专利名称：确定聚谷氨酸-紫杉烷结合物中结合的紫杉烷的量的方法
确定聚谷氨酸-紫杉烷结合物中结合的紫杉烷的量的方法
背景技术：
紫杉醇(以商品名Taxo^注射剂可获得)是化疗药紫杉烷的原型，其与P-微管蛋白结合，促进将该蛋白组装i^微管并且稳定它们，最终引起细胞死亡。聚谷氨酸紫杉醇(paclitaxel poliglumex)(PPX ，化学名被(2，R，3，S)-3，-苯甲酰基酰氨基-l，-[4，10j3-双(乙酰氧基)-2a-(苯甲酰基氧基)-l，7P-二羟基-9-氧代-5，20-环氧紫杉-ll-烯-13a-基氧基]-l，-氧代-3，-苯基丙-2，-醇部^y-酯化的N-(L-焦谷氨酰基)-[聚(L-谷氨酰基)-L-谷氨酸)，下文称为PPX,是a-聚-L-谷氨酸(PGA)和紫杉醇的酯结合物，其中后者与PGA通过2，-羟基位共价结合。
近来，研究PPX用于非小细胞肺癌(NSCLC)和卵巢癌。摄入后在肿瘤组织中紫杉醇释放并且将结合物蛋白水解/水解降解。
PPX的分子式和分子量是分布的，因为a-聚-L-谷氨酸的聚合度和与紫杉醇的结合位点数目根据制备方法而不同。PPX的平均分子量为约40,000道尔顿，其是通过非水凝胶渗透色谱法确定的，该色谱法通过多角激光散射进行检测。在结合物中，约35。/。重量的紫杉醇以结合形式存在，总计每11个单体单元约i个紫杉醇酯键。合成PPX的方法在PCT公布W097/33552中公开。
在对PPX进行的制备试验中，作为活性成分和最终的药物产物，结合的紫杉醇和相关的基于紫杉烷的杂质的定量分析是有规定的。但是后一个试验不能对PPX本身进行并且脱酯作用需要释放紫杉醇。TetrahedronLetters, (1995)， 36(12)， 2001-2004/>开了应用碱性过氧化1^/四氯吹喃混合物水裂解紫杉醇的多种酯的方法，其中过乙酰化的紫杉醇的2，-乙酸酯比10-乙酰基位水解得更快。当这个方法应用于紫杉醇时，报道的产物是10-脱乙酰基紫杉醇(10-DAT)。最初用于PPX中结合的紫杉醇和相关的紫杉烷杂质的定量的已知方法包括用碳酸氢钠/过氧化钠将PPX彻底水解，在CHC13中将紫杉醇和相关的紫杉烷杂质一起萃取并且通过HPLC定量。加 入CHC13作为第二相使水解后释放的紫杉烷立即萃取，防止了大部分 10-DAT形成。但是，水解反应引起紫杉醇的显著降解，通常降解为10-脱乙酰基-紫杉醇(10-DAT)并且20%水平的10-DAT通常应用该方法，作 为^目体系不完全抑制IO位的水解。因此，紫杉醇和10-DAT的峰在一起 定量并且报道为紫杉醇+10-DAT。为了能够将水解方法获得的紫杉醇 十10-DAT的量校正为仅总的紫杉醇，需要进行应用NMR定量的第二种方 法以将天然结合的10-DAT定量。因此，降解产物的形成和结合的紫杉烷 分布的改变是该方法的显著缺点。另外，对于降解的化合物，色语条件不 是特异的。
因此，需要用于将PGA-结合的紫杉醇和其它PGA-结合的紫杉烷定量 的改善的方法。 发明详述
因此，本发明涉及确定PGA-紫杉烷结合物中的结合的紫杉烷的量的 方法，该方法包括在非水介质中将结合物水解，应用肼f汴生物代替氢过氧 阴离子(hydroperoxy anion)。
更详细地说明，本发明的方法包括将PGA-紫杉烷结合物与式(I)化合 物反应
(I)
其中
!^和R2独立地选自d-Cnr烷基、C广d()-羟基烷基、C3-d。链烯基、 Qrd。-羟基链烯基、C3-do-炔基、C3-d(r羟基炔基、芳基、杂芳基；或者 W和I^与它们连接的氮原子一起形成3-8元杂环，该杂环任选包含至多3 个选自O、 S和N的杂原子并且任选净皮至多2个羟1^代；
得到未结合的紫杉烷和PGA-酰肼，
然后确定未结合的紫杉烷。
对于本发明的目的，PGA-紫杉烷结合物是a-聚-L-谷氨酸(PGA)，其中 谷氨酸重复单元的一个或多个Y-氯基通过紫杉烷的2，-羟基与紫杉烷分子发生酯化。典型的是，PGA包含60至310个单体单元并且分子量的范围 为8,000至40,000道尔顿。PGA-酰肼是由将紫杉烷的2，-羟基与PGA-紫杉 烷结合物中的PGA的谷氨酸重复单元的y-g连接的酯基与式(I)的肼反 应而产生的酰肼。在PGA-酰肼中，式(I)化合物的伯氨基的氮与PGA的谷 氨酸重复单元的Y-氯基的羰基结合。
本文所用的紫杉烷指的是紫杉醇、多西他赛或其它可以从天然来源例 如紫杉或者从细胞培养中分离出来的紫杉烷，或者化学合成的紫杉烷例如 10-脱乙酰基紫杉醇、7-表紫杉醇、三尖杉宁碱(cephalomannine)、 7-表-三 尖杉宁碱和N-脱苯甲酰基-N-苯基乙酰基紫杉醇。最优选的紫杉烷是紫杉 醇。
本文所用的术语"Crdo-烷基"指的是包含1至约10个碳原子的直 链或支链饱和的烃基，例如甲基、乙基、丙基(例如正丙基和异丙基)、丁 基(例如正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(例如正戊基、异戊基、 新戊基)等。
本文所用的术语"d-d。-羟基烷基"指的是d-do-烷基，其可以被至 多3个羟基取代。
本文所用的术语"C3-C。-链烯基"指的是包含3至约10个碳原子并 且具有一个或多个双碳-碳键的烷基。链烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、 丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基等。
本文所用的术语"C3-d(r羟基链烯基"指的是可以在碳原子上被至多 3个羟基取代的C3-do-链烯基，所述的碳原子不包括碳-碳双键的碳原子。
本文所用的"C3-d()-炔基"指的是包含3至约10个碳原子并且具有 一个或多个三碳-碳键的烷基。炔基的实例包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、 戊炔基等。
本文所用的术语"C3-do-羟基炔基"指的是可以在碳原子上被至多3
个羟基取代的C3-do-炔基，所述的碳原子不包括碳-碳三键的碳原子。
本文所用的术语"d-C3-烷基"指的是包含1至3个碳原子的直链或
支链饱和的烃基。
本文所用的术语"d-C3-卣烷基"指的是被至多3个卣原子(即F、 Cl、
6Br、 I)取代的d-C3-烷基。
本文所用的术语"d-C3-烷氧基"指的是0-d-C3-烷基，例如甲g、 乙氡基、正丙氧基和异丙氧基。
本文所用的术语"d-C3-硫代烷氧基"指的是S-d-C3-烷基，即甲基 硫代、乙基J危代、正丙基J克代和异丙基J危代。
本文所用的"芳基"指的是芳族碳环基，包括单环或多环芳族烃，例 如苯基、萘基、蒽基、菲基、1,2-二氩化茚基、茚基等，其可以任选被以下 基团取代卤素、C广C3画烷基、C广CV卤烷基、C广Qr烷氧基、d画CV硫代 烷氧基或硝基。
本文所用的"杂芳基"是芳族杂碳环基并且包括单环和多环芳族烃， 所述的芳族烃包含至少一个杂原子环成员例如石危、氧或氮，并且其可以任: 选被以下基团取代卤素、Q-C3烷基、C广C3-卤烷基、C广CV烷氧基、C!-C3-硫代烷氧基或硝基。杂芳基包括吡咬基、嘧咬基、吡噪基、喊,基、三嗪 基、呋喃基、会啉基、异会啉基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、吡 咯基、噁喳基、苯并呋喃基、苯并蓉吩基、苯并瘗唑基、异喁喳基、吡唑 基、三哇基、四唑基、吲哇基、1，2，4-蓉二哇基、异噻峻基、苯并塞哈基、 嘌呤基、^"唑基、苯并咪哇基等。
可以有利地用于进行本发明的式(I)化合物的实例包括N，N-二甲基肼、 苯基肼、4-溴苯基肼、4-异丙基苯基肼、4-甲氧基苯基肼、l-曱基-l-苯基肼、 1-氨基吡咯烷、l-氨基-2，6-二甲基哌啶、l-氨基-顺式-2，6-二甲基哌啶、 (S)-(-)-l-氨基-2-(甲氧基甲基)吡咯烷、(R)-(+)-l-氨基-2-(甲氧基甲基)吡咯 烷、4-氨基吗啉、l-絲哌咬、l-絲-4-曱基p底溱、l-脉-4-(2-羟基乙基) 哌溱、l-l^-高哌咬。优选的试剂是N,N-二甲基肼、苯基肼、4-氨基吗啉 和1-M哌咬，最优选的是4-氨基吗啉。
PGA-紫杉烷结合物与(I)的反应在质子惰性有机溶剂例如二甲基甲酰 胺、二曱亚砜、N-甲基吡咯烷酮等中进行。根据本发明优选的实施方案， 将PPX或包含PPX的药物的样品溶于或悬浮于二甲基甲酰胺或二甲亚砜 中以提供PPX的浓度为25至52 mg/mL之间，然后加入4-氨基吗啉或4-氨基吗啉的三氟乙酸溶液。PPX溶液和4-氨基吗啉/三氟乙酸的比例是1:0.3v/v至1:0.5 v/v之间。将混合物在室温约20C至约42"C之间下搅拌约2小 时至约24小时的时间。
未结合的紫杉烷的确定可以通过HPLC进行或者通过任何其它本领域 已知的用于定量分析紫杉烷的方法进行。
根据本发明优选的实施方案，将PPX或包含PPX的药物的样品溶于 二甲亚砜中以提供PPX的浓度为48至52 ng/mL之间并且加入4-氨基吗 啉的三氟乙酸溶液，其中三氟乙酸与4-氨基吗啉的比例为0.017:1 v/v。 PPX 溶液与4-氨基吗啉/三氟乙酸的比例为1:0.5 v/v。将混合物搅拌并且监控温 度和反应时间直至约2%-7%结合的紫杉烷释放。优选的是，温度保持在范 围为约38-42X:并JL^应时间的范围为约1.9至约2.1小时。在这些范围内， 纯度分布作为转化的函数不改变。加入乙腈后，将溶液通过离心超滤以除 去未反应的聚合物，然后直接进样至HPLC柱以确定紫杉醇和每种紫杉烷 杂质的面积百分数。将USP中报道或计算的UV响应因子应用于将已知杂 质的％面积转化为相对于紫杉醇的w/w%;其它未知杂质的量代替计算为 %面积。紫杉醇的纯度是通it^ 100%减去所有杂质的总和计算的。
本发明方法温和的反应条件使紫杉醇降解从约20%降低至小于0.5% 并且使10-DAT的定量高于0.2。/。，因此，无需NMR定量。
现在，本发明通过以下实施例更详细地说明。
实施例
为了说明本发明方法的准确度和灵敏度，在紫杉醇中添加已知量 (10。/。w/w)的三种化学上不同的紫杉烷，然后与37%w/w量的a-聚-(L)-谷氨 酸结合。三种紫杉烷中的两种是合成的杂质(三尖杉宁碱和7-表-三尖杉宁 碱)，第三种是降解杂质(7-表紫杉醇)。在定量限和上特异限(upper specification limit)之间，对于每种紫杉烷，研究三种不同添加水平(1.2%、 9.8%、 28%w/w)。所有三种杂质回收量为100%至115%之间，其被认为 对于本发明的目的用途是可接受的。该试验的代表性实例在实施例1中给 出。PPX批次的常规释放分析在实施例2中报告。
实施例1
紫杉醇/7-表紫杉醇结合物的溶液是通过在10 mL烧瓶中精确称量350± 5 mg结合物并且将其溶于二甲亚砜中制备的。用相同溶剂将溶液稀释至 一定体积。在5mL烧瓶中精确称量250士2.5mgPPX(药用级)。在相同烧 瓶中加入0.085 mL添加溶液(相应于添加水平为1.2Vow/w)并且用二甲亚砜 稀释至一定体积。然后根据实施例2中给出的通用方法进行氨解反应并且 通过HPLC分析。7-表紫杉醇的回收率为110.7%。 实施例2
将精确称量的250 mg PPX(活性药物成分)转移至5 mL烧瓶中。用二 甲亚砜溶解后，用相同溶剂将样品稀释至一定体积。将1.0mL该溶液转移 至5 mL圃锥形底小瓶中。将三角形磁力搅拌棒置于每个小瓶中并JU^入 0.5 mL包含比例为0.017:1(0.034 mL TFA加入至2.0 mL 4-氨基吗啉中)的 三氟乙酸和4-氨基吗啉的溶液。将小瓶紧密加盖，置于40C:h2X:的恒温搅 拌水浴上并且搅拌2士0.1小时。反应结束时，历经约10分钟，将小M慢 冷却至室温，然后加入0.75 mL乙腈。混合后，将样品转移至离心过滤器(分 子量截断(cut-off)二10，000道尔顿)并且在3000xg下离心1小时。将1 mL 样品转移至HPLC小瓶中，加入10 |LiL冰醋酸并且通过HPLC分^f斤，确定 紫杉烷含量，该分析应用Zorbax 300SB-C8柱，4.6x100 mm 3.5 pm, Agilent Cat. No. 861973-卯6，保持在40"C下并且用7JC/乙腈梯度混合物从20%乙腈 /80%7片至卯％乙腈/10%7&在60分钟内洗脱，在227 nm处进行UV检测。
结果(六次重复的平均值，并且表示为用相关响应因子校正的面积％)
在表l中报告。 表l,
紫杉烷 用RRF校正的面积％
浆果赤霉素III: 低于纟艮告水平
10-DAT: 0.24%
三尖杉宁碱 0.22%
OR1: 低于报告水平
OR2+OR3: 0.39%
7-表-10-脱乙酰基紫杉醇 低于报告水平
紫杉醇 98.80%7-表-紫杉醇 0.16% 未知(RRT 1.13): 低于报告水平 未知(RRT 1.28): 低于报告水平 以OR" OR2和OR3表示的杂质是a-聚-(L)-谷氨酸与具有下式的紫杉 烷的结合物
o
ORl: Rl = OAc, R2 = OH, R3 = OBz OR2: Rl = OH, R2 = OAc, R3 = OBz OR3: Rl = OBz, R2 = OAc, R3 = OH
式
权利要求
1.确定聚谷氨酸-紫杉烷结合物中结合的紫杉烷的量的方法，其中一种或多种紫杉烷分子通过2’-羟基位与α-聚-L-谷氨酸的γ-羧基连接，所述的方法包括以下步骤a)将聚谷氨酸-紫杉烷结合物与式(I)化合物反应R1R2N-NH2(I)其中R1和R2独立地是C1-C10-烷基、C1-C10-羟基烷基、C3-C10链烯基、C3-C10-羟基烷基、C3-C10-炔基、C3-C10-羟基炔基、芳基、杂芳基；或者R1和R2与它们连接的氮原子一起形成3-8元杂环，该杂环任选包含至多3个选自O、S和N的杂原子并且任选被至多2个羟基取代；得到未结合的紫杉烷和聚谷氨酸酰肼；以及b)确定未结合的紫杉烷的量。
2. 权利要求1的方法，其中未结合的紫杉烷的量是通过HPLC确定的。
3. 权利要求1或2的方法，其中紫杉烷选自紫杉醇、多西他赛、10-脱乙酖基紫杉醇、7-表紫杉醇、三尖杉宁碱、7-表-三尖杉宁碱和N-脱苯甲 酰基-N-苯基乙酰基紫杉醇。
4. 权利要求1至3中任意一项的方法，其中紫杉烷是紫杉醇。
5. 权利要求1至4中任意一项的方法，其中式(I)化合物选自N，N-二曱 基肼、苯基肼、4-溴苯基肼、4-异丙基苯基肼、4-曱緣苯基肼、l-曱基-l-苯基肼、1-氨基吡咯烷、l-氨基-2，6-二曱基哌啶、l-氨基-顺式-2，6-二甲基 哌咬、(S)+)-l-絲-2-(甲氧基曱基)吡咯烷、(R)-(+)-l-絲-2-(甲氧基甲基) 吡咯烷、4-氨基吗啉、l-M哌啶、l-氨基-4-甲基哌噪、l-KJ^4-(2-羟基 乙基)哌溱和l-M-高哌啶。
6. 权利要求1至5中任意一项的方法，其中式(I)化合物选自N,N-二曱 基肼、苯基肼、4-氨基吗啉和l-氨基哌啶。
7. 权利要求1至6中任意一项的方法，其中式(I)化合物是4-氨基吗啉。
8. 权利要求7的方法，其中步骤a)在二甲基曱酰胺或二甲亚砜中在温 度范围为20至42'C下进行。
9. 权利要求8的方法，其中步骤a)在二曱亚砜中在温度为38至42'C 下进行。
全文摘要
本发明涉及确定PGA-紫杉烷结合物中结合的紫杉烷、特别是紫杉醇的量的方法，所述的方法包括a)将PGA-紫杉烷结合物与式(I)化合物反应R<sup>1</sup>R<sup>2</sup>N-NH<sub>2</sub>(I)，其中R<sup>1</sup>和R<sup>2</sup>如说明书中定义；得到未结合的紫杉烷和PGA酰肼，以及b)确定未结合的紫杉烷的量。
文档编号G01N33/50GK101641598SQ200880007196
公开日2010年2月3日 申请日期2008年3月5日 优先权日2007年3月6日
发明者H·斯普尼莫尔, K·霍夫达, L·西维耶罗, M·麦克肯农, S·法齐奥尼, V·利维 申请人:细胞治疗学公司