专利名称:内毒素的测定方法和内毒素的测定用试剂盒的利记博彩app
技术领域:
本发明涉及检测内毒素或测定其浓度的方法,以及用于其检测或浓度测定的试剂盒。
背景技术:
内毒素是在革兰氏阴性菌的细胞壁中存在的脂多糖,是最具代表性的热源。如果 被内毒素污染的输液、注射药剂、血液等进入人体,则存在引起发热或休克等重度副作用的 可能。因此,有义务管理上述的药剂、器具等,以使其不被内毒素污染。在鲎的血细胞提取物(以下,也称作“LAL 鲎变形细胞裂解物”)中,存在被内毒 素活化的丝氨酸蛋白酶。并且,在LAL与内毒素反应时,对应于内毒素的量所活化的丝氨酸 蛋白酶引起酶的级联,由此在LAL存在的凝固蛋白原水解为凝固素并发生聚集,生成不溶 性的凝胶。作为测定该内毒素的浓度的方法,具有半定量的凝胶化法将与LAL混合的样品 静置,在一定时间后翻转容器,根据样品有无垂落判断是否发生凝胶化,确定在样品中是否 含有一定浓度以上的内毒素。另外,作为内毒素的其它高灵敏度定量法,具有随着LAL和内 毒素反应引起的凝胶的生成,经时性地测定样品的混浊并进行解析的比浊法,或使用由酶 的级联引起水解并发色的合成基质的比色法。在上述的定量法中,比浊法存在在使低浓度的内毒素作用时,由于被活化的酶少 因此到检测出凝胶的生成为止需要非常长的反应时间的情况。另一方面,比色法存在容易 受样品的混浊(血脂等)或混入的色素(溶血所致的血红蛋白等)影响的不良情况。由于 这些情况,特别是在急救时测定患者血液中的内毒素,或在人工透析时测定透析液或血液 中的内毒素时,不能说上述比浊法或比色法是最合适的方法。另外,提出激光散射粒子测量法通过搅拌使LAL和内毒素混合得到的样品使微 粒迅速生成,同时由被凝胶微粒散射的激光的强度解析凝胶微粒的大小和数量,测定凝聚 初期的凝胶微粒生成。有报告称,根据该方法,与比浊法相比,可以使测定时间缩短至三分 之一,且可以降低样品的混浊或颜色的影响。但是,即使使用上述的激光散射粒子测量法,在1EU(内毒素单位)/L左右的低浓 度的内毒素的测定中,也需要40 50分钟的测定时间。另外,在激光散射粒子测量法中, 由于观察微小空间区域的粒子,因此存在光学体系变得复杂,难以进行多样本测定的不良 情况。专利文献1 日本专利第2667695号公报
发明内容
本发明是鉴于上述问题作出的发明,其目的在于,提供一种不易受样品混浊或颜 色的影响、能够迅速且简便地进行内毒素检测或浓度测定的技术。本发明所述的内毒素的测定方法以以下方面为最大特征。即,制作在LAL中所含的蛋白质吸附或结合在预先准备且分散于药液中的微粒之上的试剂。并且,通过使含有内 毒素的样品作用于该试剂,使微粒彼此聚集,迅速地生成大的凝聚体,检测该凝聚体的生 成,由此进行内毒素的测定。更具体地,是检测样品中的内毒素或测定样品中的内毒素的浓度的内毒素的测定 方法,其特征在于,使在鲎的血细胞提取物中所含的规定蛋白质结合或吸附在可分散于试剂中的微 粒的表面,使结合或吸附上述蛋白质的上述微粒分散得到的试剂和样品混合,通过检测上述试剂和上述样品的混合液中的凝胶生成,进行内毒素的检测,或通 过测定上述凝胶的生成程度,测定内毒素的浓度。在此,通过申请人的深入研究,可知如果在LAL中所含的蛋白质结合或吸附在例 如树脂制的微粒上的状态下,使内毒素起作用,则与使含有内毒素的样品作用于LAL单体 的情况相比,可以迅速地生成更大的凝聚体。这是由于,微粒上的凝固蛋白原通过LAL中的 酶的级联水解,生成凝固素,这些微粒彼此聚集的原因。另外,还明确了该凝集反应不易受 样品混浊或颜色的影响,而且,该凝集反应与用LAL单体引起的凝集反应相比,非常强大。在本发明中,利用这种现象,制作LAL中所含的蛋白质结合或吸附在微粒上的试 剂,使含有内毒素的样品作用于该试剂(以下,也称为“LAL试剂”),由此使微粒彼此聚集, 而迅速地生成更大的凝聚体,促进LAL试剂和样品的混合液中的凝胶的生成。这样,在内毒 素的检测和浓度测定(以下,也将这些合并称为“内毒素的测定”)中,可以降低样品混浊或 颜色的影响,另外,可以更加迅速且简便地进行检测和浓度测定。应予说明,上述的规定蛋白质是具有与内毒素反应并生成凝胶的特性的物质,至 少含有凝固蛋白原。另外,也可以含有丝氨酸蛋白酶等其它的蛋白质。另外,在本发明中, 凝胶的生成的意思是指,包含上述的微粒彼此聚集引起的凝聚体的生成,未结合或吸附至 微粒的凝固素聚集引起的凝胶粒子的生成,LAL试剂和样品的混合液的凝胶化中的至少任
一现象。另外,在本发明中,凝胶生成的程度的意思是指,例如,上述微粒彼此聚集引起的 凝聚体,和未结合或吸附至微粒的凝固素聚集引起的凝胶粒子的大小或数目的增加。或者, 意思是LAL试剂和样品的混合液的凝胶化引起的混合液的物理、化学特性(例如,浊度)的 变化。此处,上述规定蛋白质可以是由鲎的血细胞提取物纯化得到的凝固蛋白原。如上所述,在使内毒素作用于LAL时的凝集反应中,凝固蛋白原通过LAL中的酶的 级联水解,生成凝固素,这些微粒彼此聚集。因此,通过预先纯化LAL中的蛋白质,只提取凝 固蛋白原并事先结合或吸附至微粒,可以更有效地使微粒彼此聚集,可以更迅速地生成凝 聚体。另外,在本发明中,在上述规定蛋白质含有丝氨酸蛋白酶和凝固蛋白原时,在上述 规定蛋白结合或吸附的上述微粒分散的试剂中,在试剂的制备过程中,还可以添加抑制该 试剂中的丝氨酸蛋白酶和凝固蛋白原反应的抑制剂。其中,在LAL中所含的蛋白质结合或吸附于微粒上时,首先,使能够结合、吸附蛋 白质的官能团存在于微粒的表面。并且,在该状态下使LAL试剂起作用,使蛋白质化学结合至微粒表面,或使其静电性地、亲水性地、疏水性地吸附。此时,认为由于LAL中的蛋白质和 微粒的结合、吸附反应需要长时间,在微粒或使用的试剂类、水等中微量混有的内毒素与蛋 白质中的丝氨酸蛋白酶反应,将凝固蛋白原水解为凝固素,结果微粒开始凝聚。并且在此 时,认为酶的活化引起试剂中的凝固蛋白原水解而消耗。与此相对,在本发明中,在上述规定蛋白质含有丝氨酸蛋白酶和凝固蛋白原时,在 结合或吸附上述规定蛋白质的上述微粒分散得到的试剂中,添加抑制该试剂中的丝氨酸蛋 白酶和凝固蛋白原反应的抑制剂。由此,抑制在试剂的制备过程中的微粒的凝聚,同时抑制 酶的活化导致凝固蛋白原水解而消耗。具体地,上述抑制剂可以是已知具有使内毒素失活作用的铁离子或铝离子。另外, 也可以是使LAL中的丝氨酸蛋白酶不活化的酶抑制剂。另外,在本发明中,将结合或吸附上述规定蛋白质的上述微粒分散得到的试剂进 一步与鲎的血细胞提取物混合,在与上述混合同时或在混合后,可使上述试剂和上述样品混合。由此,相对于结合或吸附蛋白质的微粒分散得到的试剂,可以进一步预先补给LAL 中的蛋白质。这样,在与含有内毒素的样品混合时,可以更可靠地使内毒素作用于试剂中的 丝氨酸蛋白酶,将结合或吸附在微粒上的凝固蛋白原和混合的LAL中的凝固蛋白原水解, 生成凝固素。结果,可以更可靠地使结合或吸附在微粒上的凝固蛋白原之间,或者结合或吸 附在微粒上的凝固蛋白原和混合的LAL中的凝固蛋白原聚集,可以促进以微粒为中心的凝 聚体的生成。这样,可以在更短的时间进行内毒素的测定。另外,据此,预先纯化LAL中的蛋白质并只提取凝固蛋白原,使其结合或吸附至微 粒的情况,或者在上述试剂的制备过程中,添加抑制试剂中的丝氨酸蛋白酶和内毒素的反 应的抑制剂的情况也是有利的。即,在这些情况下,在将上述试剂和含有内毒素的样品混合 时,可以更可靠地使内毒素作用于丝氨酸蛋白酶。应予说明,在上述中,将结合或吸附上述规定蛋白质的上述微粒分散得到的试剂 进一步与鲎的血细胞提取物混合,之后再与含有内毒素的样品混合时,该混合时期可以在 与上述血细胞提取物混合后,也可以与混合同时。但是,从使补给至试剂中的凝固蛋白原或 丝氨酸蛋白酶更均勻地分散的观点考虑,优选与含有内毒素的样品的混合在由上述试剂和 上述血细胞提取物混合时开始经过规定时间后进行。另外,本发明可以是内毒素测定用试剂盒,其特征在于,使鲎的血细胞提取物中所 含的规定蛋白质结合或吸附在可分散在试剂中的微粒的表面而制备。其中,规定蛋白质是具有与内毒素反应并生成凝胶的特性的蛋白质,至少含有凝 固蛋白原。另外,还可以含有丝氨酸蛋白酶等其它蛋白质。另外,在本发明所述的内毒素测定用试剂盒中,规定蛋白质可以是由鲎的血细胞 提取物纯化的凝固蛋白原。另外,在本发明所述的内毒素测定用试剂盒中,规定蛋白质含有丝氨酸蛋白酶和 凝固蛋白原,可以在结合或吸附上述规定蛋白质的上述微粒分散得到的试剂中,进一步添 加抑制上述丝氨酸蛋白酶和凝固蛋白原反应的抑制剂。此处,如上所述,认为在使鲎的血细胞提取物中所含的规定蛋白质结合或吸附在 可分散于试剂中的微粒的表面来制备试剂盒时,在微粒或使用的试剂类、水等中微量混有的内毒素与蛋白质中的丝氨酸蛋白酶反应。这样,认为在试剂制备过程中,将凝固蛋白原水 解为凝固素并开始微粒的凝聚,结果消耗试剂中的凝固蛋白原。与此相对,在本发明所述的内毒素测定用试剂盒中,在上述规定蛋白质含有丝氨 酸蛋白酶和凝固蛋白原时,在结合或吸附上述规定蛋白质的上述微粒分散得到的试剂中, 进一步添加抑制上述丝氨酸蛋白酶和内毒素反应的抑制剂。这样,可以抑制在试剂的制备 过程中的微粒的凝聚,同时可以抑制酶的活化导致凝固蛋白原水解而消耗。此处,上述抑制 剂可以是铁离子或铝离子,还可以是酶抑制剂。另外,在本发明所述的内毒素测定用试剂盒中,可以将结合或吸附上述规定蛋白 质的上述微粒分散得到的试剂进一步与鲎的血细胞提取物混合而制备。应予说明,对于解决上述本发明的问题的方法,可以尽可能地组合使用。本发明可以不易受样品混浊或颜色的影响、能够迅速且简便地进行内毒素检测或 浓度测定。
图1是用于说明本发明的实施例中的LAL结合珠的凝聚机制的图。图2是用于说明在将本发明的LAL结合珠试剂与含有内毒素的样品混合时,LAL结 合珠的量与混合液的透射光强度的变化的关系的图。图3是用于说明在将本发明的LAL结合珠试剂与含有内毒素的样品混合时,内毒 素的浓度与混合液的透射光强度的变化的关系的图。图4是用于说明在使用LAL结合珠法时和使用激光散射粒子测量法时,在LAL中 的蛋白质和内毒素的反应中,比较内毒素的浓度与凝胶凝聚开始时间的关系的图。符号说明1...珠2...凝固蛋白原3···凝固蛋白原10. . . LAL 结合珠
具体实施例方式详细地研究LAL和内毒素反应生成凝胶的过程。即,认为如果内毒素结合至LAL 中作为丝氨酸蛋白酶的C因子,则C因子活化,活化的C因子使LAL中的其它的作为丝氨酸 蛋白酶的B因子水解并活化。该活化的B因子直接将LAL中的凝固酶前体水解并形成凝固 酶,进一步地,该凝固酶将LAL中的凝固蛋白原水解,生成凝固素。并且,生成的凝固素彼此 聚集,进一步生成不溶性的凝胶。这一系列反应与可见于哺乳动物中的介由凝血因子IX或凝血酶等的丝氨酸蛋白 酶的纤维蛋白凝胶的生成过程类似。这样的酶级联反应即使有极少量的活化因子,也由于 连锁其后的级联而活化,因此具有非常强的放大作用。因此,根据使用LAL的内毒素测定 法,能够检测亚皮克/mL级别的极其微量的内毒素。作为可以定量内毒素的测定方法,如上所述,列举比浊法以及激光散射粒子测量 法。这些测定方法可以将通过该LAL酶级联反应生成的凝固素的聚集物在前者作为样品的混浊,在后者作为体系内生成的凝胶微粒进行检测,由此可以进行高灵敏度的测定。但是,在比浊法中,由于每个凝固素都是纳米级别的微小粒子,因此即使它们逐渐 聚集,如果不成长至可光学检测的大小,也无法作为浊度进行检测。另外,在比浊法中,一 般将样品静置,等待全体体系中凝胶的生成,因此凝固素彼此的碰撞概率低,聚集速度未必 快。因此,在使用比浊法时,存在到可以检测内毒素或浓度测定为止需要相当长的时间的不 良情况。与此相对,在激光散射粒子测量法中,由于直接测定在体系内生成的凝胶的微粒, 因此较比浊法的灵敏度要高,且由于一般强制搅拌包含LAL和样本的样品,因此与比浊法 相比可以在短时间检测凝胶的生成。但是,在激光散射粒子测量法中,由于观察微小空间区域的粒子,因此存在光学系 统变得复杂,难以通过简便的装置进行测定的不良情况。另外,作为其它的内毒素测定法,有比色法。这是利用LAL的酶级联反应的同时, 不测定凝固蛋白原所致的样品的混浊,而是利用受凝固酶水解而发色的合成基质,使含有 合成基质的LAL和样本反应,测定其吸光度变化的方法。在该比色法中,由于测定在体系内 生成的发色物质的浓度,因此,与测定在样品中的凝胶生成的比浊法和激光散射粒子测量 法相比,可以在短时间测定低浓度的内毒素。但是,发色合成基质在405 410nm附近处有吸收峰,该波长与伴随溶血而混入样 品中的血红蛋白的吸收峰(410nm)重叠。另外,由于血液中的乳糜等白色散射体对越短的 光波长越产生散射,因此发色合成介质的吸收峰即使位于可见光区域,最短波长侧(紫)的 光也特别容易受到白色散射体的影响。这样,虽然比色法的测定时间为极短的时间,但在另 一方面,对于以血液为主体的样本的测定,存在精度方面的问题。在本发明中,将降低样品的浊度或颜色对测定的影响作为目的之一。因此,不是 比色法这样的使用发色合成基质的方法,而是利用LAL的酶的级联引起的凝固素的生成过 程。进一步地,还将下述测定方法的确立作为目的之一,该测定方法虽然与比浊法类似,但 可以比激光散射粒子测量法在更短时间内进行测定,且装置构成容易。因此,不利用被动地 等待由LAL的酶级联引起的由凝固蛋白原到凝固素的水解和逐渐的聚集过程的方法。以下,参照附图,示例性地详细说明用于实施本发明的最佳实施方式。实施例1在本实施例中,预先使凝固蛋白原结合至用比浊法或激光散射粒子测量法可检测 的、或者比可检测的界限小若干尺寸的微粒的表面。并且,在将其与LAL试剂混合而制备的 试剂中混合含有内毒素的样品。由此,使得在LAL中生成的凝固素和在微粒上生成的凝固 素聚集,或者,使得在微粒上生成的凝固素聚集,在短时间生成可用比浊法或激光散射粒子 测量法检测的尺寸的凝聚体。结果,通过比浊法或激光散射粒子测量法,可以更加迅速地进 行内毒素的测定。在图1中,表示本实施例引起的微粒的凝胶机制。在图1中,中央箭头的左侧是与 内毒素反应前的试剂的示意图。箭头的右侧是与内毒素反应后的试剂的示意图。如图1所示,反应前,本实施例中的作为微粒的珠1、结合在微粒表面的凝固蛋白 原2和未结合在微粒表面的凝固蛋白原3是分散的状态。应予说明,以下为了方便,将使凝 固蛋白原2结合至珠1的状态的微粒称为LAL结合珠10。
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在作为结合凝固蛋白原2的载体的珠1上,可以吸附、担载或结合LAL中蛋白质所 含的凝固蛋白原2,能在反应体系内均勻分散,且选择既不妨碍内毒素引起的凝胶生成过程 又不使其亢进的物质。珠1的材料没有特别限定,但可以示例聚苯乙烯胶乳树脂、二氧化 硅、有机硅树脂、纤维素树脂、聚乙烯醇树脂、羟基磷灰石等,优选聚苯乙烯胶乳树脂、二氧 化硅、纤维素树脂。珠1的大小从可通过凝聚提前进行光学检测的条件、制备时的操作的容易程度、 在体系内分散的容易程度等出发,使用0.05μπι 50μπι范围的珠。并且,进一步优选 0. 1 30 μ m的范围。在使凝固蛋白原2结合至珠1的表面中,可考虑亲电性地、亲水性地 或疏水性地使凝固蛋白原2吸附的方法,和使其化学结合的方法。为使凝固蛋白原2亲电性地、亲水性地或疏水性地吸附于珠1,在珠1的表面必须 存在可以担载凝固蛋白原2的官能团。作为这样的官能团,可以列举氨基、羧基、磷酸基、羟
基、磺酸基、巯基、醇基 、焼基等。另一方面,在使凝固蛋白原2化学性地结合至珠1表面时,必须存在可以与凝固蛋 白原2的侧链中所含的氨基、羧基、巯基等化学结合的官能团。作为这样的官能团,可以列 举羧基、氨基、乙烯基、环氧基、苯乙烯基、甲基丙烯酰氧基、丙烯酰氧基、酰脲基、巯基、硫醚 基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基等。使LAL试剂或由LAL试剂等制备、纯化的凝固蛋白原作用于在表面具有这些官能 团的聚苯乙烯胶乳树脂、二氧化硅、有机硅树脂、纤维素树脂、聚乙烯醇树脂、羟基磷灰石等 的珠1。由此,使凝固蛋白原2静电性地、亲水性地或疏水性地吸附、担载在珠1的表面。另 外,珠1上的反应性官能团和凝固蛋白原2经由凝固蛋白原2中的氨基、羧基或者巯基等进 行化学结合。由此,可以制备LAL结合珠10。此时的反应温度和反应时间由能否进行吸附、担载决定,或由能否进行化学结合 决定,但优选反应温度为0°c 45°C,进一步优选为4°C 37°C。另外,反应时间优选为10 分钟 64小时,进一步优选为2小时 24小时。另外,优选将样品进行充分搅拌,以使在 反应时发生均勻的反应。应予说明,在珠1上吸附、担载、结合凝固蛋白原2时,可以使LAL中所含的蛋白质 无区别地吸附、担载、结合至珠1,也可以将LAL中的凝固蛋白原纯化来进行吸附、担载、结 合。在采用使在LAL中所含的蛋白质无区别地吸附、担载、结合至微粒的方法时,在珠1上 也吸附、担载、结合凝固蛋白原2以外的蛋白质,但由于可以省略纯化LAL中的凝固蛋白原 的工序,因此可以降低试剂的制备、纯化涉及的成本。应予说明,此时,在图1中,在珠1上 和珠1的周围的试剂中,除了凝固蛋白原2、3以外,更多地存在LAL中所含的其它的蛋白质 (未示出)。另外,在上述中,凝固蛋白原或LAL中的蛋白质和珠1的吸附、担载、结合的反应是 长时间的。因此,认为在珠1自身或使用的试剂类、水等中混入即使微量的内毒素时,在试 剂完成前,因混入的内毒素而活化的凝固酶使凝固蛋白原水解并生成凝固素,在体系内凝 聚。为了将其抑制,可以在体系内添加已知具有使内毒素失活作用的铁离子或铝离子。优 选此时添加的铁离子或铝离子的浓度为IOOmM以下。另外,为了不使LAL中的丝氨酸蛋白酶活化,还可以添加各种酶抑制剂。作为这样 的酶抑制剂,可以示例二异丙基氟磷酸酯、苄脒、苯基甲磺酰氟、4-(2_氨乙基)苯磺酰氟、6-脒基-2-萘基-4-胍基苯甲酸酯二甲磺酸酯、对脒苯基甲磺酰氟、抑酶酞、抗蛋白酶、亮抑 蛋白酶肽、大肠杆菌素(Ecotin)、PPACK(苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-氯甲酮)、α 2-巨 球蛋白、胰蛋白酶抑制剂等。这些酶抑制剂的浓度可以为IOOmM以下。并且,进一步优选为 20mM以下。在此状态下,LAL结合珠10彼此可以完全独立地分散。另外,通过吸附、担载或化 学结合的作用,在LAL结合珠10的一部分或全部中,多个珠可以交联。这样制备的LAL结合 珠10之后以除去未结合至珠1的过量LAL中的蛋白质或凝固蛋白原,还有铁离子、铝离子 或酶抑制剂等的添加物的目的出发,用不含内毒素的纯化水或生理盐水等进行洗涤。并且, 使其在这些纯化水或生理盐水等中再悬浊,以形成符合最终使用目的的浓度,供给使用。以 下,将该状态的试剂称为LAL结合试剂。其次,说明本实施例中的利用LAL结合珠试剂的实际的内毒素的检测或浓度测 定。在本实施例中,对于以下的情况进行说明对于上述LAL结合珠试剂,进一步混合LAL 试剂,使混合后的试剂与含有内毒素的样本样品混合。应予说明,在以下的说明中,在制备 上述LAL结合珠试剂时,以添加酶抑制剂为前提。其中,如上所述,在LAL结合珠试剂的制备阶段,通过洗涤除去未结合至珠1的过 量的LAL中的蛋白质、或由LAL中蛋白质纯化得到的凝固蛋白原3。另外,吸附、担载、结合 至珠1的丝氨酸蛋白酶由于酶抑制剂的添加而被不可逆地抑制。因此,即使将该状态的LAL 结合珠试剂单独与含有内毒素的样品混合,也不能期待LAL结合珠10的凝聚。因此,在本实施例中,将LAL结合珠试剂进一步与LAL试剂混合后,与含有内毒素 的样品混合,使LAL结合珠10凝聚。由此,可以对LAL结合珠试剂补给以丝氨酸蛋白酶为 代表的LAL中的蛋白质的各成分。这样,在与含有内毒素的样品混合时,可以更可靠地使内 毒素作用于试剂中的丝氨酸蛋白酶,可以更可靠地水解凝固蛋白原并生成凝固素。结果,可 以更可靠地使LAL结合珠10凝聚,进行迅速的内毒素测定。另外,此时,由于经补给的LAL试剂中含有凝固蛋白原,因此通过来自经补给的 LAL试剂中的凝固蛋白原的凝固素,还可以期待促进LAL结合珠10的凝聚的效果。另外,在本实施例中,即使LAL结合珠10上的丝氨酸蛋白酶失活,由于在混合的 LAL试剂中存在过量的丝氨酸蛋白酶,因此也可以使用在制备LAL结合珠试剂时具有不可 逆的、且强作用的酶抑制剂。如上所述制备的LAL结合珠试剂为了谋求测定的便利性,还可以进行以下制备 通过使规定量的LAL结合珠试剂冷冻干燥,只加入样本样品就可以测定。另外,在此时,可 以将冷冻干燥的LAL试剂和同样冷冻干燥的LAL接合珠试剂以任意比例混合,或者也可以 将LAL结合珠试剂和LAL试剂以任意比例混合后进行冷冻干燥。(制造例1)其次,说明在珠表面具有羧基的聚苯乙烯胶乳粒子和LAL试剂,在使不可逆的 酶抑制剂起作用的环境下结合的LAL结合珠试剂的实际制造例。作为在表面具有羧基 的珠 1,使用 Polyscience 公司制的粒径 0. 45 μ m 或 1. 0 μ m 的 Polybead Calboxylate Microsphere (以下简称为 “PCM”)。作为LAL试剂,使用和光纯药制的内毒素检测试剂,即'J幻B HS-T ν > ^ ^ r ^卜7 ^ —(以下简称为“LAL试剂”)。将1. OmL的PCM置入最大容量2. OmL的离心管,进一步加入PH 9. 6的0. IM碳酸缓冲液至最大容量,充分混合后,用台式离心机以12500rpm 进行5分钟离心,使PCM沉淀除去上清液。进一步重复两次这样的与碳酸缓冲液的混合、离 心、除去上清液的一系列的操作,接着,在沉淀的PCM中加入pH 4. 5的0. 02M的磷酸缓冲液 至最大容量,使其混合后,同样地进行总共3次离心、除去上清液的操作。
在得到的PCM沉淀物中加入在此使用的磷酸缓冲液0. 75mL,进一步地,加入 0. 75mL的2. 0%碳二亚胺水溶液(水溶性碳二亚胺,同仁化学制),在室温使用翻转搅拌法 搅拌3小时,使PCM上的羧基活化。反应后的PCM离心并除去上清液后,再次,用同样的磷 酸缓冲液洗涤3次,在最后得到的PCM沉淀物中加入pH 8. 5的0. 2M硼酸缓冲液0. 5mL并 使其悬浊后,接着,准备在LAL试剂中加入硼酸缓冲液0. 25mL并使其溶解得到的LAL试剂 溶液2支,将它们与PCM悬浊液混合,使容量为1. OmL0进一步地,在其中加入作为丝氨酸蛋 白酶抑制剂的PMSF(苯基甲磺酰氟),以使最终浓度为4mM。在室温反应2小时后,在4°C反 应过夜,以使混合溶液中PCM上存在的活化的羧基与LAL中的各蛋白质具有的氨基形成酰 胺键。将混合溶液离心除去上清液后,在1. 2mL的硼酸缓冲液中再悬浊,进一步地,在该 溶液中加入50 μ L的0. 25Μ的2-氨基乙醇/硼酸缓冲液,在室温翻转搅拌30分钟后,用氨 基乙醇消耗PCM上未反应的活化羧基。最后,在离心PCM悬浊液并得到PCM沉淀物后,总计 进行3次用注射用生理盐水(大冢制药制)再次悬浊、离心、除去上清液的一系列操作,进 行洗涤,得到LAL结合珠试剂。(测定例1)接着,对于实际使用在上述制造例1得到的LAL结合珠试剂的测定例1进行说明。 在注射用生理盐水中使在制造例1得到的LAL结合珠试剂悬浊,形成10mL。将各种量的LAL 结合珠悬浊液与注射用水(大冢制药制)混合,形成100 μ L0进一步地,将其与LAL试剂 ('J ^^ ^ HS-T * >夕‘义〒;^卜7 ^ —)混合,进一步加入2EU/L的浓度的内毒素水溶液 IOOuL0将该合计200 μ L的混合液转移至外径7mm、在内部具有磁力搅拌器、且干热灭菌 (250°C,5小时)处理的玻璃制测定小杯,用可以边搅拌样品边随时间记录浊度变化的血小 板凝聚测定装置PA-200 (興和制),记录随着LAL结合珠10的凝聚,透射光强度的时间变 化。在图2中,表示通过上述测定得到的透射光强度的时间变化。在图2中,横轴为时 间,纵轴为混合液的透射光强度。在图2中,记录的数据以搅拌开始5分钟后的透射光强度 为100%,表示出在LAL结合珠10的添加量不同时的各样品的透射光强度的变化。根据图 2判定,添加的LAL结合珠10的量越多,则变化量可以越大,且凝聚的开始时间越早。其中,在将本实施例中的LAL结合珠试剂用于内毒素检测时,例如在图2中透射光 强度达到规定值,可以判断样品含有内毒素。此时,根据本实施例,添加的LAL结合珠10的 量越多,内毒素的检测所需要的时间可以越短。其中,在图2中透射光强度达到规定值,判 断样品含有内毒素,这在混合液中的凝胶生成检测中相当于进行内毒素检测。(测定例2)接着,对于使用在制造例1得到的LAL结合珠试剂的其它的测定例进行说明。在 本测定中,在注射用生理盐水中使在制造例1得到的LAL结合珠试剂悬浊,形成20mL。由其 中取出100 μ L,在LAL试剂中混合,进一步地,与含有各种浓度的内毒素水溶液100 μ L混
10合,使总计容量为200 μ L。并且,与上述测定例1相同地,对于各种样品,记录以搅拌开始5 分钟后的透射光强度为100%的透射光强度的变化。在图3中,表示通过本测定得到的透射光强度的时间变化。在图3中,横轴为时间, 纵轴为混合液的透射光强度。如图3所示,样品中内毒素的添加浓度越高,透射光强度的上 升越剧烈,凝聚开始时间越短。即,在将本实施例的LAL结合珠试剂用于内毒素的浓度测定 时,例如在图3中,可以基于透射光强度到达规定值所需要的时间(凝聚开始时间),进行浓 度测定。另外,在本发明中,这在测定凝胶的生成程度中,相当于内毒素浓度的测定。接着,将此时得到的内毒素浓度和凝聚开始时间的关系与不使用LAL结合珠10时 在激光散射粒子测量法得到的内毒素的浓度和凝聚开始时间的关系进行比较。比较结果在 图4表示。如图4所示,在使用LAL结合珠10时(在图4中,为了简便,记载为“LAL结合 珠法”),虽然使用比浊法,与使用激光散射粒子测量法时相比,凝聚开始时间缩短。由此可 知,通过使用LAL结合珠10,与使用激光散射粒子测量法时相比,可以迅速地检测内毒素。应予说明,在本实施例的制造例1中,使在LAL中所含的蛋白质无区别地结合至珠 1,制备LAL结合珠试剂。但是,如本实施例所述,在将LAL结合珠试剂进一步与LAL试剂混 合后,与含有内毒素的样品混合,使LAL结合珠10凝聚时,优选在形成LAL结合珠10的珠1 上尽可能多地吸附、担载、结合凝固蛋白原。因此,在生成LAL结合珠10时,与其使LAL中 所含的蛋白质无区别地结合至珠1,不如使纯化的凝固蛋白原吸附、担载、结合至珠1。另外,如本实施例所述,在使LAL中的各蛋白质无区别地吸附、担载、结合至珠1, 制备LAL结合珠试剂时,可以存在至少1中以上的酶抑制剂,以及至少1种以上的具有使内 毒素自身机能衰减的作用的铁离子或铝离子,进行制备,以使凝固蛋白原不水解为凝固素。 另外,可以单独添加铁离子或铝离子的至少一种以上。另外,在上述实施例中,将LAL结合珠试剂和LAL试剂混合,进一步与内毒素水溶 液混合,边搅拌混合液边测定浊度随时间的变化,但混合液的搅拌未必是必须的。通过不搅 拌混合液而静置,同时测定浊度随时间的变化,也可通过使用LAL结合珠试剂,期待迅速地 测定内毒素。另外,在上述实施例中,可以将LAL结合珠试剂与LAL试剂混合,进一步与内毒素 水溶液混合,边搅拌混合液边通过激光散射粒子测量法测定凝胶的生成(LAL结合珠10彼 此的聚集导致凝聚体的生成)。这样,通过LAL结合珠法和激光散射粒子测量法的协同效 果,可以期待更加迅速地进行内毒素的测定。实施例2其次,对于本发明的实施例2进行说明。在本实施例中,对于将LAL结合珠试剂单 独与含有内毒素的样本样品混合进行使用的例子进行说明。在将LAL结合珠试剂单独与含有内毒素的样本样品混合进行使用时,由于可以省 略LAL结合珠试剂和LAL试剂的混合的工序,因此可以更简便地进行内毒素的测定。另一 方面,在此时,由于对于LAL结合珠试剂,不能进一步添加LAL试剂,因此不能对LAL结合珠 试剂进行LAL中的蛋白质补给。因此,在此时,优选在LAL结合珠10上吸附、担载、结合凝固蛋白原和丝氨酸蛋白 酶两者。这样,即使不将LAL结合珠试剂进一步与LAL试剂混合,通过LAL结合珠试剂单体 与含有内毒素的样品混合,也可以使内毒素作用于在LAL结合珠试剂中含有的丝氨酸蛋白酶。这样,可以将LAL结合珠试剂中所含的凝固蛋白原水解为凝固素,结果,可以使LAL结 合珠试剂中的LAL结合珠10彼此聚集并提前凝聚。这样,在本实施例中,在制备LAL结合珠试剂时,在珠1的表面不是仅吸附、担载、 结合纯化的凝固蛋白原,而期望在珠1的表面吸附、担载、结合LAL中的各种蛋白质。接着,在本实施例中,考虑对于珠1,结合凝固蛋白原和以丝氨酸蛋白酶为代表的 LAL中的蛋白质的凝固蛋白原以外的各成分的情况。即使在这种情况下,在本实施例中,在 LAL结合珠试剂的制备过程中,在丝氨酸蛋白酶的活性被添加的酶抑制剂不可逆地抑制的 状态下,即使将LAL结合珠试剂和含有内毒素的样品混合,也不能期待LAL结合珠10的凝 聚ο因此,在本实施例中,优选采用不会使酶功能被不可逆地抑制或失活的酶抑制剂 的选择或制备法。例如,在LAL结合珠试剂的制备过程中,为了使内毒素的作用减弱,可以 添加过量的铁离子或铝离子,以不抑制酶功能地防止凝固蛋白原水解为凝固素。另外,例 如,在LAL结合珠试剂的制备过程中,也可以通过非不可逆的酶抑制剂(可逆性抑制剂),来 抑制丝氨酸蛋白酶的活性。此时,存在通过洗涤来解除酶的失活的可能。这样,可以抑制吸附、担载、结合在珠1上的LAL中蛋白质的酶功能被不可逆地抑 制或失活。结果,即使不在LAL结合珠试剂中进一步混合LAL试剂,通过与含有内毒素的样 品的混合,也可以进行高灵敏度的内毒素的测定。应予说明,在上述实施例中,制备的LAL结合珠试剂相当于本发明的内毒素测定 用试齐U盒。
权利要求
内毒素的测定方法,其是检测样品中的内毒素或测定样品中的内毒素的浓度的内毒素的测定方法,其特征在于,使鲎的血细胞提取物中所含的规定蛋白质结合或吸附在可分散于试剂中的微粒的表面,使结合或吸附上述蛋白质的上述微粒分散得到的试剂和样品混合,通过检测上述试剂和上述样品的混合液中的凝胶生成,进行内毒素的检测,或通过测定上述凝胶的生成程度,测定内毒素的浓度。
2.根据权利要求1所述的内毒素的测定方法,其特征在于,上述规定蛋白质是由鲎的 血细胞提取物纯化的凝固蛋白原。
3.根据权利要求1或2所述的内毒素的测定方法,其特征在于,将结合或吸附上述规定 蛋白质的上述微粒分散得到的试剂进一步与鲎的血细胞提取物混合,在与上述混合同时或在混合后,使上述试剂和上述样品混合。
4.内毒素测定用试剂盒,其特征在于,使在鲎的血细胞提取物中所含的规定蛋白质结 合或吸附在可分散于试剂中的微粒的表面而制备。
5.根据权利要求4所述的内毒素测定用试剂盒,其特征在于,上述规定蛋白质是由鲎 的血细胞提取物纯化的凝固蛋白原。
6.根据权利要求4所述的内毒素测定用试剂盒,其特征在于,上述规定蛋白含有丝氨酸蛋白酶和凝固蛋白原,在结合或吸附上述规定蛋白质的上述微粒分散得到的试剂中,进一步添加抑制上述丝 氨酸蛋白酶和凝固蛋白原反应的抑制剂。
7.根据权利要求4 6任一项所述的内毒素测定用试剂盒,其特征在于,将结合或吸附 上述规定蛋白质的上述微粒分散得到的试剂进一步与鲎的血细胞提取物混合而制备。
全文摘要
本发明提供一种不易受样品混浊或颜色的影响、能够迅速且简便地进行内毒素检测或浓度测定的技术。制作使LAL中所含的蛋白质吸附或结合在预先准备且分散于药液中的微粒上的试剂,使该试剂与含有内毒素的样品混合。由此,使内毒素作用于微粒上的蛋白质,使微粒彼此聚集,迅速地生成大的凝聚体。对该凝聚体的生成进行光学测定,由此进行内毒素的检测或浓度测定。
文档编号G01N33/579GK101903776SQ200880121670
公开日2010年12月1日 申请日期2008年12月18日 优先权日2007年12月19日
发明者薮崎克己 申请人:兴和株式会社