胞仪校准的珠子组(bead sets) (Schwartz, Α.等等，Cytometry，(1998)，33 (2)，106-14)作为强度和分辨率标准件。然而，在流式细胞 仪中，该仪器仅测定强度信息，因此尽管可以使用经开发用于校准流式细胞仪的珠子在荧 光显微镜中用于强度和对准校正，但其不提供对在成像仿真模型中所需要的复杂生物结构 的代表。US 2007/0190566 (Montagu)描述了用于校准荧光成像微阵列扫描仪的平面标准 件，包括在其上覆盖有具有特定开孔以产生具有规则图案的荧光图像的非荧光材料掩模的 荧光层，该有规则图案的荧光图像可以用于校准和确定成像分辨率。尽管这种装置适用于 确定显微镜或其他用于分辨以规则图案设置的结构(例如核酸微阵列)的成像仪的光学分 辨率，但该标准件并不适用于代表在生物样品中固有的自然变化，该构造的方法阻止了在 单一装置中使用多个萤石或其他显像剂。因此，US2007/0190566的装置作为适用于细胞和 组织成像应用的生物代表性成像仿真模型具有明显的限制。类似地，US6984828 (Montagu)和 US 6472671 (Montagu)描述了在上面覆盖有薄 的不透明掩模的荧光材料固体层，其中该掩模具有限定尺寸的开孔以产生规则的平面荧光 图案。这些装置都适用作分辨率标准件而作为真实生物成像仿真模型都具有相当的限制。US2006/0134606 (Montagu)公开了用于固定用于分析的生物材料(例如蛋白质和 核酸)的装置，作为对Southern blotting法和其他类似的固相分析方法中所用的硝基纤 维素膜的替代。该装置包括在固体基体上的微孔膜的超薄层。可以将待分析的材料施加到 支撑在显微镜载玻片或多孔板上的基体上用于通过成像(包括通过显微术)进行分析。该 文献没有描述制备或使用用于成像的标准件，也没有包括代表细胞或组织的可检测元件的 标准件。US 7262842 (Ermantraut等)描述了荧光强度校准标准件，包括非荧光载体，所述 非荧光载体上面覆盖有由光刻法或spotting制备的、在可变厚度的区域中的荧光聚合物， 其中通过施加的荧光层的厚度控制荧光强度。这种装置适用于测试成像仪器的检测灵敏 度；然而该制备方法不能使用多个萤石或不能引入制备代表细胞或组织样本的仿真模型所 需的无规间距。
EP 1774292(Ge等)描述了用于荧光检测仪器的校准载玻片，包括在玻璃载玻片 上通过接触或丝网印刷制备的无机磷光体的点的微阵列。该装置具有由无机磷光体提供的 稳定的荧光的优点，但作为生物代表性仿真模型具有与上述装置和方法相同的局限性。EP 259137 (Schwartz)描述了用于将凝胶中的荧光微球安装在盖玻片下的显微镜 载玻片上的方法，其中该珠子是无规分布的。该方法产生稳定的样本，其可用于在荧光显微 镜中测试灵敏性和图像对准，然而所用的荧光光源的离散性质及其未受控制的分布使得该 方法不适用于产生代表如下生物结构的显微镜成像仿真模型对于所述生物结构而言，存 在着结构在其它结构中的限定的分离和包含。类似地，W02006/003423描述了用于将在温 度响应性凝胶中的荧光珠子安装在显微镜载玻片上的方法，其具有与前述方法的成像仿真 模型相同的局限。WO 2007/056977 和 US2008/0233652 (Kreyenschmidt)描述了用于 X射线荧光和激 光诱发等离子体光谱的校准中的、包括包含铬、镉和其他重金属的塑料模制品的校准标准 件。所述的校准方法能够用于测定聚合物中的污染物含量，特别是在电气和电子装置中存 在的污染物。该文件未描述制备或使用成像标准件，也未描述包括代表细胞或组织的可检 测元件的标准件。W098/49537 (Brakenhoff等)描述了用于校准光学成像装置的包括包含可光致褪 色的发光材料的光学透明聚合物的校准层的制备和使用。该装置的光致褪色性质可使激发 光和发射光分布分开确定。该文件未描述制备或使用包括代表细胞或组织的可检测元件 (结构)的标准件。W098/49537的校准层根据定义是均勻的，这对于在校准的仪器内实现 激发和/或检测的分布和/或均勻性的分析是必须的，因此缺少用于代表细胞或组织所需 的结构变化。缺少适用于显微术(特别是在高含量筛选(HCS) (MethodsEnzymo 1.，(2006)， 414,468-83)和高含量分析(HCA) (Biotechnol. J. (2007)，2 (8)，938-40)中使用的自动化 显微术)的真实成像仿真模型。HCS和HCA程序使用高通量的自动显微镜，例如IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare)，以快速获取细胞或组织样本的几百或几千个图像，随后 使用图像分析软件(例如IN Cell Investigator (GE Healthcare))对其分析以提取生物 工艺的定量数据信息。这些程序所用的生物样本变化很大，从简单的细胞培养物到复杂干细胞培养物和 组织切片。该样本可以是未染色的，且可以通过相差照明观察到。可替代地，该样本可以用 荧光的或其他染料染色以突出细胞结构。该样本可以另外包括单独或组合的特定的细胞报 告物，例如细胞蛋白质与荧光蛋白质融合的荧光染色抗体，用于指示特定细胞活动的活性， 例如响应于测试药物在细胞表面受体上的结合的细胞信号通道的活性，随后将信号转导给 细胞核而导致一个或多个基因的表达。由这种研究产生的数据的质量高度取决于显微镜产生的图像质量以及该图像的 软件分析质量。建立和维持图像质量需要在自动显微镜中的多个组件(包括照明和滤光 器)最优化操作。因此，存在对如下不变样品的需求所述不变样品能够重复用于随着时间 变化以及在不同仪器之间进行校准和确认系统性能。如果这种样品代表可能将用自动显微 仪器成像的细胞和组织的尺寸和复杂性，那么其是特别有利的。类似地，对于图像分析软件而言，表现出与生物样本类似的结构复杂性且能够大量制备的不变成像标准件的可得性将使得能够确认用于获取定量数据的软件参数设置。适用于HCS和HCA的仿真模型标准件应当是i)不变的大量制备的标准件应当是稳定的、可复制的且牢靠的(robust)，以允 许在常规仪器启动、校准和监控过程中以及在图像分析程序的开发中随时间进行大量的分 析。ii)灵活的标准件应当能够以一定范围的格式制备，以允许测试宽范围的仪器 设置和分析参数。iii)代表性的标准件应当代表典型的细胞和组织样本，即提供真实的成像仿真 模型。因此需要的是稳定的可复制的样本，其能够大量制备并具有精密的公差，提供足 够的复杂性以形成用于HCS/HCA成像仪器和图像分析软件的测试和校准标准件，克服使用 经设计用于流式细胞仪的珠子(仅提供强度信息)或经设计用于微阵列扫描仪的平坦荧光 标准件(不提供适用于细胞或组织显微术的适当的复杂性或尺寸)的局限。

发明内容
在第一方面中，提供了固体预制聚合基质材料，其包括一个或多个可检测的内部 元件，在用显微镜成像时其代表细胞或组织。因此本发明涉及适用于高容量分析成像应用，特别适用于校准图像分析仪器和软 件的成像标准件。该成像标准件基于分散在稳定基质材料中的不同可检测(例如荧光的) 材料的组合，其在适用于HCS/HCA平台的尺寸规模的成像仿真模型中提供了强度和空间标 准化。在依照本发明的一个实施方案中，该聚合基质材料是伸长固体结构(an elongated solid structure)(或块)，其中该伸长结构的横截面包括细胞或组织的一个或 多个表征性特征，其沿长度方向延伸通过该伸长结构。在该实施方案中，优选地，可检测的 内部元件包括代表真核细胞的预制复合结构。此处所用的所述细胞或组织的“表征性特征(characterizing feature)，，的表述 用于表示典型的细胞和亚细胞结构，例如细胞核、线粒体或可以用显微镜成像的任何其他 细胞结构，其中这些结构在本发明的各种实施方案中由可检测元件的适当排列代表。例如， 在本发明的一种实施方案中，细胞可以用涂覆有第二聚合物的圆形横截面的聚合物杆表 示，使得在以横截面切开时，所述两聚合物式的复合结构包括具有中心核和同心环的圆盘， 分别代表细胞核和细胞质。术语“复合结构”表示包括多于一个用于并经设计以代表细胞或其部分的元件的 任何结构。复合结构可以是简单的或复杂的，这取决于要代表的生物结构的复杂性。在以少 细节方式代表单细胞的情况下，该复合结构可以仅包括代表细胞核和细胞质的两个元件。 在更复杂的代表中，该复合结构可以包括很多元件，代表例如细胞质、细胞核、线粒体、高尔 基体、内质网和其他亚细胞器，如同该成像仿真模型的预期使用所需要和合意的。优选地，可检测的内部元件每一包括显示剂(visualisation agent)，更优选地每 一所述显示剂在每一所述内部元件中存在着可检测的差异。适合的显示剂可以选自有色染 料、荧光染料或折射率改变剂。
优选地，该伸长固体结构包含至少两个且优选多于两个(在一些情况中，三个或 四个和更多个)可检测的内部元件。根据该成像仿真模型特别需要的细胞或组织代表，该 可检测的内部元件还可以具有相同或不同的尺寸。例如，在该成像仿真模型代表用显微镜 成像的培养细胞群体的情况下，该伸长结构将会包括包括各自代表单一细胞的多个内部复 合元件的块，其中该内部复合元件包括适合的数量、设置和尺寸以代表培养物中的分离的 细胞。选择该块的尺寸以适合该成像应用和仪器。例如，为了在标准实验室显微镜上成像， 选择该块的尺寸以适配在显微镜载波片上(典型地76mmX26mm)。为了在自动显微镜和其 他经设计以成像多孔板的仪器(例如96孔微量滴定板)上成像，选择该块的尺寸以使该块 的横截面能够装配在用于成像的该板的孔的底部。选择该内部复合元件的尺寸以与成像应 用所需的细胞结构成比例(in scale with)，例如以代表细胞核和细胞质。用于制备与显微 镜载玻片一起使用的成像仿真模型的块的合适尺寸为0. 2 2立方cm，优选尺寸为0. 5立 方cm 1立方cm。对于内部复合元件适合的尺寸非常取决于在该成像仿真模型中所要代 表的生物结构；例如在代表哺乳动物细胞的仿真模型中，尺寸将典型地在0. 5 μ m 200 μ m 范围，优选的尺寸在Iym 50 μπι范围。真核细胞和哺乳动物细胞的尺寸随着细胞类型变 化非常大，以及通过克隆变异和突变或由于随着细胞经过在用于细胞分裂的制备中的细胞 周期而造成细胞尺寸的改变而在相同细胞类型中能够发生显著的尺寸变化，这对于本领域 技术人员是公知的。通过适当选择内部复合元件所用的尺寸，可以制备成像仿真模型，其范 围从在内部元件群内基本不变的那些到如下场合下的尺寸分布非常宽的那些为了代表特 定的生物样品或者为了在宽范围尺寸上评价成像性能，需要尺寸分布非常宽。该聚合基质材料的组成并不重要，只要其刚性足够大以将该内部元件的位置沿长 度方向固定在该伸长固体结构上而且能够通过超薄切片或其他适合的技术切成适合厚度 的切片即可。优选地，该聚合基质材料是透明或半透明聚合物，适当地选自合成聚合物，例 如聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、环氧树脂等(Histochem J. (1999) ,8,495-505) 0可替代 地，该聚合基质可以包括天然或合成蜡，例如链烷烃或酯蜡，例如通常用于包埋生物材料用 于切片的那些(Methods Mol. Biol.，(1999) ,115, 275-9) 0对于某些应用，使用天然形成的 聚合物或生物聚合物也可以是有利的，例如橡胶、明胶和多糖葡聚糖和纤维素及其衍生物， 例如乙酸纤维素。优选使用交联剂以防止溶胀或变形以及确保该内部元件牢固固定在位。 可替代地，该聚合物可以包括光聚合物，也即通过暴露于光或通过用光的作用使聚合引发 剂活化而由单体溶液发生聚合而形成的聚合物。适合的光聚合物包括但不局限于聚-N-异 丙基丙烯酰胺和聚丙烯酰胺(Biomacromolecules，(2005), 6(1), 414-24)、聚乙二醇二丙烯 酸酯(Biomaterials, (2001) ,22 (9), 929-41) 在优选实施方案中，该伸长固体结构(或块)具有包括适用于夹持的刚性材料的 底座。这可使整个该伸长结构可用于超薄切片成适合厚度的切片。在第二实施方案中，该聚合基质材料基本为球形，且该可检测的内部元件包括包 封的珠子。优选地，在该实施方案中，该可检测的内部元件代表真核细胞的细胞器。在该实施方案中，优选该一个或多个可检测的内部元件中的各个和该基质材料都 包括显示剂。更优选地，每一所述显示剂在每一所述内部元件中存在着可检测的不同。适 合的显示剂可以选自有色染料、荧光染料或折射率改变剂。优选地，存在至少两个且优选多于两个，在一些情况下存在三个或四个和更多的可检测到的内部元件，各所述内部元件代表待通过基本为球形的复合物代表的细胞的组 分。例如，该基本为球形的基质可以代表细胞质，其包含4个可检测的且单独可区分的内部 元件，其中一个可检测的元件代表细胞核，两个元件代表线粒体，一个元件代表内质网。根 据待代表的特定细胞元件，该基本为球形的基质和该可检测到的内部元件中的任一或两者 都还可以具有相同或不同的尺寸。例如，在典型哺乳动物细胞的代表中，该基本为球形的基 质可以具有IOym IOOym的直径，代表细胞核的内部元件尺寸为5μπι 50μπι，代表线 粒体的直径为0. Iym 50μπι。真核细胞和哺乳动物细胞的尺寸在不同细胞类型变化非常 大，以及通过克隆变异和突变或由于随着细胞经过在用于细胞分裂的制备中的细胞周期而 造成细胞尺寸的改变而在相同细胞类型中发生显著的尺寸变化，这对于本领域技术人员是 公知的。通过适当选择该基本为球形的基质和内部元件所用的尺寸，可以制备成像仿真模 型，其范围从在群内基本不变的那些到如下场合下的尺寸分布非常宽的那些为了代表特 定的生物样品或者为了在宽范围尺寸上评价成像性能，需要尺寸分布非常宽。此处所用的术语“有色染料”是指有色的化学化合物，其能够固定到基体上并另外 具有抗光分解的性质。适用于本发明的实例包括具有青色、品红色、黄色或非必要地黑色色 彩的染料。此处所用的术语“荧光染料”是指在通过暴露于特定波长的光时受到激发而发出 特定波长光的化合物。荧光团可以以其发射曲线或“颜色”来描述。例如，绿色荧光团(例 如Cy3 和FITC)的特征可以用发射波长通常在515 540纳米范围进行表征。红色荧 光团(例如Cy5和四甲基罗丹明)可以用其发射波长通常在590 690纳米范围进行表 征。适用作此处所述的本发明中的显示剂的荧光团的实例包括吖啶酮染料及衍生物；香 豆素染料及衍生物，例如7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，Coumarinl20)、7_氨基-三氟甲基 香豆素；荧光素及衍生物，例如5-羧基荧光素(FAM)；罗丹明及衍生物，例如5-羧基罗丹 明(Rhodamine 110-5)、6_ 羧基罗丹明(Rhodamine 110-6)、5_ 羧基罗丹明 _6G(R6G_5 或 REG-5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G-6 或 REG-6)、N，N, N，，N，_ 四甲基 _5_ 羧基罗丹明、N, N， N’，N’ -四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或TMR)、5_羧基-X-罗丹明、6-羧基-X-罗丹明 (R0X ；G-5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G-6或REG-6)、N，N, N，，N，_四甲基_5_羧基罗丹明、 N，N，N’，N’ -四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或TMR)、5-羧基-X-罗丹明、6-羧基-X-罗 丹明(ROX)；和花青染料，例如Cy3(3-(e-羧基戊基)-1，_乙基-3，3，3，，3，_四甲基-5， 5，- 二磺酸根合-羰花青)、Cy3. 5 (3- ( ε -羧基戊基)，-乙基_3，3，3，，3，-四甲基_4， 5，4，，5，-(1，3- 二磺酸根合)二苯并_羰花青)、Cy5 (1-( ε -羧基戊基)_1，-乙基_3，3， 3，，3，-四甲基-5，5，- 二磺酸根合-二羰花青)、Cy5. 5(1-(ε-羧基戊基)_1，-乙基_3， 3，3’，3’ -四甲基 _4，5，4’，5’ _ (1，3-二磺酸根合)-二苯并-二羰花青)、Cy7 (1-( ε -羧 基戊基)-1，-乙基_3，3，3，，3，-四甲基_5，5，- 二磺酸根合-三羰花青)。上面和另外 的染料描述在例如美国专利号4，268，486 (Waggoner等)；Southwick等·，Cytometry, 11, 418-430(1990) ；Mujumdar φ, Bioconjugate Chemistry4,105-111, (1993) ；Waggoner, Α. S. , FluorescentProbes for Analysis of Cell Structure and Function and Health by Flow andlmaging Cytometry, Alan R. Liss(1986),禾口 Molecular Probes Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Inc. 6th edition (1996) Haugland中，通过参考将其引入此处。
此处所用的术语“折射率改变剂”用于广义地表示可用于改变材料的折射率的任 意材料，所述材料是任意化学品、化合物、单体、颗粒或其他材料，其可以添加到聚合物中例 如用于改变该聚合物的折射率以通过改变该聚合物的折射率来改变该聚合物的光学性质， 以使该聚合物在通过相差显微术或相关光显微技术观察时的可见度更高或更低。氟化聚合 物是提高折射率的化学物质的实例，而氯化聚合物是降低折射率的化学物质的实例。US 2006/0063880 (Khanna)描述了使用纳米颗粒作为折射率改变剂。具有小于可 见光波长的直径的纳米颗粒对于光透射通过透明聚合物没有明显影响；然而更小直径(例 如小于约400nm，优选小于约200nm)的纳米颗粒改变其悬浮在其中的材料的折射率。这种 纳米颗粒可以由金属氧化物(例如氧化钛和/或二氧化钛)、陶瓷以及其他适合的材料制 成。在第二方面，提供了成像仿真模型(imaging phantom)，其包括从包括预制聚合基 质材料和一个或多个可检测内部元件的伸长固体结构(或块)上切下的均勻部分，以及其 中该伸长结构的横截面包括沿长度方向延伸通过该伸长结构的细胞或组织的一个或多个 特征，所述成像仿真模型可由显微术检测到。适合地，依照本发明的成像仿真模型的厚度可以在约Iym 30 μ m，更优选 2 μ m 15 μ m范围内。在第三方面，提供了依照第一方面的第二实施方案的成像仿真模型，该成像仿真 模型优选包括两个或更多个基本为球形的聚合物基质，每一聚合物基质包括一个或多个可 检测的内部元件，以及其中所述内部元件包括包封珠子，所述成像仿真模型可由显微术检 测。本发明的成像仿真模型适于由显微术检测，且可用在宽范围的可获得的显微术仪 器，从简单的手动台式显微镜到包括多个镜头、照明源、滤光器和照相机的尖端的自动成像 仪器。将容易认识到通过在尺寸规模、颜色、荧光、折射率和复合复杂性方面引入适当的变 化，成像仿真模型可以经涉及并构造以代表和模拟适用于用多种显微技术成像的非常宽范 围的生物样本。在该成像仿真模型的元件内引入不同颜色的染料或其他有色试剂使得该仿真模 型适用于通过光学显微成像，其中由该仿真模型的有色材料对传输光的吸收产生了显微镜 图像，其可以用肉眼观察到或使用与该显微镜相连的适合的照相机捕获。在该成像仿真模 型的元件中引入不同的折射率改变剂使得该仿真模型适用于通过使用相差或相关特定照 明技术的光学显微术进行成像，其中由该仿真模型的材料对传输光的不同折射产生包括深 色和浅色区域的显微镜图像，其可以用肉眼观察到或使用与该显微镜相连的适合的照相机 捕获。在该成像仿真模型的元件中引入不同的荧光染料或其他荧光团使该仿真模型适用于 由荧光显微术成像，其中该仿真模型的荧光材料对激发光的吸收和随后该荧光在更长波长 处的发射产生显微镜图像，其可以用肉眼观察到或使用与该显微镜相连的适合的照相机捕 获。可以使用单一种类的显示剂构造成像仿真模型，即所述显示剂可以仅包括有色染料、折 射率改变剂或荧光染料。可替代地，在需要该成像仿真模型用于多于一种类型的显微镜或 用于能够在多于一种照明模式(例如相差和荧光)中成像的复杂显微镜的情况下，该成像 仿真模型可以包括不同种类的显示剂的混合物。例如，在需要具有尽可能接近地代表荧光 染色培养细胞的成像仿真模型的情况下，可以使用折射率改变剂和荧光染料的组合以提供具有与染色细胞具有非常相似特征的成像仿真模型，即以相差或荧光模式照明时制备显微 图像。依照本发明的成像仿真模型可以用于用于测量和/或校准和/或确认成像显微镜 的一个或多个参数的方法，或者可替代地用于确认和/或优化图像分析软件的方法。因此， 在第四方面中，提供了用于校准或确认成像显微镜的一个或多个参数的方法。该方法通常 包括在第一时间(T1)和第二时间(T2)获取至少一个(优选两个或更多个)本文所述成像 仿真模型的一个或多个图像，然后参考所述成像仿真模型的已知特征，使用如此制备的图 像定量比较在所述第一和第二时间时成像显微镜的性能。依照本发明的成像仿真模型的所 述已知特征可以作为对照值电子储存在数据库或其他电子形式中。适宜地，该成像显微镜参数经选择为预设的仪器设置，例如照明强度或滤光性。在 任意显微镜中优化的分辨率、灵敏度和图像质量的获取都高度取决于该样本的均勻照明。 在视场上照明强度的任意梯度都具有降低所得到的图像质量和限制样本完全可视的可能 性。使用该成像仿真模型以定期检查不同时间的照明强度和均勻性允许显微镜的使用者将 其装置维持在优化构造。由于该成像仿真模型是稳定和不变的，这与可能受到衰退破坏从 而无法再现性成像的生物样本不同，因此在不同时间可以记录图像并通过使用适合的图像 分析软件定量比较以确保该显微镜在所需的参数内运行。例如，包括一组或集合的可检测 复合元件的成像仿真模型可以经构造以代表分散在成像范围上的细胞群。使用显微镜组获 取该仿真模型的图像以提供优化照明，数字捕获一个或多个图像，并使用图像分析软件处 理以产生定量数据，例如目标/图像的数量、目标的平均尺寸等。在稍后的时间重复成像过 程并产生相同的数据，从而允许定量比较两组数据，其允许操作者确定该显微镜是否仍优 化操作或者是否需要一些调节。例如，如果第二组数据显示检测到比第一组数据中更少的 目标，这可能代表该显微镜照明已经变得亚优化，降低了该系统的灵敏性或分辨率。使用相同的成像仿真模型用于仪器校准允许可靠的发光测量，并且使得多于一个 仪器能够设定到相同的校准标准。因此，优选此处所述的成像仿真模型中所用的显示剂是 稳定的，且不发生物理或化学降解或光致褪色。在第五方面，本发明提供了用于校准和/或确认和/或优化图像分析软件的方法。 该方法包括提供成像显微镜；提供适合用于定量分析由所述显微镜提供的图像的图像分 析软件；提供一个或多个此处所述的成像仿真模型；获取该或各成像仿真模型的一个或多 个图像；使用该分析软件由至少一个所述图像产生定量数据；和，参比所述成像仿真模型 的已知特征，使用该数据定量确定所述软件用于图像分析的性能。例如，成像仿真模型可以 制备具有预设密度的可检测内部元件，其在该构造方法确定的已知范围内具有固定或变化 的间距(例如在可检测元件之间的间隔元件的尺寸)。这种仿真模型可以代表生长在平坦 表面上的培养细胞。为了优化或确认图像分析软件，将该仿真模型成像，使用待测试的软件 分析所得到的图像以确定该软件产生的定量数据是否与该仿真模型的已知参数相关联。例 如，对以已知的频率/单位面积包括一群已知面积的分散的可检测元件的荧光仿真模型进 行成像，通过在该图像中对强度值设置阈值来分割该图像以描绘目标，并计算目标面积和 频率/面积和将该数据与已知数值比较，从而提供了用于确认图像分析软件用于分析由该 仿真模型代表的特定生物样本的性能的定量手段。进一步地，可以使用该相同的程序优化 该图像分析软件内的设置，例如用于图像分割的阈值设置，用于提供优化的结果，即尽可能接近于已知值。在这方面，该仿真模型和生物样本相比的优势在于具有已知的尺寸、目标密 度等的值，因为该仿真模型经构造成预设的规格。发明详述在本发明的以下描述中，参照附图，其中

图1描绘了通过对杆进行浸渍、旋转和拉动制备成像仿真模型结构或块；图2描绘了通过杆阵列的自组装制备成像仿真模型结构或块；图3描绘了通过平面组件的旋转制备成像仿真模型结构或块；图4描绘了通过挤出模制制备成像仿真模型结构或块；图5描绘了通过杆阵列的随机组装制备成像仿真模型结构或块；图6描绘了通过将珠子包封在聚合物液滴中制备成像仿真模型结构或块。可以通过多种可替代技术制备处于伸长固体结构(或块)形式的聚合基质材料， 具体取决于是否需要规则的(有序的)内部元件阵列或者该内部元件是否以无序或无规律 的方式分布在基质内。例如，在一种程序中，可以通过如图1中所示的连续浸渍和旋转方法 制备成像块。使用聚合物杆(1)作为该仿真模型的核心以代表细胞核。该杆可以包括包含 有色染料、荧光染料、折射率改变剂或任意其他适用于通过将用于使该仿真模型成像的显 微术进行可视化的试剂的塑料或其他聚合物。例如，对于用于荧光显微术的细胞仿真模型， 该杆可以包括包含CyT5 (GEHealthcare)的聚合物。将该核心杆在第二聚合物的熔体或粘性溶液(2)中浸渍一次或多次，以用第二聚 合物的外层涂覆该核心杆到所需的厚度。该涂层代表该细胞仿真模型的内部细胞质区域。 该核心杆在该第二聚合物中的浸渍次数可以变化以实现代表天然细胞差异的不同涂层厚 度。对于第一聚合物，该第二聚合物包括适用于用于使该仿真模型成像的显微术的显示剂， 其中该试剂与该第一聚合物中所用的试剂不同以使得该代表细胞核和细胞质的两个层可 以通过成像分辨。例如，对于待用于荧光显微术的细胞仿真模型，该涂层可以包括包含Cy 3 (GE Healthcare)的聚合物。—旦该第二涂层聚合物已经达到所需的厚度，将所得到的涂覆杆与更小直径的另 外聚合物涂覆杆(3，4) 一起旋转以用代表亚细胞器(例如线粒体)的杆涂覆该细胞核和细 胞质仿真模型。用于代表亚细胞器的涂覆杆可以具有相同或不同的尺寸，且可以包括相同 或不同的显示剂，其中这些试剂与该核心杆和涂层中所用的试剂不同。该涂覆杆与该核心 杆之比可以变化以代表此处所述的细胞中的生物变化。在用杆(3)和(4)涂覆之后，再次将所得到的层状杆复合物重新浸渍到第二聚合 物熔体或溶液中以施加代表细胞质的外部区域的另外聚合物涂层(5)。该复合物在该涂覆 聚合物中的浸渍次数可以改变以实现代表细胞尺寸变化的不同的涂层厚度。一旦完成了该复合杆的制备，将该杆加热并通过拉动拉长，以将该复合物的直径 降低到适用于代表显微成像中的细胞的直径。制备最终细胞尺度仿真模型所需的拉伸程 度将取决于在制备中所用的元件的直径。典型的哺乳动物细胞核的尺寸为直径ΙΟμπι 30μπι;因此，以直径为IOmm的核心杆(1)开始该制备方法将会需要在该拉伸过程中实现 1 1000的降低比例，以将该复合物杆降低到细胞尺度。一旦将该杆拉出并降低到适合的直径，将该杆切割成常规长度。将来自相同或不 同的复合杆的多个长度(50)包埋入载体基质(6)中。该载体基质包片机(例如常规用于从树脂包埋组织样品中切片的那些)切片的聚合物或树脂。该树脂经 选择以具有不干扰该包埋仿真模型的成像的性质。一旦将该载体基质硬化，将所得到的包 含该复合杆的块切成适用于成像的适当厚度的横切片(64)，典型地为2 μ m 20 μ m。该载体基质经选择以具有与将采用的显微术成像相兼容的适合性质，例如对于荧 光显微术，该基质将会经选择以具有在激发该细胞仿真模型中的萤石所用的波长处具有零 或最小的荧光。从该基质块中取下的所得到的切片包括多个细胞仿真模型，使得该切片可以施加 到适合的成像载体上，例如玻璃载玻片或多孔成像板上，并使用与用于对在相同成像载体 上的单层培养细胞进行成像将会采用的相同的仪器设置和条件成像。通过设计(例如该聚 合物杆(1，3，4)的初始直径)以及通过无规变化(例如该涂层杆(3，4)的径向位置)，该制 备方法具有很多在最终形式中引入变化的机会。因此，通过制备多个复合杆并将其包埋到 公共基质(6)中，可以制备代表在细胞中观察到的宽范围生物变化的最终成像仿真模型， 使得该仿真模型可以用于使用不变样品进行宽范围的显微术和分析程序。也可以使用如图2中所示的自组装方法制备用于制备依照本发明的成像仿真模 型的结构或块。通过使用密堆排列组装适合尺寸的聚合物杆(7)和(8)，其中小杆(8)位于 较大的杆(7)之间的间隙中。该密堆排列提供了目标杆(8)的规则阵列，用间隔杆(7)以 规则间距隔开。目标杆可以包括包含有色染料、荧光染料、折射率改变剂或任意其他适用于 通过用于使该仿真模型成像的显微术可视化的试剂的塑料或其他聚合物。间隔杆可以包括 与目标杆相同或不同的聚合物，且没有显示剂，以使得在将所得到的阵列通过显微成像时 仅目标杆可视。为了组装该仿真模型，将目标杆和间隔杆以交替层形式放入在适合的容器中到所 需的宽度和高度。在组装之后，用载体基质填充该容器以包埋该阵列。该载体基质包括适用 于使用薄片切片机(例如常规用于从树脂包埋组织样品中切片的那些)切片的聚合物或树 脂。该树脂经选择以具有不干扰该包埋仿真模型的成像的性质。该杆阵列可以使用最终所 需尺寸的杆组装，或者可替代地，该阵列可以使用比最终仿真模型中所需的更大的杆组装， 通过拉动拉长降低该阵列的尺寸以将该尺寸降低到最终所需的尺寸。一旦该阵列具有最终 的所需尺寸，可以将包埋目标杆和间隔杆的块切成适用于成像的适当厚度的横切片(65)， 典型地为2 μ m 20 μ m。在这种具有直径⑶的间隔杆和直径⑷的目标杆的自组装阵列中，该目标杆⑶ 的中心间距等于该间隔杆(7)的直径(D)，该目标杆之间的边缘间距(χ)等于两种尺寸的杆 之间的直径差。因此，这种阵列能够用于确定显微镜和相关图像分析软件用于以分辨处于 限定间距的目标的能力。杆尺寸可以经选择以产生一定范围的结构，其中该目标杆的间距经变化以测试和 确认在一定范围尺寸上的成像，或者以模拟生物尺寸，例如该培养细胞或组织切片中细胞 核之间的间距。对于杆的密堆排列，具有直径(D)的大杆和具有直径(d)的小杆的相对直 径由下式给出d = TZDf — D例如，对于直径IOmm的间隔杆而言，4. 14mm的目标杆将形成具有IOmm的目标杆中 心间距和5. 86mm的目标杆边缘间距的密堆排列。这种阵列的组装和随后通过拉伸尺寸降低1000倍将会产生具有5. 86 μ m的目标杆间距的阵列。目标杆和间隔杆可以经选择使得所有目标杆具有相同的尺寸，所有间隔杆具有相 同的尺寸。在可替代的排列中，目标杆和间隔杆可以具有两种尺寸，其中所述杆的两种尺寸 可交换用于目标杆和间隔杆。在这种构造中，目标杆可以大(51)或小(52)，间隔杆可以大 (53)或小(54)，通过改变杆的布局，可以改变目标杆(51)和(52)之间的间距。这种方法 可使变化很大的结构用于待构造代表生物变化的成像仿真模型，但其尺寸受到目标杆和间 隔杆的相对尺寸和间距的严格限制。也可以通过如图3中所示的旋转方法组装用于制备成像仿真模型的结构或块。组 装了包括至少一个间隔层(9)和至少一个目标层(10)的平面夹层，其中该间隔层具有厚度 (X)。该目标层可以包括包含有色染料、荧光染料、折射率改变剂或任意其他适用于通过用 于使该仿真模型成像的显微术可视化的试剂的塑料或其他聚合物。该间隔层可以包括与该 目标层相同或不同的聚合物，且没有显示剂，以使得在将所得到的仿真模型通过显微成像 时仅目标层可视。为了构造该成像仿真模型，将该夹层旋转以形成以横截面(11)所示包括交织的 间隔层和目标层的螺旋的管，其中该目标层被以间隔层的厚度(X)所示的间距隔开。在旋 转之后，将该螺旋管加热或以其他方式处理以将所述层结合，以使得可以将该管切成薄的 横向切片以形成该成像仿真模型。这些仿真模型包括具有一系列交替的目标层和间隔层的 圆盘，其能够是图像，成像装置在360°的任意方向分辨分开的目标层的能力得以确定。在最初的平面夹层中的材料的尺寸可以经选择以符合该仿真模型在评价和确认 显微术仪器和/或图像分析软件中所需的最终用途。例如，如果需要测试由20 μ m间隔的 5 μ m物体的分辨能力，使用5 μ m厚的目标层和20 μ m厚的间隔层组装该平面夹层。经一步精制该平面夹层可以包括多个不同厚度的目标层和间隔层中的任一种或 两者的层，以使用与上述相同的原理在不同的分辨率下评价成像，即在该平面夹层中的任 意图案在最终仿真模型中在360°范围多次重复。例如，包括50μπι间隔层、20μπι目标层、 20 μ m间隔层和20 μ m目标层的叠层的平面夹层将会制备成像仿真模型，其具有分开的以 重复对50 μ m和20 μ m形式出现的目标层。该目标层可以是连续或不连续的，且可以包括多于一种显像剂。在一种实施方案 中，第一间隔层(55)可以支撑第二间隔层(56)，在第二间隔层中包埋目标杆以在该成像仿 真模型中代表细胞结构。目标杆可以具有多种经选择以代表亚细胞结构的尺寸的尺寸。例 如，可以使用大的目标杆(57)来代表细胞核，使用另外目标杆(58)代表细胞器。非必要 地，包括不同显像剂(例如不同的荧光染料)的另外目标杆(59)可以用于代表不同的细胞 器。将该平坦组件围绕核心目标杆(61)旋转成螺旋件(60)产生了如下结构在沿着对于 成像而言适当厚度的横截面切开时，形成代表具有被细胞器(62)和(63)环绕的中心细胞 核(61)的细胞的成像仿真模型。也可以通过如图4中所示的目标杆和间隔杆的无规组装来制造用于制备成像仿 真模型的结构或块。将一系列目标杆(25，26)与一系列间隔杆(27，28和29)混合在适合 的容器中以将该杆组装成无规阵列。该目标杆可以包括包含有色染料、荧光染料、折射率改 变剂或任意其他适用于通过用于使该仿真模型成像的显微术可视化的试剂的塑料或其他 聚合物。间隔杆可以包括与目标杆相同或不同的聚合物，而没有显示剂，以使得在将所得到的仿真模型通过显微成像时仅目标杆可视。目标杆可以经选择以具有不同的尺寸，例如使用大直径的杆(26)和小直径的杆 (25)。所得到的仿真模型可以模拟包括由大杆代表的细胞核和由小杆代表的亚细胞器的细 胞制备。目标杆中所用的显示剂可以在所有杆中相同，或者在各杆中可以使用不同的试剂。 例如，通过在一群杆(26)中使用红色荧光染料，而在第二群杆(25)中使用绿色荧光染料， 所得到的仿真模型可以模拟包括分别用红色和绿色荧光染料染色的细胞核和亚细胞器的 荧光染色细胞制备。间隔杆包括经选择以补充针对该目标杆选择的直径的直径范围，使得该间隔杆填 充无规阵列中的目标杆之间的缝隙。该无规阵列可以通过向该容器中连续添加目标杆和间 隔杆或者通过用杆的混合物填充该容器并搅拌或振动该容器以使不同尺寸的杆堆积在一 起且用小的间隔杆和目标杆填充大的间隔杆和目标杆之间的缝隙而组装。目标杆和间隔杆 的尺寸变化以及各杆类型相对数量的变化提供了非常宽范围的不同的待组装的成像仿真 模型构造。—旦将杆以无规阵列填充在一起，用载体基质(30)填充包含该形成阵列的杆的 容器(55)，以封装该阵列。该载体基质包括适用于使用薄片切片机(例如常规用于从树脂 包埋组织样品中切片的那些)切片的聚合物或树脂。该基质经选择以具有与该间隔杆的聚 合物相同或相似的光学性质。然后对该包埋阵列的横向切割产生可以用作仅目标区域可见 的成像仿真模型(31)的切片。也可以使用如图5中所示的挤出方法制备用于制备成像仿真模型的结构或块。挤 出装置包括环绕其他喷嘴(13和14)的喷嘴(12)，对各所述喷嘴供给液态或熔融基质材料， 适合地为具有不同成像性质的聚合材料。该基质可以是任意在硬化时可以切成适用于成像 的切片的熔融聚合物或催化树脂。供给该装置的各入口(66，15和16)的基质混合物可以包括有色染料、荧光染料、 折射率改变剂或任意其他适用于通过用于使该仿真模型成像的显微术可视化的试剂，其中 基质混合物的每一包括不同的试剂。例如，在需要制备代表荧光染色细胞的成像仿真模型 的情况下，该基质混合物会包括三种不同的荧光染料形成该挤出物的外壳(17)的基质 (66)包括用于代表该荧光染色细胞质的荧光染料，形成该挤出物的核心(18)的基质(15) 包括用于代表该荧光染色细胞核的不同光谱的第二荧光染料，形成该挤出物的壳内的包含 物(19)的基质(16)包括用于代表荧光标记的细胞器的不同光谱的第三荧光染料。基质从喷嘴中挤出产生了线性挤出物，其在沿横截面观看时包括三个不同的区 域壳(20)、核心(21)和包含物(22)。一旦通过冷却或树脂聚合使该挤出物硬化，可以将一 个或多个挤出物包埋在载体基质中，其中该载体基质经选择以具有适用于切割成薄横截面 的物理性质和不干扰包埋的仿真模型成像的成像性质。在包埋该挤出物之后，可以通过拉 动拉伸所得到的块以将该仿真模型的尺寸降低到适用于在显微镜成像中代表细胞的直径。 最后，将所降低的块切成横截面(24)，每个包含多个适用于成像的成像仿真模型(23)。可以通过如图6中所示的封装制备成像仿真模型。将载体液体(C)的恒定流供给 包括直径等于最终成像仿真模型所需直径的管的微流体通道(32)，其中该载体液体经选择 以与能够通过光聚合的光聚合物(P)的溶液不相混溶。典型地，该光聚合物包括水溶液，该 载体流体包括不相混溶的油。
该微流体通道(32)另外包括截取侧通道(33，34，35和36)，其允许将组分添加到 主通道中。将聚合物溶液(P)从侧通道(33)引入主通道中造成通过该聚合物(33)的进入 而置换该载体液体和通过控制添加到载体中的聚合物的量而可以形成聚合物的离散圆丸 (38)，其中该聚合物(P)与该载体液体不相混溶。通过该载体液体的流动该丸沿该主通道 移动通过第二侧通道(34)，在该位置激活侧通道中的流体流动以将单个珠子(39)从珠子 在载体液体(Bi)中的悬浮液中释放到主通道中，使得该珠子(40)被该聚合物的丸(41)封 装。在另一侧通道处重复该过程以在该丸中添加另外的珠子。在通道(35)处可以向正通 过的丸(42)中添加第二群珠子(B2)，使得该聚合物丸现在包含两个珠子(43和44)，在侧 通道(36)处，在该丸(45)中添加第三群珠子(B3)，以使得该丸包含三个珠子。该载体流体的进一步流动将该丸运送到光聚合区域，在此处用来自在围绕该通道 的适合光源(47)的光(48)使该丸(46)中的聚合物聚合。所得到的聚合物珠子(49)离开 该微流体通道进入用于洗涤的收集腔并用作三维成像仿真模型。通过适当选择该装置的主通道、该工艺中所用的侧通道和珠子的直径，可以将所 得到的仿真模型制备以模拟多种生物结构。例如使用包含直径为30 μ m的主通道和与直径 为10 μ m、5 μ m和2 μ m的三种珠子类型相结合的10 μ m、5 μ m和2 μ m的侧通道的装置，将 会能够制备包含10 μ m、5 μ m和2 μ m珠子的30 μ m直径的球形仿真模型，其适用于代表显 微成像中典型的哺乳动物细胞。在这种成像仿真模型中，该聚合物壳代表细胞质，该IOym 珠子代表细胞核，该5 μ m和2 μ m的珠子代表亚细胞器。为了制备成像仿真模型，该聚合物(P)和该珠子(Bi、B2和B3)包括有色染料、荧 光染料、折射率改变剂或任意其他适用于通过用于使该仿真模型成像的显微术可视化的试 剂，其中各聚合物和珠子群包括不同的显像剂。尽管描述了本发明的优选的示例性实施方案，但本领域的技术人员将认识到本发 明能够通过所描述的仅用于举例说明而绝不用于限定的实施方案之外的方式实施。本发明 仅由下面的权利要求限定。
权利要求
包含一个或多个可检测的内部元件的固体预制聚合基质材料，在用显微镜成像时其代表细胞或组织。
2.权利要求1的聚合基质材料，其中所述基质材料是伸长固体结构，和其中所述伸长 结构的横截面包括所述细胞或组织的一个或多个表征性特征，所述表征性特征沿长度方向 延伸通过该伸长结构。
3.权利要求1或2的聚合基质材料，其中所述可检测的内部元件包括代表真核细胞的 已制造的复合结构。
4.权利要求1或2的聚合基质材料，其中所述可检测的内部元件每个包含显示剂。
5.权利要求4的聚合基质材料，其中所述显示剂在每个所述内部元件中存在着可检测 的差异。
6.权利要求4和5的聚合基质材料，其中所述显示剂选自有色染料、荧光染料或折射率 改变剂。
7.权利要求1 6任一的聚合基质材料，其中所述基质材料是透明的或半透明的聚合物。
8.权利要求1的聚合基质材料，其中所述固体聚合基质材料基本是球形的，所述可检 测的内部元件包括包封珠。
9.权利要求8的聚合基质材料，其中所述可检测的内部元件代表真核细胞的细胞器。
10.权利要求8或9的聚合基质材料，其中所述一个或多个可检测内部元件的每一和所 述基质材料都包括显示剂。
11.权利要求10的聚合基质，其中所述显示剂在所述基质和所述一个或多个可检测的 元件的每一中存在着可检测的差异。
12.权利要求10和11的聚合基质，其中所述显示剂选自有色染料、荧光染料或折射率 改变剂。
13.成像仿真模型，包括从权利要求1 7中任一项的固体聚合基质中切下的均勻切 片，所述成像仿真模型可被显微术技术检测。
14.成像仿真模型，包括一个或多个根据权利要求8 12中任一项的基本为球形的聚 合基质，所述成像仿真模型可被显微术技术检测。
15.权利要求13或14的成像仿真模型，其中所述显微术技术是光学显微术。
16.权利要求15的成像仿真模型，其中所述显微术技术是荧光显微术。
17.权利要求13或14的成像仿真模型，其中所述显微术技术是相差显微术。
18.用于校准和/或确认成像显微镜的方法，该方法包括a)提供成像显微镜；b)提供一个或多个根据权利要求13 17任一项的成像仿真模型，所述成像仿真模型 包括包含一个或多个可检测的内部元件的固体预制聚合基质，在用显微术成像时其代表细 胞或组织；c)在第一时间(T1)获取所述一个或多个成像仿真模型的一个或多个图像；d)在第二时间(T2)获取所述一个或多个成像仿真模型的一个或多个图像；e)参比所述成像仿真模型的已知特征，使用所述图像定量比较在所述第一时间(T1)和 所述第二时间(T2)所述成像显微镜的性能。
19.用于优化成像显微镜设置的方法，该方法包括a)提供成像显微镜；b)提供一个或多个根据权利要求13 17任一项的成像仿真模型，所述成像仿真模型 包括包含一个或多个可检测的内部元件的固体预制聚合基质，在用显微术成像时其代表细 胞或组织；c)使用第一选择的设置(S1)获取所述一个或多个成像仿真模型的一个或多个图像；d)使用第二选择的设置(S2)获取所述一个或多个成像仿真模型的一个或多个图像；e)参比所述成像仿真模型的已知特征，使用所述图像定量比较在所述第一设置(S1)和 所述第二设置(S2)所述成像显微镜的性能。
20.用于校准和/或确认和/或优化图像分析软件的方法，该方法包括a)提供成像显微镜；b)提供适合用于定量分析由所述显微镜产生的图像的图像分析软件；c)提供一个或多个根据权利要求13 17任一项的成像仿真模型，所述成像仿真模型 包括包含一个或多个可检测的内部元件的固体预制聚合基质，在用显微术成像时其代表细 胞或组织；d)获取该或每一成像仿真模型的一个或多个图像；e)使用所述分析软件由所述图像产生定量数据；f)参比所述成像仿真模型的已知特征，使用所述数据定量确定所述软件用于图像分析 的性能。
21.权利要求18 20任一项的方法，其中所述一个或多个成像仿真模型的每一个彼此 不同。
全文摘要
本发明涉及用于确认、优化和校准显微术仪器以及用于分析显微镜图像的软件的成像仿真模型。本发明的材料和方法特别可用于高容量筛选和高容量分析中。
文档编号G01N21/64GK101910828SQ200880123754
公开日2010年12月8日 申请日期2008年10月29日 优先权日2007年11月2日
发明者N·托马斯 申请人:通用电气医疗集团英国有限公司