专利名称：新型肝癌标志物的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及肝癌的肿瘤标志物、肝癌的检查及诊断方法。另外，本发明涉及用于测 定血液中的来源于HDGF的多肽的肝癌诊断试剂盒。
背景技术：
肝癌衍生生长因子HDGF(h印atoma-derived growth factor)是从作为肝癌细胞 株的HuH-7的培养上清中离析得到的，已经完成了克隆(cloning)，明确了其基因序列(非 专利文献l)。另外，作为其局部存在部位，已知其存在于核成分中，对肝癌细胞、平滑肌细 胞、成纤维细胞(fibroblast)及血管内皮细胞具有生长促进效果(非专利文献2-4)。另 外，HDGF在神经细胞中也局部存在于核成分中，与HDGF的名称相反，其广泛分布于机体内。 另外，从其营养因子的作用考虑，认为其对神经疾病也有治疗 诊断的可能性。
非专利文献1 :Nakamura H. et al. ， JBC 269 :25143-25149(1994)
非专利文献2 :Nakamura H. et. al. ， Clin. Chim. Acta. 183 :273-284(1989)
非专利文献3 :Everett A. D. et al. ， J. Clin. Invest. 105 :567-575 (2000)
非专利文献4 :01iver J. A. et. al. ， J. Clin. Invest. 102 :1208-1210(1998)
发明内容
本发明的目的在于提供肝癌的简便的检查方法及诊断方法，以及诊断肝癌所需的 肝癌诊断试剂盒。 本发明制作针对HDGF的抗体，以此为基础构筑HDGF的测定方法。另外，利用该测 定方法查明了在血液中存在HDGF，特别是发现了在患有慢性肝病的肝癌患者中HDGF有意 义地显示出高数值。 本发明提供肝癌患者的诊断方法及诊断用试剂盒。 项1、一种血中肝癌标志物，所述标志物是与人HDGF识别抗体相结合的来源于人 HDGF的多肽，所述人HDGF含有序列号1所示的氨基酸。 项2、一种检查方法，是检查是否患有肝癌的方法，其特征在于包括以下步骤
从受试者采血的步骤； 以及从所述血液样品检测项1所述的肝癌标志物的步骤。 项3、如项2所述的检查方法，其中检测步骤是通过免疫测定法进行的。 项4、如项3所述的检查方法，其中所述免疫测定法为ELISA。 项5、如项3所述的检查方法，其中所述受试者为慢性肝病患者。 项6、一种肝癌诊断试剂盒，其中至少含有特异性识别项1所述的标志物的抗体作
为构成要素。
[图1]表示HDGF ELISA测定方法的步骤。
[图2]为表示HDGF的标准曲线的图。检测范围为0. 31 20ng/ml。[图3]为表示各肝病患者血液中的HDGF量(Plasma HDGF)的图。 需要说明的是，HCC表示肝癌患者、CHC表示C型肝炎患者、CHB表示B型肝炎患
者、LC表示肝硬化患者。
具体实施例方式
肝病包括肝癌、B型病毒性肝炎、C型病毒性肝炎、肝硬化等各种疾病，由于肝细 胞自身受到损伤，所以存在通过测定血液中肝细胞内容物能够判定是否为肝脏疾病的可能 性。例如G0T、GPT均为在肝细胞中活动的酶，如果因肝炎等导致肝细胞被破坏，则G0T、GPT 向血液中渗出，因此将血中的G0T、 GPT用作用于了解肝脏损伤程度的指标。上述G0T、 GPT 在急性肝炎、慢性肝炎等肝细胞被破坏的疾病中是有力的指标，但不是肝细胞的破坏不重 要的肝癌的指标。 由于预测HDGF存在于核成分，细胞被破坏后才向血液中释放，所以预测其为与 G0T、 GPT同样的标志物，但本发明人意外地发现其与G0T、 GPT不同，是肝癌的特异性标志 物。 肝癌标志物 在本说明书中，人HDGF是指具有序列号1所示的氨基酸序列的HDGF。
人HDGF识别抗体只要识别人HDGF即可，也包括识别HDGF分解生成的部分肽的抗 体。抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体，只要能与抗原结合，也可以为抗体片段。 作为抗体片段，可以举出scFv、 Fab、 F(ab)2、 Fv等。 在本说明书中，"来源于人HDGF的多肽"中不仅包括人HDGF自身，还广泛地包括 下述多肽人HDGF在机体内经甲基化、酰胺化、乙酰化等修饰得到的多肽；人HDGF经酶分 解或化学分解(特别是水解)而变短的多肽；可以被抗人HDGF抗体识别的(包含表位)多 肽。 本发明的肝癌标志物包括来源于人HDGF的多肽。来源于人HDGF的多肽在肝癌患
者的血液中显示出高数值。用于测定肝癌标志物的样品包括血液、血浆、血清。 本发明的肝癌标志物通过与现有已知的其他肝癌标志物如AFP(a _甲胎蛋白)组
合，可以期待用作精度更高的癌标志物，所述AFP(a -甲胎蛋白)是在胎儿期于肝及卵黄囊
(yolk sac)中产生的蛋白，在约80%肝细胞癌患者中确认了其升高。 检杳方法 以下详述本发明的肝癌检查方法。 本检查方法由采血和肝癌标志物的检测两个步骤构成。首先，测定试样为血液，可 以为血清状态、血浆状态中的任一种。另外，对采血没有特别限定，但优选空腹时进行。
作为肝癌标志物的检测方法及测定方法，没有特别限定，只要是可以测定存在于 血液中的来源于HDGF的多肽的方法即可。可以举出常用的生物化学方法、特别是利用免疫 学原理的方法作为优选例。例如可以举出ELISA、蛋白质印记(Western blotting)法及放 射免疫测定(Radioimmunoassay)法(RIA)等利用针对测定对象物的抗体的方法作为优选 例。进而，如果使用抗体，则可以为单克隆抗体及多克隆抗体中的任一种。或者，可以使用 适体(即tamer)之类来自核酸成分、并且对测定对象物具有亲和性的分子。进而，杂质混杂
4在样品中时，可以首先将目标分子进行纯化或者提高纯度至消除杂质影响的程度之后用于 测定。例如作为纯化方法，可以根据情况使用下述方法，所述方法为凝胶过滤、离子交换色 谱法、疏水色谱法、亲和色谱法(Affinity chromatography)、反相色谱法、正相色谱法、各 种电泳、硫酸铵沉淀、利用有机溶剂进行的沉淀法、等电点沉淀法等，当然只是作为一个例 子进行列举，作为纯化方法不限定于上述方法。 制作HDGF测定用ELISA试剂盒时，ELISA测定方法可以为直接法及夹层法 (sandwich method)中的任一种，可以根据常规方法进行测定。另外，上述情况下可以使用 单克隆抗体、多克隆抗体中的任一种。例如为夹层法时，通常将一次抗体(抗HDGF抗体) 预先固相化在96孔板上，通过加入来自机体的试样(血液、血清、或血浆)或者根据需要用 适当的缓冲液稀释得到的试样、与抗体接触一定时间，使之结合。之后，用适当的缓冲液清 洗后，使标记二次抗体(标记抗HDGF抗体)进行反应。例如，如果标记体为生物素，则使过 氧化物酶标记亲和素(或者链霉亲和素)反应，使适当的反应底物(例如TBM)作用，由此 使之显色。 一定时间后，通过在规定波长下测定，进行比色定量，如果在这种情况下，波长为 450nm。对于亲和素标记抗体，考虑使用过氧化物酶(HRP)标记和碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、 葡糖氧化酶及酪氨酸酶标记等。作为底物，只要是市售的通常使用的底物即可，没有特别限 定。 另外，作为免疫学测定方法，除此之外，还可以使用蛋白质印记法。本法可以在进 行以电泳例如SDS-PAGE、PAGE、等电点电泳或者滤纸电泳等为代表的电泳法之后，转录在例 如硝化纤维素膜、PVDF膜等可以转录的膜上，用针对测定对象分子的一次抗体处理后，使用 结合了色素粒子等标记抗体的二次抗体；或者酶标记时，通过在处理后进行底物处理，使之 可见化。作为标记抗体，可以举出生物素标记抗体，其上结合有亲和素或链霉亲和素，或者 将过氧化物酶(HRP)标记抗体、碱性磷酸酶标记抗体、酸性磷酸酶标记抗体、葡糖氧化酶标 记抗体及酪氨酸酶标记抗体等作为二次抗体。作为底物，只要是市售的通常使用的底物即 可，没有特别限定。 另外，关于测定中使用的抗体的取得，可以按常规方法取得。例如制作多克隆抗体
时，将兔、羊、豚鼠、鸡之类温血动物用通常混和上述目标抗原(人HDGF或其部分肽或部分
多肽)与弗式完全佐剂(Complete Freun dadjuvant)配制得到的乳化物进行多次免疫，可
以按常规方法取得获得的抗血清。另外，为鸡时，用上述免疫抗原进行多次免疫，在该鸡产
下的鸡蛋中产生IgY，然后可以按常规方法从该鸡蛋的蛋黄中取得IgY。 另外，也可以作为单克隆抗体取得抗体。该单克隆抗体可以如下取得，例如同时用
上述免疫抗原与弗式完全佐剂多次对小鼠进行免疫，使其产生抗体的同时，例如按细胞融
合法等常规方法，分离得到的产生抗体的细胞，培养该细胞，取得单克隆抗体。进而可以根
据需要将如上所述地得到的抗体按硫酸铵盐析法、离子交换色谱法、亲和色谱法等常规方
法进一步进行纯化。 成力i会断对象的疾病及受i式者 在慢性肝病患者中，特别是可以用于诊断是否发展为肝癌。对于患有病毒性肝炎 或者肝硬化的患者，作为其发展的最终阶段，可以举出癌变。考虑到患者的精神状态或者对 治疗的意愿，患有慢性肝病的患者知晓现在自身的病状属于哪个阶段是重要的。
诊断试剂盒
通过测定血液中的HDGF量，可以诊断慢性肝病患者的肝癌。即，可以提供包含 ELISA试剂盒及用于蛋白质印记法的各种试剂的试剂盒组合物。特别是在试剂盒中，含有针 对HDGF的抗体。在试剂盒中，除抗体之外，含有BSA等白蛋白、二次抗体、酶的底物(使用 酶作为标记时)等。例如，如果识别抗体为生物素标记抗体，则在该测定试剂盒中可以含有 过氧化物酶标记亲和素作为二次抗体。另外，可以提供包含针对该过氧化物酶的底物等的 肝癌诊断试剂盒。
实施例 以下用实施例具体地表示本发明的内容，但本发明内容不限定于以下实施例。
实施例1 HDGF的ELISA测定系统的构筑 单克降杭体用杭原及用作标准品的HDGF的制作 首先，人HDGF基因已经是公知的，记载在序列号2中。按常规方法进行克隆。艮P， 利用人肾脏cDNA文库将HDGF基因的起始密码子到终止密码子用PCR法进行扩增。在正向 引物的5'末端附加Ndel位点，在反向引物的3'末端附加XhoI位点。将PCR产物克隆到 pCR-Blunt载体中，确认DNA序列，得到HDGF cDNA。 然后，将该HDGF cDNA及Hi sTag接头插入pSecTag2载体中，制作表达载体 (pSecTag2HDGF)。进而，将得到的表达载体(pSecTag2-HDGF)导入CH0-K1细胞中，在添加 博来霉素(Zeocin)的培养基中进行有限稀释培养，由此制作抗性克隆。另外，确认了在培 养上清中存在HDGF。 之后，大量培养高产HDGF的克隆(CH0/HDGF克隆4)，收集培养上清，进行抗原用 HDGF的纯化。 艮卩，通过Ni Resin柱色谱法、H印arin-S印harose柱色谱法及Resource Q柱高效 液相色谱法进行纯化，得到免疫原及标准品。
小鼠单克降抗体的制作 按常规方法，对小鼠进行免疫，选择产生目标抗体的杂交瘤。即，将抗原溶液与等 量的弗式完全佐剂混合制作乳剂，进行免疫。每隔2周进行一次免疫，进行5次免疫。
然后，由免疫小鼠调制脾细胞，混合P3U1使其相对于预先制备得到的骨髓瘤细胞 P3U1为5 : l至2 : 1。离心分离后，边充分搅拌边向细胞沉淀物中加入PEG溶液，使之均 匀后静置，离心后，除去上清，使沉淀物混悬于100ml添加HAT的10% FCS/RPMI1640中，以 lml/孔散布在24孔培养用板(costar)中，在37°C、5% C02的条件下进行培养，由此使细 胞融合。 阳性杂交瘤的克隆如下进行。 从细胞融合后1周至10日之后，从各孔中取出培养上清，进行抗体筛选。在将HDGF
抗原固相化的96孔板(NUNC)上使培养上清反应，用ELISA检查是否有抗体。 关于腹水的制作，在给与细胞的3日或更长时间之前，预先对小鼠腹腔内按
0. 5ml/只的量给与姥鲛烷(pristane) (2， 6， 10， 14-四甲基十五烷)，将杂交瘤细胞混悬于
1.5ml PBS中，对3只小鼠每只腹腔内给与0.5ml。给与了细胞的小鼠的腹部达到最大时取腹水。 利用腹水进行的单克隆抗体的纯化和浓度检测通过应用Protein-A柱来进行纯
6化，用SDS-PAGE确认纯度。
m歸翻纖 将HDGF抗原溶液与弗式完全佐剂混合制备乳剂，在兔的背部皮下每点lmL进行多 点免疫。 免疫每隔2周进行一次，3次免疫的1周后从耳朵进行部分采血，用ELISA检查血 清的抗体价，进而进行4次免疫。最终免疫1周后从颈动脉进行全采血(肝素采血)，离心 分离后得到血浆。 需要说明的是，以C末端肽为抗原制作多克隆抗体是合成在C末端肽(从N末端 开始第231-240个氨基酸)的N末端附加有Cys的肽，进行纯化后，使之与KLH偶联，形成 抗原(KLH-C-APGIRDHESL)。
ELISA法的确立 HDGF ELISA是将单克隆抗体0PM11617用0. 1M NaC03稀释至5 y g/mL，固相化在 各孔中，用0. 1% BSA/PBS封闭。1st Buffer使用0. 1% BSA/PBS/0. 05% Tween-20，将其预 先加入96孔中。标准HDGF的稀释使用20mg/mL的BSA/PBS，从20ng/ml开始以2倍进行 7级稀释，将得到的各浓度标准品和空白(Blank)制成标准曲线。将50yL标准品及样品 加入孔中，在室温下使之反应一昼夜。清洗孔之后，加入100iiL用0. 1% BSA/PBS/0.05% Tween-20稀释至40， 000倍的C端抗体，在室温下使之反应2小时。再清洗板，将稀释10， 000 倍的HRP标记亲和素加入各孔中，在室温下使之反应2小时。清洗板后加入TMB溶液，在室 温下使之反应10分钟后，用2N硫酸停止反应。设定吸光度为450，进行测定。测定方法的 步骤示于图1。 另夕卜，HDGF的标准曲线示于图2。在0. 31ng/ml到20ng/mL的测定范围内能够测
定到细胞培养液中的HDGF。 慢性肝病患者血清中的HDGF的测定 在空腹时对肝癌患者(61人)、C型病毒性肝炎患者(61人)、B型病毒性肝炎患者 (9人)、肝硬化患者(55人)、急性肝炎患者(3人)进行采血，利用上述确立的ELISA系统 测定血浆中的HDGF值。结果可知肝癌血浆中HDGF有意义地变为高数值(图3、表1)。
[表1]
肝癌c型肝炎B型肝炎肝硬化急性肝炎
阴性25544401
阳性3675152
合计/24061619553
权利要求
一种血中肝癌标志物，所述标志物是与人HDGF识别抗体相结合的来源于人HDGF的多肽，所述人HDGF含有序列号1所示的氨基酸。
2. —种检查方法，是检查是否患有肝癌的方法，其特征在于包括以下步骤 从受试者采血的步骤；以及从所述血液样品检测权利要求1所述的肝癌标志物的步骤。
3. 如权利要求2所述的检查方法，其中检测步骤是通过免疫测定法进行的。
4. 如权利要求3所述的检查方法，其中所述免疫测定法为ELISA。
5. 如权利要求3所述的检查方法，其中所述受试者为慢性肝病患者。
6. —种肝癌诊断试剂盒，其中至少含有特异性识别权利要求1所述的标志物的抗体作 为构成要素。
全文摘要
本发明通过测定慢性肝病患者血液中的HDGF来诊断是否为肝癌。另外，本发明提供一种用于该诊断的测定试剂盒。
文档编号G01N33/574GK101796415SQ20088010296
公开日2010年8月4日 申请日期2008年8月7日 优先权日2007年8月10日
发明者中村秀次, 大本安一, 大神圭子, 岩田房子, 村口正宏, 村田香, 森丰树, 薮内洋一 申请人:学校法人兵库医科大学;大塚制药株式会社