专利名称：创伤弧菌主要外膜蛋白的dot-ELISA检测方法
技术领域：
本发明涉及海洋环境中创伤弧菌主要外膜蛋白的快速检测方法。
背景技术：
创伤弧菌(W^7'ow/my cw)是近海、河口和海湾的海水及沉积物中分布 极广的海洋细菌，同时在海洋贝类和鱼类等生物的体表和体内可大量寄生。创 伤弧菌可通过肠道和外伤感染导致人类食物中毒和败血症等严重疾病，牡蛎等 贝类是创伤弧菌感染的主要媒介，多由于生食受到污染的贝类引起，近年来在 我国沿海地区发现由创伤弧菌引起的急性腹泻和败血症的病例逐渐增多，同时 创伤弧菌也是危害我国海水贝类和鱼类养殖的主要病原，给相关产业造成了严 重的经济损失。但目前对海洋环境中创伤弧菌的定性、定量检测研究主要是利 用PCR方法和酶联免疫吸附(ELISA)方法进行检测。但在实际应用中，PCR 技术易出现假阳性结果而利用ELISA法检测灵敏度一般为105CFU/mL，灵 敏性不够3'4。因此建立一种灵敏度高而特异性好的方法可提高实际应用中对环 境里创伤弧菌的检测可信度，对于丰富微生物检测方法和完善相关食品卫生和 海水水质检测标准具有重要意义。
目前对实际环境中创伤弧菌的检测研究较少，究其原因，可能存在以下几个 方面的问题
1. 目前海水水质检测指标中微生物主要检测大肠杆菌菌群，而忽视了创伤弧 菌等其他重要的病原菌，因而一直以来未得到足够的重视。
2. 在实际应用中对于创伤弧菌等病原菌的主要外膜蛋白的定量检测研究较 少，特别是应用灵敏度更高的点酶联免疫吸附(dot-ELISA)法进行检测的报道 很少。
3.目前对创伤弧菌的检测研究多为实验室条件下进行的，而对实际应用中 方法的灵敏性、可行性等因素考虑不足。
参考文献
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发明内容
本发明旨在建立一种能够快速检测创伤弧菌主要外膜蛋白的方法，通过制 备高效价特异性抗血清和优化点-酶联免疫吸附(dot-ELISA)方法实现对目标 蛋白的检测其具体方法和步骤为
1. 兔抗创伤弧菌抗血清制备用蒸馏水稀释体积比为0.5%的福尔马林4°。 灭活纯培养的创伤弧菌菌体，离心洗涤后调整浓度1()SCFU/mL,耳缘静脉注射雄 性新西兰大白兔，每周一次，6周后心脏取血，室温静置lh， 4。C静置过夜，4°C 3000 rpm离心15 min，小心分离上清液。为了获得高效价的抗血清，本发明中 初次免疫剂量较大，为lxl09CFU/mL，较其他报道的免疫原量高出1个数量级， 且本发明中免疫时间长达8周。高剂量抗原，长程免疫，是本发明较其他免疫 过程的不同之处，保证了高效价抗血清的获得。经检测创伤弧菌免疫新西兰大 白兔所得的抗血清效价高达1 : 2048000。与其他菌(副溶血弧菌、溶藻弧菌、 河流弧菌)的交叉反应较低，最高仅为L : 640。经4"C过夜吸附，离心去除交 叉反应菌体后，抗血清效价略有降低，但与其他菌均无交叉反应，因此具有高 度专一性。
2. 创伤弧菌外膜蛋白的制备收集TSA (胰胨大豆琼脂，下同)培养基平板 新鲜培养48h的创伤弧菌菌体，PBS缓冲液洗涤3次，将菌体重悬于2mLPBS 缓冲液中，并在PBS缓冲液中加入终浓度为10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA) 和2mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)， 45。C水浴30min，然后，置于冰浴中，采 用超声波破碎(功率200 W，超5s，停5s)。 14000 rpm4。C离心15min收集上清， 分装后-2(TC保存备用。总蛋白含量用Bradford法测定。超声缓冲液50mMPBS 或者是Tris-HCl buffer, pH 8.0左右。
3. 反应中所用缓冲液PBS缓冲液(pH7.4): NaC18g， KCl 0.2g， KH2P04 0.24g， Na2HP04—12 H20 2.9g，蒸馏水定容至1000 ml;
包被液Na2CO30.15g， NaHC03 0.293g，蒸馏水定容至100 ml; 洗涤液(PBST): lOOOmlPBS缓冲液加吐温-20 (Tween—20) 0.5 ml; 稀释液PBST加1%牛血清白蛋白(BSA); 封闭液PBS加2X牛血清白蛋白(BSA);
底物溶液DAB(二氨基联苯胺，下同)底物溶液(9 mL 0.01M Tris.Cl (pH 7.6), 6 mg DAB, 10 30% H202);
终止液2M浓度的H2S04 ;
二抗购买辣根过氧化物酶(HRP)标标记的羊抗兔抗血清。
兔抗创伤弧菌抗血清稀释度为1 : 128000; 二抗稀释度为1 : 10000。
具体检测方法为
(1) 将PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜，下同)用铅笔打出0.5 cmxO.5 cm的小方 格，根据样品数及左右两侧的空白方格数用剪刀剪下所需的方格数。
(2) 用小镊子除去PVDF膜两侧的保护层后，将膜放入100%甲醇中浸泡608。 将膜从甲醇中取出后，放到滤纸上，待膜干燥后点样。
(3) 向每个小方格中点样制备的创伤弧菌外膜蛋白1.0 pL。
(4) 待样品干燥后，将膜放入合适的容器中，加入25 50mL封闭液，于37°C 摇床中，轻微摇动，封闭60min或4'C冰箱中封闭过夜。
(5) 封闭完成后，将处理的PVDF膜用洗涤液摇动洗涤3次，每次3min。
(6) 将制备的兔抗创伤弧菌抗血清用稀释液稀释128000倍，将处理的PVDF 膜置于25 50mL的抗血清稀释液中，于37'C摇床中，轻微摇动，反应45 min。
(7) 与兔抗创伤弧菌抗血清反应完成后，将反应之后的膜用洗涤液摇动洗涤 3次，每次3 min。
(8) 将购买的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗血清用稀释液稀释 10000倍，将洗涤后的PVDF膜置于羊抗兔抗体稀释液中，于37'C台式摇床中， 轻微摇动，反应45min。
(9) 与羊抗兔抗体稀释液反应完成后，将此PVDF膜用洗涤液摇动洗涤3次， 每次3 min。
(10) 将反应后的PVDF膜放入DAB显色液中显色2 3min。显色时间不能过长，以免背景颜色过深。
(11)蒸馏水终止显色反应。反应后当PVDF膜上出现肉眼可见的棕色圆形沉
淀时，即可判断反应结果为阳性。
本检测方法，主要是做定性检测，虽然在加入已知量的阳性对照样品后也 可以做一般定量检测，但在需要精确定量检测时，不建议采用此法。
本发明适用于实验室培养样品或野外样品处理后的创伤弧菌的快速检测，
具有以下优点
1. 具有极高的灵敏度和专一性。经过初步纯化抗血清后，应用dot-ELISA 法检测创伤弧菌主要外膜蛋白的灵敏度为15 ng/mL。
2. 所需试剂配制方便。所有试剂均为常用盐类，没有毒性，各种溶液常温 保存即可。
3. 检测过程操作简单。不需要使用复杂的仪器，反应结果肉眼即可进行判断。
附图1为dot-ELISA法检测创伤弧菌主要外膜蛋白扫描显色图。 检测多个创伤弧菌外膜蛋白样品，形成棕色沉淀的为阳性结果。
附图2为dot-ELISA法对创伤弧菌主要外膜蛋白的实测扫描显色图 检测不同含量的创伤弧菌外膜蛋白样品，灵敏度达15ng/mL具体实施方式
实施例1
1. 创伤弧菌抗血清制备用0.5%的福尔马林4°<:灭活纯培养的创伤弧菌菌
体，离心洗涤后调整浓度l()SCFU/mL,耳缘静脉注射雄性新西兰大白兔，每周一 次，6周后心脏取血，室温静置lh， 4。C静置过夜，4°C 3000rpm离心15min， 小心分离上清液。经检测创伤弧菌免疫新西兰大白兔所得的抗血清效价高达1 :2048000。
2. 创伤弧菌外膜蛋白的制备:收集TSA平板新鲜培养48 h的创伤弧菌菌体， PBS缓冲液洗涤3次，将菌体重悬于2 mL PBS缓冲液中(含10 mmol/EDTA和 2mmol/LPMSF)， 45'C水浴30min，然后置于冰浴中，采用超声波破碎(功率200 W，超5s，停5s)。 14000 rpm4。C离心15 min收集上清，分装后-20。C保存备用。 总蛋白含量用Bradford法测定。超声缓冲液50mMPBS或者是Tris-HCl buffer,pH8.0左右。
3.反应中所用缓冲液 PBS缓冲液(pH7.4): NaCl 8g， KCl 0.2g， KH2P04 0'24g， Na2HP04-12 H20 2.9g， 蒸馏水定容至1000 ml;
包被液Na2CO30.15g， NaHC03 0.293g，蒸馏水定容至100 ml; 洗涤液(PBST): 1000 ml PBS缓冲液加Tween-20 0.5 ml; 稀释液PBST加1%牛血清白蛋白(BSA); 封闭液PBS加2XBSA (牛血清白蛋白，下同)；
底物溶液DAB底物溶液(9 mL 0.01M Tris.Cl (pH 7.6), 6 mg DAB, 10 30%H2O2);
终止液2M浓度的H2S04 ; 二抗HRP标记羊抗兔抗体。
创伤弧菌抗血清稀释度为l : 128000; 二抗稀释度为l : ioooo
具体检测方法为
(1) 将PVDF膜用铅笔打出0.5 cmx0.5 cm的小方格，根据样品数及左右两 侧的空白方格数用剪刀剪下所需的方格数。
(2) 用小镊子除去PVDF膜两侧的保护层后，将膜放入100%甲醇中浸泡60s。 将膜从甲醇中取出后，放到滤纸上，待膜干燥后点样。
(3) 向每个小方格的中心位置点样l.OpL。
(4) 待样品干燥后，将膜放入合适的容器中，加入50ml封闭液，于37'C摇床 中，轻微摇动，封闭60min或4。C冰箱中封闭过夜。
(5) 封闭完成后，将处理的PVDF膜用洗涤液摇动洗涤3次，每次3min。
(6) 将制备的兔抗创伤弧菌抗血清用稀释液稀释128000倍，将处理的PVDF 膜置于50mL的抗血清稀释液中，于37。C摇床中，轻微摇动，反应45min。
(7) 与兔抗创伤弧菌抗血清反应完成后，将反应之后的膜用洗涤液摇动洗涤 3次,每次3 min。
(8) 将HRP标记的羊抗兔抗血清用稀释液稀释5000倍，将洗涤后的PVDF 膜置于羊抗兔抗体稀释液中，于37"C台式摇床中，轻微摇动，反应45min。
(9) 与羊抗兔抗体稀释液反应完成后，将此PVDF膜用洗涤液摇动洗涤3次， 每次3 min。
(抑将反应后的PVDF膜放入DAB显色液中显色3 min。(11)蒸馏水终止显色反应。阳性结果为肉眼可见的棕色圆形沉淀。
实施例2
将培养24 h的创伤弧菌菌液25-50 mL用PBS缓冲液洗涤3次，将菌体重 悬于2 mL PBS缓冲液中，加入终浓度为10 mmol/EDTA (乙二胺四乙酸)和2 mmol/LPMSF (苯甲基磺酰氟)，45"水浴30min，然后，置于冰浴中，采用超 声波破碎(功率200W，超5s，停5s)。 14000 rpm4。C离心15 min收集上清，分 装后-20。C保存备用。总蛋白含量用Bradford法测定，并将此上清液10倍系列 稀释后作为阳性对照样品。然后按照以下步骤进行定量检测
(1) 将PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜，下同)用铅笔打出0.5 cmx0.5 cm的小方
格，根据样品数剪下所需的方格数。
(2) 除去PVDF膜两侧的保护层后，将膜放入100M甲醇中浸泡60s。将膜从 甲醇中取出后，放到滤纸上，待膜干燥后点样。
(3) 向每个小方格的中心位置点样1.0 待检样品。
(4) 待样品干燥后，将膜放入合适的容器中，加入25 50ml封闭液，于37°C 摇床中，轻微摇动，封闭60min或4"C冰箱中封闭过夜。
(5) 封闭完成后，将处理的PVDF膜用洗涤液摇动洗涤3次，每次3min。
(6) 将制备的兔抗创伤弧菌抗血清用稀释液稀释128000倍，将处理的PVDF 膜置于25 50mL的抗血清稀释液中，于37。C摇床中，轻微摇动，反应45 min。
(7) 与兔抗创伤弧菌抗血清反应完成后，将反应之后的膜用洗涤液摇动洗涤 3次，每次3 min。
(8) 将HRP标记的羊抗兔抗血清用稀释液稀释10000倍，将洗涤后的PVDF 膜置于羊抗兔抗体稀释液中，于37'C摇床中，轻摇反应45min。
(9) 与羊抗兔抗体稀释液反应完成后，将此PVDF膜用洗涤液摇动洗涤3次， 每次3 min。
卿将反应后的PVDF膜放入DAB显色液中显色2 3 min。 (11)蒸馏水终止显色反应。检测结果，检测灵敏度可达15ng/mL (如附图2 所示)。同时利用间接ELISA (酶联免疫吸附)法检测创伤弧菌主要外膜蛋白， 灵敏度为78ng/mL。由此可见，利用dot-ELISA (点酶联免疫吸附)法检测创伤 弧菌主要外膜蛋白灵敏度明显提高，因此本方法特别适合检测含量较低的蛋白 样品。
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权利要求
1. 创伤弧菌主要外膜蛋白的dot-ELISA检测方法，其特征在于具体检测方法为(1)将PVDF膜用铅笔打出0.5cm×0.5cm的小方格，根据样品数及左右两侧的空白方格数用剪刀剪下所需的方格数；(2)除去PVDF膜两侧的保护层后，将膜放入甲醇中浸泡60s，取出放到滤纸上，待膜干燥后点样；(3)向每个小方格的中心位置点样1.0μL；(4)待样品干燥后，将膜放入容器中，加入25～50ml封闭液，于37℃摇床中，轻微摇动，封闭60min；(5)将处理的PVDF膜用洗涤液摇动洗涤3次，每次3min；(6)将制备的兔抗创伤弧菌抗血清用稀释液稀释128000倍，将处理的PVDF膜置于25～50mL的抗血清稀释液中，于37℃摇床中，轻微摇动，反应45min；(7)与兔抗创伤弧菌抗血清反应完成后，将反应之后的膜用洗涤液摇动洗涤3次，每次3min；(8)将HRP标记的羊抗兔抗血清用稀释液稀释5000倍，将洗涤后的PVDF膜置于羊抗兔抗体稀释液中，于37℃台式摇床中，轻微摇动，反应45min；(9)与羊抗兔抗体稀释液反应完成后，将此PVDF膜用洗涤液摇动洗涤3次，每次3min；(10)将反应后的PVDF膜放入DAB显色液中显色2～3min；(11)蒸馏水终止显色反应。阳性结果为肉眼可见的棕色圆形沉淀；其中所述兔抗创伤弧菌抗血清为用0.5％的福尔马林4℃灭活纯培养的创伤弧菌菌体，离心洗涤后调整浓度108CFU/mL，耳缘静脉注射雄性新西兰大白兔，每周一次，6周后心脏取血，室温静置1h，4℃静置过夜，4℃3000rpm离心15min，小心分离上清液而得，经检测创伤弧菌免疫新西兰大白兔所得的抗血清效价高达1∶2048000；所述创伤弧菌外膜蛋白是用以下方法制备收集TSA平板新鲜培养48h的创伤弧菌菌体，PBS缓冲液洗涤3次，将菌体重悬于2mL含10mmol/EDTA和2mmol/L PMSF的PBS缓冲液中，45℃水浴30min，然后置于冰浴中，采用超声波破碎，14000rpm4℃离心15min收集上清，分装后-20℃保存备用；总蛋白含量用Bradford法测定；超声缓冲液50mM PBS或者是Tris-HCl buffer，pH8.0左右；所述反应中所用缓冲液及其它液体为PBS缓冲液NaCl 8g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.24g，Na2HPO4-12H2O 2.9g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.4；包被液Na2CO3 0.15g，NaHCO30.293g，蒸馏水定容至100ml；PBST洗涤液1000ml PBS缓冲液加Tween-200.5ml；稀释液PBST洗涤液加1％牛血清白蛋白；封闭液PBS加2％BSA；底物溶液DAB底物溶液由9mL pH7.60.01M Tris.Cl，6mg DAB，和10μL30％H2O2组成；终止液2M浓度的H2SO4；二抗羊抗兔IgG—HRP酶标抗体；创伤弧菌抗血清稀释度为1∶128000；二抗稀释度为1∶10000。
2. 根据权利要求1所述创伤弧菌主要外膜蛋白的dot-ELISA检测方法，其 特征在于步骤(4)中，待样品干燥后，将膜放入容器中，加入25 50ml封闭液， 于37X:摇床屮，轻微摇动，4'C冰箱中封闭过夜。
3. 根据权利要求1所述创伤弧菌主要外膜蛋白的dot-ELISA检测方法，其 特征在于所述创伤弧菌外膜蛋白的制备中所述的采用超声波破碎为功率200W， 超5 s，停5 s而成。
全文摘要
创伤弧菌主要外膜蛋白的dot-ELISA检测方法。将培养的创伤弧菌经超声波破碎(功率200W，超5s，停5s)，离心收集上清。在聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上点样1.0μL，将点样PVDF膜用2％BSA(牛血清白蛋白)37℃封闭之后，分别与兔抗创伤弧菌抗血清和HRP(辣根过氧化物没)标记的羊抗兔抗血清反应，最后与底物溶液反应，在PVDF膜上形成肉眼可见的棕黄色圆形沉淀的即为阳性结果。本方法对创伤弧菌主要外膜蛋白的检测灵敏度可达15ng/mL，比酶联免疫吸附(ELISA)法高3-5倍，2-3个小时得出结果，可保证灵敏快速的检出海洋环境中的创伤弧菌。
文档编号G01N33/543GK101451996SQ20081024693
公开日2009年6月10日 申请日期2008年12月26日 优先权日2008年12月26日
发明者张振冬, 琳 朱, 王淑芬, 王秀娟, 邹亚男 申请人:张振冬