专利名称：联用磁分离与色谱分析测定混合物中配体亲和力的方法
技术领域：
本发明涉及利用恰当的参考配体与样品混合物制备成测定前样品，在液相启动测定前样 品中各配体竞争结合蛋白上相同活性位点，然后用功能化的磁性纳米材料以磁力回收蛋白-配 体复合物，变性复合物中的蛋白并提取所有结合的配体，用完全相同的色谱条件同步定性鉴 定和定量测定磁分离后提取的混合物中结合配体和测定前样品中各种配体的色谱峰面积或峰 高，在优化条件下利用近似公式推算候选配体相对于参考配体的相对亲和力的方法；此方法 可用于快速鉴定混合物中针对蛋白上特定位点的高亲和力配体，可用于药物筛选、高选择性 探针筛选、抗原表位筛选等生物医药的基础与应用领域。
发明的
背景技术：
高亲和力且高特异性配体广泛用作临床药物和工具，故测定配体同蛋白的亲和力是生物 医药领域的基本工作之一。目前测定配体与蛋白亲和力最常用方法依赖于候选配体与参考配 体竞争结合，但需分离出结合的参考配体并定量。为了便于定量测定结合的参考配体量，常 用特殊的信号标记参考配体，典型的为放射性同位素标记。显然，同位素标记危害大，操作 不方便。更重要的是，目前常用方法测定配体亲和力都需高纯度候选配体样品和高纯度参考 配体，这无疑增加了发现所需高亲和力配体的成本而效率却极低。另一方面，筛选组合化学 库已成为发现高亲和力配体的关键技术，常规的高通量筛选技术都需要纯样品，这对于应用 组合化学技术是最大成本限制；而从天然产物中制备纯样品不仅成本高而效率低，更容易丢 失高亲和力微量配体。因此，需以混合物为样品且尽可能不用同位素标记的分析技术，从而 快速简便测定混合物中特定配体或多个预期配体的亲和力，降低制备样品的成本且提高样品 制备的效率，使组合化学技术能成为高亲和力配体发现的常规技术。
目前，主要有三类技术可用混合物为样品定量测定其所含配体的亲和力，它们分别是 Schriemer等建立的前线亲和色谱04"gew. /W. 1998, 37， 3383-3387)、 Von Breeman
等建立的超滤-液相色谱-MS技术04im/. Oie抓2000， 72, 3853-3859; AfflM5^ertra肌及ev. 2002， 21， 76-86.和j"fl/. 2007, 79, 9398-402.)、 Annis等建立的亲和选择-分子体积排阻-液相色谱-MS-技术(丄4抓C7^抓Soc. 2004, 126, 15495-15503; Jwfl/. Ore附.2007, 79， 4538-4542 和C"/r.O/wVi.C^e肌fi/0/. 2007,11,518-526)。但是它们在应用中仍然受到很大限制。前线亲 和色谱技术必需亲和柱，其制备成本高；所用配体混合物中不同配体含量的波动范围有限； 难以可靠鉴定配体的特异性。超滤-液相色谱-MS联用技术的分析效率很低，不适宜于大量样 品快速测定，且定量测定重复性较低。亲和选择-分子体积排阻-液相色谱-MS-技术需特殊装 置连接分子体积排阻系统与LC-MS系统，需用大量的参考配体，分析测定工作量也较大。
另外，vonBreeman等还建立了通过将蛋白固定化在磁性纳米材料表面，用于对混合物中 不同配体快速鉴定，但是他们建立的此技术不能定量测定混合物中不同配体的亲和力(CWw6. CA諷F妙77^o一/7M"cT鄉2008， 11， 1-6)。
发明内容
本发明以功能化磁性纳米材料回收蛋白-配体复合物为基础，利用非标记参考配体和候选 配体的竞争结合，以及色谱分析定性和定量，从而用近似公式推算候选配体的相对亲和力。
1.本发明的技术方案在实施中涉及如下的特征性步骤(图l):
(1) 以合成的未纯化产物混合物、组合合成产物混合物、天然产物混合物为样品；
(2) 选择符合要求的内源配体为参考配体使样品直接为测定前样品，或选择恰当的 外源配体并将其优化量加入样品混合物中得到测定前样品；
(3) 选择所需功能化磁性纳米材料，可将蛋白直接或间接固定化在磁性纳米材料表 面以备经磁力回收蛋白与配体复合物，或在竞争结合体系达到平衡后加入以通 过磁力回收蛋白-配体复合物；
(4) 在恒温的缓冲体系加入优化量的相应蛋白和适量测定前样品，混匀启动来自测 定前样品中各配体对蛋白上相同活性位点的竞争结合直到平衡；所用蛋白量和 测定前样品量须优化以保障满足定量测定亲和力所要求的条件；
(5) 磁分离蛋白-配体复合物，加热或有机溶剂或二者同用变性蛋白并提取所结合的 所有配体并适当浓縮；
(6) 用完全相同色谱系统分析测定前样品和磁分离后提取的所结合配体混合物，同 步进行定性鉴定和定量测定各个配体的色谱峰面积或峰高；(7)优化测定前样品中参考配体量、竞争结合体系的测定前样品用量和蛋白用量、 色谱分析前的样品稀释或浓縮比例，以满足相应的特殊要求，从而可用特定近 似公式推算候选配体与参考配体之间的相对亲和力；
2、 根据本发明涉及的特征步骤，用于本发明的参考配体需要具有如下特征-
(1) 所选参考配体与需测定相对亲和力的候选配体在色谱分析时能被同步定量；
(2) 对复杂样品可用不同参考配体测定以确定不同性质候选配体的相对亲和力；
(3) 可选用样品中的特定配体为内源性参考配体，此时样品本身为测定前样品；如 选用外源性参考配体则需要加入样品中先混匀作为测定前样品；
(4) 选用外源性参考配体制备测定前样品时，所需加入外源性参考配体的量取决于 结合反应体系所用蛋白量，同时需保障在优化好测定前样品量后结合反应体系 中各种配体的结合率都低于20%;如用内源性参考配体，也需要优化测定前样 品用量以保障结合反应体系中各种配体的结合率都低于20%;
3、 根据本发明涉及的特征性步骤，本发明可用于未知含量混合物，但需知道候选配体的 某些性质以便在色谱系统定性鉴定或用其色谱特征进行鉴定，样品来源包括
(1) 设计合成某个预期配体的合成反应完成后未经过纯化的产物混合物，且产物混 合物中不含可使蛋白变性或会对蛋白进行化学修饰的物质；
(2) 设计后以固相或液相方式组合合成的含多个预期配体且未分离纯化的产物混合 物，且此产物混合物中不含可使蛋白变性或会对蛋白进行化学修饰的物质；
(3) 含预期配体的天然产物混合物或其分级后的级份，且此混合物质中不含会使蛋 白质变性或会对蛋白进行化学修饰的物质；
(4) 其它方式制备的含有预期配体的混合物(用分别合成的化合物混合制备的简单混 合物)，且此混合物中不含会使蛋白质变性或会对蛋白进行化学修饰的物质；
4、 根据本发明涉及的特征性步骤，本发明依赖于用磁性纳米材料通过磁力回收蛋白与配 体复合物，对所用磁性纳米材料的要求和应用方式的特征为
(1) 所选磁性纳米材料表面必须亲水，且与蛋白和配体非特异性结合尽可能低；
(2) 所选磁性纳米材料表面必须连有特定生物活性的功能团，可经化学反应将所用 蛋白以共价键固定化在其表面，或通过特殊生物亲和作用以非共价键固定在其 表面，以便在液相的竞争反应达到平衡后用磁力分离回收蛋白-配体复合物；(3)所用蛋白也可不固定化在所用磁性纳米材料表面，可在来自测定前样品的所有 配体竞争结合蛋白上相同活性位点达到平衡后再加入所用磁性纳米材料到液相 的竞争结合反应体系，但其相应的分析效率会被降低；
5、 根据本发明涉及的特征性步骤，本发明实施中需提取磁分离所得蛋白-配体复合物中 所有结合配体，可将复合物中的蛋白变性以提取所有结合的配体，可用提取措施包括 加热变性复合物中的蛋白后用有机溶剂或缓冲液提取、直接用有机溶剂提取、用有机 溶剂加热变性复合物中的蛋白并同步提取所结合的配体；
6、 根据本发明涉及的特征性步骤，此发明需用色谱系统定性鉴定和定量分析测定前样品 中所有配体和磁分离后所提取各种结合配体，对色谱系统的特征性要求如下
(1) 对测定前样品和所提取结合配体混合物，所用色谱分析条件必须完全相同；
(2) 据需测定亲和力配体的理化性质选择和优化色谱系统以提高分辩率和灵敏度；
(3) 在配体混合物组成足够简单时可用高效液相色谱结合紫外吸收检测分析；
(4) 在候选与参考配体都有良好挥发性时可用气相色谱进行分析；
(5) 其它可保障灵敏度和分辩率的色谱分析系统也可用，如毛细管电泳等；
(6) 对组成复杂的样品可使用分辨率和灵敏度都很高的质谱检测器且更便于定性；
7、 根据本发明涉及的特征性步骤，其定量测定混合物中某个或多个候选配体相对亲和力 可通过如下措施判断或满足定量测定相对亲和力所需要的基本条件
(1) 候选配体与参考配体应结合在蛋白的相同活性位点；显著增加结合反应体系中参 考配体的量后如候选配体结合率显著下降则其与参考配体结合在蛋白上相同位 点，这类配体的亲和力可用相应的参考配体和本发明测定其相对亲和力；
(2) 色谱分析时各配体的峰面积或峰高与其在样品中的含量都应成正比，这可通过简 单调整色谱分析进样前对样品的浓縮和稀释比例等就可实现；
(3) 竞争结合体系各配体的结合率都应低于20%;用参考配体标定蛋白结合容量， 据色谱系统灵敏度和预期所含配体数量估算所需蛋白量；设定测定前样品中参 考配体的量以保障竞争结合体系无候选配体时参考配体的结合率仍低于20%， 再逐步增加竞争结合体系的候选配体量使候选配体的结合率都低于20%;
(4) 各配体的回收率需已明确；可用远远过量的蛋白在相同情况下结合全部配体，测 定经过磁分离和提取浓縮所得各个配体的回收率；(5)色谱分析时各配体的色谱峰面积或峰高都应大于其线性响应曲线截距的5倍;可 用足够量的蛋白并优化色谱分析进样前样品的浓縮比例来实现；
8、根据本发明涉及的特征性步骤，在满足所有基本条件后可据色谱分析指标和各配体回 收率计算候选配体相对亲和力；先设定下列符号以推导以色谱定量时所需计算公式
^tb:测定前样品加入竞争结合体系后参考配体定量指标(色谱峰面积或峰高)；
^tx:测定前样品加入竞争结合体系后候选配体X定量指标(峰面积或峰高)；
^tb:结合配体混合物中参考配体定量指标； 及及b:参考配体的回收率；
JTX:结合配体混合物中候选配体X定量指标；i i x:候选配体X的回收率；
/b:参考配体色谱定量线性响应曲线的截距；《b:参考配体的解离常数；
/x:候选配体色谱定量线性响应曲线的截距；《x:候选配体X的解离常数；
Pf:竞争结合反应体系达到平衡后未被结合的蛋白位点浓度；
在液相体系结合反应体系达到平衡后所生成的蛋白与任一配体的复合物量应符合 质量作用定律，故对参考配体和任一候选配体X下述两个关系式可成立
尸fX(^bb —/b)/JV/及j b
v4tb — ^4bb
Kx =户f X (^BX - /x)/ iV/ /gj X ■<4tx —」bx
因候选配体与参考配体竞争结合相同位点，则上述两个关系式中的游离未结合位
点浓度(尸f)为同一个物理量，故候选配体与参考配体的相对亲和力可表示如下
——《-x-/-
i i x 爿tx — ^4bx ^tb — ^4bb
各配体色谱定量指标都显著高于其线性响应曲线截距，则相对亲和力可近似为
i 7 b ^bx, 爿bb ——《-x-/-
i 7 x ^tx —爿bx Ztb — j4bb 各配体结合率都低于20%，则相对亲和力可进一步近似如下
i i b 爿bx ,爿tx
——a;-x-/-
Xbi i x Jbb 爿tb
当参考配体亲和力已知时可定量测定候选配体解离常数；当比较不同样品中配体 的亲和力时如用相同参考配体则其亲和力可未知，如用不同参考配体则这些参考配体 的亲和力需已知；因只需相对色谱定量指标，色谱分析前浓縮比例对结果无影响。
10
图1.应用本发明测定混合物中配体相对亲和力的流程示意图。
图2.应用实例中所用生物素衍生物的结构示意图。
生物素衍生物为对应伯胺与生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应制备，过硅胶柱纯化。
图3.用本发明所需的生物素衍生物进行HPLC-MS-SIM分析的响应曲线。 响应曲线用纯度高于90%的样品测定。
图4.用本发明所述方法测定简单混合物中生物素衍生物的相对亲和力。
(a) 测定前样品HPLC-MS-SIM分析图。
(b) 仅含BPDEDA时结合配体混合物的HPLC-MS-SIM分析图。
(c) 再加20.0 pmol/L生物素后结合配体混合物HPLC-MS-SIM分析图。
图5.用于演示本发明应用的液相组合合成生物素衍生物的流程图。
图6.用本发明所述方法测定液相组合合成混合物中生物素衍生物的相对亲和力。
(a) 测定前样品HPLC-MS-SIM分析图。
(b) 仅含BPDEDA时结合配体混合物的HPLC-MS-SIM分析图。
图7.用本发明所述方法对川芎甲醇提取物中加不同生物素衍生进行指数富集的效应。
(a) 测定前样品HPLC-MS-SIM分析图。
(b) 第一轮测定后提取的结合配体混合物HPLC-MS-SIM分析图。
(c) 第二轮测定后提取的结合配体混合物HPLC-MS-SIM分析图。应用实例
用生物素衍生物同固定在纳米磁珠表面链亲和素的结合为模型来说明本发明的应用。 应用实例1.用本发明同步测定分别合成后混合制备的混合物中多个配体相对亲和力。
(1) 五种伯胺分别与N-羟基琥珀酰亚胺活化生物素在二氯甲垸中反应，产物用乙醚沉 淀和洗涤，干燥得对应的初步纯化的生物素酰胺(图2)。
(2) 以BPDEDA为参考，将其余四种初步纯化的生物素酰胺等量混匀，再加入相同摩 尔量的BPDEDA和双丹磺酰化乙二胺(DDEDA)、双((N-乙酰化)-4-氨基苯基)甲烷 得到组成简单的测定前样品，用甲醇溶解成各2.0mmol/L的高浓度储备液。
(3) 建立可同步定量这五种生物素衍生物的HPLC-MS-SIM分析体系用Phenomenex Gemini C18反向柱(IO.O cm x 0.2 cm)，流动相为65%甲醇-35%乙酸水溶液(含 0.3%乙酸)，流速为a20ml/min，按照图2所示分子离子质量测定结合了『的分 子离子峰(图3 4，测定前样品的HPLC分析图)。
(4) 用BPDEDA标定购买的链亲和素纳米磁珠(Promega Z5482)的结合容量，用上述 HPLC系统分析，发现其结合容量达到每毫升磁珠结合4纳摩尔BPDEDA的容量， 为用生物素化核酸测定容量的四倍左右，刚好符合固定化链亲和素纳米磁珠上每 个链亲和素可结合四个小分子生物素衍生物的容量。
(5) 按照图1所示的过程，在25 QC含2.0 ml TRIS-HC1缓冲液(IOO mmol/L， pH 7.0) 试管中加入洗涤后链亲和素纳米磁珠0.10 ml，加入测定前样品到相当于每个生物 素衍生物终浓度为1.0 pmol/L后温和混匀，间隙30秒摇动混匀进行竞争结合反应； 30 min后用磁力回收蛋白-配体复合物，用100 mmol/L TRIS-HC1缓冲液温和洗涤， 收集所有纳米磁珠后加甲醇1.0ml，在45Gc水浴加热并维持30min提取结合的配 体；再磁力去掉纳米磁珠后，将甲醇溶液用0.22pm微孔滤膜过滤，滤液在减压下 抽干溶剂，残留物用100^1色谱纯甲醇溶解为提取的结合配体混合物。
(6) 以生物素为恰当外参B，在上述反应体系中维持候选生物素衍生物浓度相同，加 入生物素终浓度到20.0 nmol/L，操作步骤同上制备结合配体混合物样品。
(7) HPLC-MS-SIM分析测定前样品(图4 a,为DATA SET A)和只用BPDEDA为参考 的结合配体混合物(图4 b,为DATA SET B)及另外加有高浓度生物素的结合配体 混合物(图4 c，为DATA SET C)。
12(8) 用0.6 ml纳米磁珠，测定对反应体系五种生物素衍生物的终浓度各为0.2 pmol/L 时磁分离所得结合配体混合物中各自配体的量，根据峰面积校正稀释浓縮效应计 算回收率，发现五种生物素衍生物的回收率基本无差异且接近于100%。
(9) 以各配体对应的色谱峰面积为定量指标，将结合配体混合物除以浓縮比例和回收 率得到换算成竞争结合体系的定量指标，利用测定前样品的定量指标计算各配体 的结合率以及在高浓度维生素C存在下的结合率，根据有误生物素的结合率差异 判断其结合位点，结果发现有高浓度生物素时候选和参考配体BPDEDA的结合率 都下降至少50%，表明其结合在与生物素相同的位点。
(10) 按照发明内容所示确定候选配体的相对亲和力，具体如下 设测定前样品换算成竞争结合体系的候选配体峰面积为^tx; 设测定前样品换算成竞争结合体系的参考配体(BPDEDA)峰面积为jtb; 无生物素时，结合配体混合物中参考配体换算成竞争结合体系的峰面积为:^BB; 无生物素时，结合配体混合物中候选配体换算成竞争结合体系的峰面积为:^Bx; i i b:参考配体的回收率(为100%);i i x:候选配体X的回收率(为100%); 《b:参考配体的解离常数； 候选配体X的解离常数；
则有尺x = J i b x ^bx z ^bb Xb i 及x ^tx 」tb
用此公式计算四种候选配体以BPDEDA为参考的相对亲和力为(重复4次) BPDEDA BNEDA BCHA BDEDA BBZA l.O(参考) 2.1 ±0.5 1.4±0.2 1.4 ±0.20.6 ±0.2
(11) 所用固定蛋白纳米磁珠的量取决于HPLC-MS系统定量测定各配体的灵敏度，及 保障结合配体混合物中各配体定量指标高于线性响应截距的5倍。
应用实例2.用本发明同步测定液相组合合成制备的混合物中多个配体的相对亲和力。
(1)参照图5液相组合合成四种生物素衍生物；将等摩尔量生物素N-羟基琥珀酰亚胺 酯，加到含四种羧酸的N-羟基琥珀酰亚胺混合物中，在二氯甲烷中与过量的四种 伯胺等摩尔混合物(环己胺、苄胺、N-萘替乙二胺、N-单丹磺酰化乙二胺)反应， 产物用乙醚沉淀，乙醚洗涤，干燥后添加等摩尔量的BPDEDA为测定前样品。(2) 以生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯反应收率为100%估算测定前样品中的生物素衍生 物量，参照图1所示流程，在25 QC含2.0 ml TRIS-HC1缓冲液(IOO mmol/L， pH 7.0) 试管中加入洗涤后链亲和素纳米磁珠0.10 ml,加入测定前样品到相当于生物素衍 生物终浓度为5.0nmol/L后温和混匀，间隙30秒摇动混匀进行竞争结合反应；30 min后用磁力回收蛋白-配体复合物，用100 mmol/L TRIS-HC1缓冲液温和洗涤， 收集所有纳米磁珠后加甲醇i.Oml，在45^水浴加热并维持30min提取结合的配 体；再磁力去掉纳米磁珠后，将甲醇溶液用0.22jLim微孔滤膜过滤后减压下抽干溶 齐U，残留物用100pl色谱纯甲醇溶解为提取的结合配体混合物。
(3) 用应用实例1中所用HPLC-MS-SIM系统分析测定前样品(图6a)、结合配体混合物 (图6b)中各配体定量指标，假定各配体回收率为100%，用应用实例l中公式计算 液相组合合成混合物中各生物素衍生物的相对亲和力；结果如下(重复测定6次)
BPDEDA BNEDA BCHA BDEDA BBZA
l.O(参考) 2.1 ±0.6 1.4±0.5 1.1 ±0.3 0.6 ±0.3
应用实例3.从本发明重复测定过程中高亲和力配体的指数富集效应。
(1) 制备川芎的甲醇提取物取lg川芎饮片，用50ml甲醇超声辅助提取30min，再 45^回流50min;用0.22 )am微孔滤膜过滤，滤液减压抽干；残留物约20mg用 5 ml甲醇溶解，再用0.22 pm微孔滤膜过滤；滤液中加入BBZA、BCHA和BDEDA， 使得最终滤液中BBZA的浓度为BDEDA的10倍且是BCHA的20倍；此混合物 作为测定前样品，其中BBZA为内源性参考配体。
(2) 参照图1所示流程，在25 。C含20.0 ml TRIS誦HC1缓冲液(IOO mmol/L, pH 7.0) 平底烧瓶中加入洗漆后链亲和素纳米磁珠1.0 ml，加入测定前样品到相当于三种 生物素衍生物总浓度略高于5.0 )imol/L后温和混匀，间隙30秒摇动混匀迸行竞 争结合反应；30min后用磁力回收蛋白-配体复合物，用100mmol/LTRIS-HCl缓 冲液温和洗涤，收集所有纳米磁珠后加甲醇5.0 ml，在45QC水浴加热并维持30 min 提取结合的配体；再磁力去掉纳米磁珠后，将甲醇溶液用0.22nm微孔滤膜过滤 后减压下抽干，残留物用500^1色谱纯甲醇溶解为第一轮测定的结合配体混合物， 留取50pl为样品备分析，其余全部用于第二轮测定。(3) 参照图1所示流程，在25 GC含1.0 ml TRIS-HC1缓冲液(IOO mmol/L， pH 7.0)试
管中加入洗涤后链亲和素纳米磁珠0.06 ml,加入第一轮测定的全部剩余结合配 体混合物后温和混匀，间隙30秒摇动混匀进行竞争结合反应；30min后用磁力 回收蛋白-配体复合物，用100 mmol/L TRIS-HCl缓冲液温和洗涤，收集所有纳米 磁珠后加甲醇5.0 ml，在45^水浴加热并维持30 min提取结合的配体；再磁力 去掉纳米磁珠后，将甲醇溶液用0.22Hm微孔滤膜过滤后减压下抽干，残留物用 60^1色谱纯甲醇溶解为第二轮测定的结合配体混合物。
(4) 用应用实例1所述HPLC-MS-SIM系统分析测定前样品(图7 a)、第一轮测定的结 合配体混合物(图7 b)、第二轮测定的结合配体混合物(图7 c)，以BBZA的峰面积 计算两外两种生物素衍生物的色谱峰面积相对值在两轮测定中的变化，结果表明，
在第二轮的结合配体混合物中，BCHA和BDEDA都被指数富集。
权利要求
1、一种以混合物为样品，选用恰当参考配体，经配体竞争结合蛋白上相同活性位点达到平衡，磁力回收蛋白-配体复合物，变性复合物中蛋白并提取所结合配体，色谱分析同步定性鉴定和定量测定参考与候选配体峰面积或峰高，在优化条件下用特定公式从所得峰面积或峰高推算候选配体相对亲和力的方法，其实施步骤包括(1)以混合物为样品，选择符合要求的内源性配体为参考配体使样品直接作为测定前样品，或选用符合要求的外源性配体为参考配体，并将适量的外源性参考配体加入样品混合物中得到测定前样品；(2)在恒温的缓冲体系加入适量的相应蛋白和适量的测定前样品，混匀后启动测定前样品中各配体对蛋白上相同活性位点的竞争结合直到达到平衡；(3)经磁力物理分离回收蛋白与配体复合物，洗涤去除非特异性结合的物质；(4)加热或有机溶剂或二者同用变性复合物中蛋白并提取所结合配体，适当浓缩；(5)用完全相同色谱系统，分别分析测定前样品和磁分离后提取的所结合配体混合物，同步进行定性鉴定和定量测定各配体的色谱峰面积或峰高；(6)优化步骤(1)中加入的参考配体量、步骤(2)中的相应蛋白量和步骤(2)中所用的测定前样品量以及色谱分析前的稀释或浓缩比例，以满足相应的要求从而可用特定近似公式推算候选配体与参考配体之间的相对亲和力；
2、 按照权利要求1步骤(l)所述，此方法需参考配体且对参考配体的特征性要求如下(1) 所选参考配体与需测定相对亲和力的候选配体在色谱分析时能被同步定量；(2) 对成分复杂的样品可用不同理化性质参考配体进行多次测定，以便确定不同理 化性质候选配体的相对亲和力；(3) 可选用样品中的特定配体为内源性参考配体，此时样品本身为测定前样品；如 选用外源性参考配体则需要加入样品中先混匀作为测定前样品；(4) 测定前样品中所需外源性参考配体量取决于结合反应体系的蛋白量，需保障在 所用蛋白量下无候选配体竞争结合时此外源性参考配体结合率仍低于20%;同 时需优化测定前样品用量以保障来自测定前样品的各配体结合率都低于20%; 如用内源性配体为参考，则来自测定前样品的各配体结合率也需都低于20%;
3、 按照权利要求1步骤(l)所述，此方法所用样品为混合物且不需知道样品中候选配体 的含量，但需知道某些性质以便在色谱系统进行定性鉴定，其特征性来源包括(1) 设计合成某个预期配体的合成反应完成后未经过纯化的产物混合物，且此产物 混合物中不含可使蛋白变性或会对蛋白进行化学修饰的物质；(2) 设计后以固相或液相方式组合合成的含多个预期配体且未分离纯化的产物混 合物，且此产物混合物中不含可使蛋白变性或会对蛋白进行化学修饰的物质；(3) 含预期配体的天然产物混合物或其分级后的级份，且此混合物中不含会使蛋白 质变性或会对蛋白进行化学修饰的物质；(4) 其它方式制备的含预期配体的混合物(如用分别制备的化合物混合所得的混合 物)，且此混合物中不含会使蛋白质变性或会对蛋白进行化学修饰的物质；
4、 按照权利要求1步骤(3)所述，此方法依赖于用磁性纳米材料通过磁力物理分离和 回收蛋白-配体复合物，对所用磁性纳米材料的要求和应用方式的特征为(1) 所选磁性纳米材料表面必须亲水，且与蛋白和配体非特异性结合尽可能低；(2) 所选磁性纳米材料表面必须连有特定功能团，以便通过生物亲和作用将对应蛋 白以非共价键固定在其表面，或经化学反应将所用蛋白以共价键固定化在其表 面，以便在液相的竞争反应达到平衡后用磁力分离回收蛋白-配体复合物；(3) 所用蛋白也可不固定化在所用磁性纳米材料表面，而在来自测定前样品的所有 配体竞争结合蛋白上相同活性位点达到平衡后再加入所用磁性纳米材料到液 相的竞争结合反应体系，但这种方式测定配体亲和力使得分析效率被降低；
5、 按照权利要求1步骤(4)所述，此方法需提取磁分离所得蛋白-配体复合物中所结合配 体，可变性复合物中蛋白以提取所结合配体，措施包括加热变性蛋白后用有机溶剂 或缓冲液提取、直接用有机溶剂提取、用有机溶剂加热变性蛋白并提取所结合配体；
6、 按照权利要求1步骤(5)所述，此方法需色谱系统定性鉴定和分析测定前样品中的配 体和磁分离后所提取各种结合配体的色谱峰面积或峰高，其对色谱系统的要求如下(1) 对测定前样品和所提取结合配体混合物，所用色谱分析条件必须完全相同；(2) 据需测定亲和力配体的性质选择和优化色谱系统以保障分辩率和灵敏度；(3) 在配体混合物组成足够简单时可用高效液相色谱结合紫外吸收检测分析；(4) 在候选与参考配体都有良好挥发性时可用气相色谱进行分析；(5) 其它可保障灵敏度和分辩率的色谱分析系统也可用，如毛细管电泳等；(6) 对组成复杂的样品可使用分辨率和灵敏度都很高的质谱检测器且更便于定性；
7、 按照权利要求1步骤(6)所述，此方法定量测定混合物中某个或多个候选配体的相对亲和力时必须同时满足下述条件，并可通过如下所述措施判断或满足所要求的条件:(1) .候选配体与参考配体应结合在蛋白的相同位点；候选配体的结合位点为其内在性 质，只能通过与参考配体竞争结合方式判断其结合位点；显著增加结合反应体系 中参考配体的量到足够高水平后，如候选配体结合率显著下降则其与参考配体在 蛋白上结合位点相同并可用此方法测定其亲和力，否则不能测定其亲和力；(2) .色谱系统分析测定前样品和磁分离后所提取的结合配体混合物时，参考配体和每个候选配体的色谱峰面积或峰高与其在样品中的含量应成正比，这可通过简单调 整色谱分析进样前对样品的浓縮和稀释比例来实现；(3) .候选配体和参考配体的结合率都应低于20%;结合反应体系所用蛋白量取决于色 谱系统的灵敏度和需同步测定亲和力的预期配体数量及其回收率，蛋白结合容量 可用参考配体标定后设定测定前样品中参考配体的量以保障竞争结合体系中在 无任何候选配体时其结合率仍然低于20%，在此条件下再逐步增加竞争结合反 应体系的候选配体量直到可检测候选配体的结合率都低于20%;(4) .各配体的回收率已知；可用远远过量的蛋白在相同情况下结合全部配体，测定经过磁分离和提取浓縮环节后所得各个配体的回收率；(5) .色谱分析测定前样品和磁分离后所提取结合配体混合物样品时，各个候选配体和参考配体的色谱峰面积或峰高都大于其线性响应曲线截距的5倍以上;这可通过 使用足够量的蛋白并优化色谱分析进样前的浓縮比例来实现；
8、 按照权利要求1步骤(6)所述，在满足所有条件后可据测定前样品中各配体色谱峰面积(或峰高)、磁分离后所得各结合配体色谱峰面积(或峰高)、各配体回收率计算候选配体相对亲和力；设定下列符号以推导用色谱定量指标计算相对亲和力的近似公式 ^tb:测定前样品加入竞争结合体系后参考配体定量指标(色谱峰面积或峰高)； ^rx:测定前样品加入竞争结合体系后候选配体X定量指标(峰面积或峰高)； ^tb:结合配体混合物中参考配体定量指标； i i b:参考配体的回收率；^tx:结合配体混合物中候选配体X定量指标；i i x:候选配体X的回收率； /b:参考配体色谱定量线性响应曲线的截距；《b:参考配体的解离常数； /x:候选配体色谱定量线性响应曲线的截距； 候选配体X的解离常数；Pf:达到平衡后竞争结合反应体系未被结合的蛋白位点浓度；提取的结合配体混合物相对于竞争反应体系的浓缩比例；在液相体系结合反应体系达到平衡后所生成的蛋白与任一配体的复合物量应符 合质量作用定律，故对参考配体和任一候选配体X下述两个关系式可成立<formula>formula see original document page 5</formula>因候选配体与参考配体竞争结合相同位点，则上述两个关系式中的游离未结合位点浓度(Pf)为同一个物理量，故候选配体与参考配体的相对亲和力可表示如下—=-X-/-ATbi i x v4tx — /4bx ^tb — v4bb各配体色谱定量指标都显著高于其线性响应曲线截距，则相对亲和力可近似为.-<formula>formula see original document page 5</formula>各配体结合率都低于20%，则相对亲和力可进一步近似如下<formula>formula see original document page 5</formula>可见，计算相对亲和力只需相对定量指标。如参考配体亲和力已知，则此方法可测定候选配体解离常数；当比较不同混合物样品中不同配体的亲和力时，如用相同 参考配体则其亲和力可未知，如用不同参考配体则需已知它们的相对亲和力。
9、 根据权利要求1步骤(1)到步骤(6)所述，如所用蛋白量足够多且色谱系统分辨率和灵 敏度都足够高，此方法可同步测定混合物中多个未知含量预期配体相对亲和力；其 最大优势是不需纯样品也不需高纯度参考配体，但判断候选配体是否结合在预定位 点时需高纯度参考配体；同时，因只需要相对定量指标，只要优化竞争结合体系和 色谱分析系统以满足权利要求(7)所述的所有条件，测定前样品和提取的结合配体混 合物在色谱分析进样前的浓縮或稀释比例对确定亲和力无明显影响。
10、 如将磁分离后所提取结合配体混合物作为样品且不再加入参考配体直接进行第二 轮、第三轮甚至更多轮次的竞争结合和磁分离后提取所结合配体，只要每轮竞争结 合体系能保障各配体的结合率都低于20%,则在此重复进行的竞争结合和磁分离复 合物提取结合配体过程中亲和力高的配体相对含量可实现选择性指数富集。
全文摘要
本发明描述通过将蛋白直接或间接固定在生物相容性磁性纳米材料表面，在液相启动候选配体和参考配体竞争结合达到平衡后，利用磁力回收蛋白-配体复合物，然后变性复合物中蛋白提取所结合配体，用达到所需分辨率和灵敏度的色谱系统分析竞争结合前的样品中和提取的结合配体中候选配体与参考配体的相对峰面积或相对峰高，同时测定各种配体经过磁分离和提取过程后的回收率，在各配体的定量指标显著高于其线性响应截距5倍且处于线性范围内、各配体结合率低于20％的条件下，从而定量测定结合在相同位点候选配体的相对亲和力的方法，可用于未纯化预期配体或组合合成混合物中配体亲和力的测定。
文档编号G01N30/00GK101620205SQ200810237298
公开日2010年1月6日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年12月30日
发明者于明安, 冬 刘, 娟 廖, 飞 廖, 莎 朱, 杨晓兰, 甘志勇, 谢燕玲, 赵运胜, 萍 邓 申请人:重庆医科大学