一种从血清代谢轮廓筛选恶性卵巢肿瘤标志物的方法

专利名称：：一种从血清代谢轮廓筛选恶性卵巢肿瘤标志物的方法
技术领域：
：本发明涉及分析化学和医学领域，是一种基于代谢组学技术的血清代谢轮廓用于筛查妇科恶性卵巢肿瘤血清小分子代谢标志物谱的新方法。
背景技术：
：卵巢癌、子宫内膜癌和宫颈癌并称为"妇科三癌"，前两者的发病率持续上升，宫颈癌腺上皮类型比例也在提高，正在严重危害妇女健康。一般体检和影像学检查作用有限，待能够发现和明确诊断时，往往已到了中、晚期，缺少预警价值。在卵巢恶性肿瘤的研究中，常用血清标志物有CA125(癌抗原125)、鳞状细胞癌抗原、CEA(癌胚抗原)。这些血清标志物对于妇科恶性肿瘤有提示作用，但仍容易与炎症、良性肿瘤导致的改变相混淆，因而造成误诊。为了满足临床诊断日益提高的灵敏度和特异性要求，开发新的血清肿瘤标志物势在必行。组学技术的出现和发展，为血清标志物的发现提供了新的技术手段。目前常用卵巢癌血清标志物均为蛋白，这些蛋白分子只能提供观测复杂基体对环境变化应答所需的部分信息。为能反映有机体整体功能的实时信号，还需进一步对血清小分子代谢物的变化进行研究。代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后兴起的系统生物学的一个新的分支，它通过测定生物体液或组织提取液中的内源性代谢产物含量，通过模式识别方法分析机体在各种状态下的代谢表型，能够高通量、全景式、直观地研究生物体在生理、病理以及药物和毒物作用下发生的各种代谢动态变化，从而有助于发现外源性物质作用的靶器官和靶点，进而确定与之相关的生物标志物，揭示其作用机制。血清小分子物质物理化学参数差异大，要对它们进行无偏向全面分析，单一分离分析手段难以胜任。目前用到的方法有色谱、质谱、核磁共振(NMR)、红外光谱、库仑分析、紫外吸收、荧光散射、发射性检测、光散射等。核磁共振技术具备快速和无偏向性的特点，但与其它技术相比灵敏度太低；其它方法如毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE/LIF)有很高的检测灵敏度，但都是选择性检测。色谱质谱联用以其高分离度、高通量，质谱以其普适性，是目前能够最好的兼顾灵敏度和无偏性的一种方法。恶性肿瘤发生必然伴随一系列基因结构的改变，引起细胞代谢方式转换。而基于代谢组学平台找到这些部位、组织特异性的血清生物标志物临床意义重大，是本研究核心内容。目前尚无采用液相色谱质谱联用系统筛查恶性卵巢肿瘤血清小分子标志物谱的报道。由于生物样本的复杂性，血清在采集、储藏及预处理过程中容易引入误差；电喷雾离子源本身具有一定的衰减效应，如果分析序列过长则样本的质谱响应会产生一定的偏差，都会给后续的建模带来困难，这也是代谢组学当前面临的问题。针对上述情况，我们通过建立标准的血清采集储存程序，实验过程中加入内标及质量控制(QC)样本校正实验偏差等措施确保数据的可靠性。
发明内容本发明的目的在于建立一种基于超高效液相色谱质谱联用系统的筛查恶性卵巢肿瘤血清小分子标志物谱的方法。该方法具有高灵敏度、高通量的优点，根据此方法筛查出的标志物谱可以为卵巢肿瘤的深入研究提供根据。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下—种从血清代谢轮廓筛选恶性卵巢肿瘤标志物的方法，采用超高效液相色谱_质谱联用技术对血清进行分析得到血清代谢轮廓；然后用多变量统计方法分析恶性卵巢肿瘤和正常人数据，筛选标志物谱。具体步骤如下，1)建立了一套标本收集和信息采集的规范化流程。所有的血清标本的采集步骤是相同的，最大程度减少在样品采集阶段引入的人为误差。取在相同条件下收集的n个恶性卵巢肿瘤患者和m个健康人的血液，血液分别置于负压管中，离心15分钟后取上清液，即为所需的n+m个血清样品，其可储存于超低温冰箱(-80°C)中，备用；n为^10的正整数，m为^10的正整数；2)血清样品预处理于血清样品中分别加入其3-5倍体积的乙腈沉淀蛋白，于0-4°C12000-15000g离心8-12分钟，上清液冻干重溶于2/3-4/3血清样品体积的水/乙腈v/v为1/3-1/5的溶液中，得n+m个样本；乙腈沉淀蛋白的过程中，体系内加入有3ng/yl的亮氨酸脑啡肽作为内标；3)对n+m个样本依次进行超高效液相色谱质联用分析；液相条件为色谱柱为AcquityC18柱(2.lmmi.d.X50mm，1.7iim)，柱温35°C，进样量1-10iiL，流动相A为体积浓度0.1%甲酸溶液，B为乙腈；梯度洗脱条件00.5min为98XA相，224.5min线性变化至100XB相并保持3.5min，再切换98%A并保持2min;流速O.35mL/min，柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测；质谱条件为电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；脱溶剂气流量为400-600L/h，脱溶剂气温度为280-30(TC，锥孔气流量为50L/h，脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气；离子源温度12(TC，毛细管电压为3100V，锥孔电压为35V，微通道板电压为2800V;每0.48秒采集一次数据；质量扫描范围m/z100920，获得被分析样本的总离子流图；最终得到n+m个样本的总离子流图，其即为血清代谢轮廓谱。于n+m个样本中随机抽取一个样品或一个以上样品的混合物作为QC样，作为质谱检测过程中的质量控制标准，在对n+m个样本依次进行超高效液相色谱质联用分析过程中，先将QC样进样一次，然后每分析4-8个样本后，再将QC样进样一次，通过分析QC样总离子流图，来监控实验过程中超高效液相色谱质联用仪有无较大系统偏差，确保数据的可靠性。4)采用LC-MS数据处理软件对n+m个样本的血清代谢轮廓谱进行峰提取，然后进行峰匹配，形成一个数据矩阵，数据矩阵用偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)方法进行统计分析，对恶性卵巢肿瘤患者以及健康人血清的代谢轮廓数据进行建模，根据模型中的变量重要性因子筛选对分类贡献最大的5个或5个以上的检测离子，这些检测离子对应的代谢物可被认为是在恶性卵巢肿瘤代谢产生影响的生物标志物谱。5)对筛选出的标志物谱进行discriminant分类分析，计算判别正确率和阳性检出率。46)对筛选出的标志物谱进行结构鉴定。本发明具有的效果是样本的采集、储存、预处理上采用自主建立的标准化程序，避免引入人为误差。所有的分析技术都是离体的。所采用血清样品预处理过程简单，不需要衍生化，误差小，这些优点对标志物的筛查尤为重要。采用基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC/QT0FMS)的代谢组学的研究平台，在较高的线速度下依然可以保持良好的分离效率，节省分析时间，提高分析通量。可以实现在较短的时间内的标志物筛查。飞行时间质谱的分辨率高，扫描速度快，一次分析可以得到大量代谢物信息。实验过程中加入内标，通过内标的响应可以校正预处理过程和实验中仪器响应微小漂移带来的误差。实验过程中还插入质量控制(QC)样本。QC样本为血清样本的混合物。通过对QC样的监控，可以检测分析序列中仪器响应有无漂移从而确保实验数据的可靠性。QC样中离子m/z288的相对标准偏差仅为3.2%，进一步证明了本专利所阐述方法的稳定性。PLS-DA模型能够有效地避免系统误差的干扰，且模型的预测正确率和稳定性都比较好。根据主成分载荷因子确定在恶性卵巢肿瘤代谢影响最大的前10个检测离子作为生物标志物谱。经discriminant分类分析验证，该标志物谱的阳性检出率为82.65%，平均判别正确率为90.90%，优于其它恶性卵巢肿瘤标志物。涵盖多个化合物的标志物谱在可以在一次分析中获得，此方法具有广泛的适用性和良好的扩展性，筛选的标志物具备开发成试剂盒的前景。图1血清小分子LC-MS代谢轮廓对比。(A)健康对照组的血清总离子流(TIC)图；(B)恶性卵巢肿瘤病人血清的TIC图；图2PLS-DA模型(A)得分矩阵。口为恶性卵巢肿瘤组，A为健康对照组，每个点表示一个样品，t表示样本在主成分投影值。(B)载荷矩阵。每个点表示一个质谱检测到的离子，w化表示变量在主成分上的载荷投影值，变量重要性因子由每个变量(质谱检测到的离子)在载荷矩阵中的载荷投影值计算得出。离原点远的点具有大的变量重要性因子，为潜在标志物。图3溶血磷脂酰胆碱C18:2在模型1中恶性卵巢肿瘤组和健康对照组中的平均峰面积比对图。B为恶性卵巢肿瘤组，口为健康对照组。纵坐标为峰面积，无单位。具体实施方式实施例11、血清采集采集前，纳入研究者签署知情同意书。恶性卵巢肿瘤纳入标准已诊断为恶性卵巢上皮性肿瘤，具体病理类型及分期不限。且在采集标本前未接受任何与该疾病的相关治疗。健康对照组纳入标准正常体检人群(女性50-70岁之间)。体检身体健康者。采集时间在清晨6:008:00时，抽取空腹静脉血，受试者体温在36°C37.5°C之间，生命体征平稳，不处于各种疾病急性期。采集的血液置于负压管中，离心15分钟后取5上清液。血清储存于超低温冰箱(-80°C)中，备用。采集标本同时收集临床信息，填写临床信息表，并输入计算机数据库。2、分析方法2.1血清样本预处理血清样本从超低温冰箱中取出，室温解冻。涡旋0.5分钟，使其充分混合。加4倍体积乙腈，涡旋0.5分钟，使蛋白沉淀。4t:度恒温13000g离心10分钟。取上清，置于冻干机中冻干。仪器分析前，用水/乙腈(v/V1:4)溶液复溶至原体积的5/6。2.2超高效液相色谱质谱分析(1)色谱条件色谱柱为AcquityC18柱(2.lmmi.d.X50mm，1.7iim)，柱温35°C;流动相A为O.1X甲酸溶液，B为乙腈；梯度洗脱条件00.5min为98XA相，224.5min线性变化至100%B相并保持3.5min，再切换98%A并保持2min;.流速0.35mL/min。柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测。进样量5yL(2)质谱条件电喷雾离子源(ESI)，采用正模式检测；脱溶剂气流量为600L/h，脱溶剂气温度为30(TC，锥孔气流量为50L/h，脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气。离子源温度12(TC，毛细管电压为3100V，锥孔电压为35V，微通道板电压为2800V。每0.48秒采集一次谱图；准确质量测定采用亮氨酸脑啡肽(正离子模式m/z556.2771)溶液为锁定质量溶液。质量扫描范围m/z100920。于29个样本中随机选取一个样品作为QC样，作为质谱检测过程中的质量控制标准，在对29个样本依次进行超高效液相色谱质联用分析过程中，先将QC样进样一次，然后每分析5个样本后，再将QC样进样一次，通过分析QC样总离子流图，来监控实验过程中超高效液相色谱质联用仪有无较大系统偏差，确保数据的可靠性。根据以上操作，获得血清小分子代谢物的轮廓(附图2)。申请人对15例恶性卵巢肿瘤患者和14例健康对照妇女的血清进行分析。样品分析顺序为疾病组与对照组交替进行。在分析序列中设置QC样品，QC样品为恶性卵巢肿瘤血清与健康人血清的混合物。在分析时间内QC样品的稳定性良好，没有出现明显的组分变化，可知所有的血清样品在整个分析时间内也是稳定的，同时仪器在样品分析过程中没有发生响应漂移的现象。通过内标和QC样，可以确保数据的可靠性。3模式识别及标志物筛选原始数据首先转换成NetCDF格式，利用免费软件Xcms(http:〃masspec.scripps.edu/xcms/xcms.php)进行峰识另U、峰匹配。PLS-DA采用SIMCA-P11.0(Umetrics，Umea，Sweden)进行。Discriminant分类分析采用SPSS10.0(SPSSInc.，Chicago,IL)进行。为了考察恶性卵巢肿瘤和健康对照人群的血清代谢差别，我们把每个样品的测量数据进行峰识别、峰匹配。此步骤中，半峰宽设为10秒，保留时间窗口设为9秒，其他参数皆为软件默认值。不符合上述要求的色谱峰将被认为是噪声弃去，峰识别匹配后形成一张由保留时间、质量数和峰面积构成的峰表。若有某些质谱离子在个别样本中没有检出，其峰面积视为0。血清代谢轮廓中有数以百计的组分，而利用多变量分析方法可以从大量的数据中提取有用的信息。PLS-DA是一种基于偏最小二乘法的多变量分类方法，它模拟了LC/MS分6析得到的数据和样本分类的关系，解释数据中恶性卵巢肿瘤组和对照组之间的最大偏差。偏差通过得分矩阵和载荷矩阵来体现。对每个变量(LC/MS分析得到的质谱峰)进行帕雷托标度(paretoscaling)，即每个变量除以其标准偏差的平方根，可以在一定程度减少PLS-DA运算中因响应强度造成的偏差。恶性卵巢肿瘤组样本赋予分类值l，对照组赋予分类值2，所有的计算参数均为软件默认值，由此得到PLS-DA模型，此处称为模型1。模型1的相关数据如下A=2、R2X=0.538、R2Y=0.832、Q2Y=0.691。其中A为模型使用的主成分数，R2X，R2Y分别代表模型对原X，Y信息的保留程度，9、为模型的预测能力。上述数据明模型具有良好的预测能力和稳定性。模型1具有2个主主成分，根据每个样本在主成分上的投影，得到得分矩阵图。在得分矩阵中(附图2A)，15例恶性卵巢肿瘤组和14例健康对照组的投影分别落在不同的区域，表明恶性卵巢肿瘤与健康人群的代谢显型上存在明显的区别。根据每个变量在主分成上的投影，得到载荷矩阵图。在模型的载荷矩阵中(附图2B)，根据每个变量的在载荷图上的坐标计算其变量重要性因子。计算方式如下公式(1)中A为模型主成分数，K为变量数，wak为变量在PLS中的权重，SSY表示第a个成分可解释的SS，SS为上一个主成分残差的平方和。将变量重要性因子最大的前10个变量的信息提取，认为是潜在的标志物谱，(表1)。为了进一步考察筛选出的标志物是否具有良好的预测能力，利用表1中IO个质谱检测离子对模型1中的15例恶性卵巢肿瘤组和14例健康对照组进行Discriminant分类分析。采用逐步方法(按Wilk'sA最小值)选择变量进入方程，在Descriptive栏中选Means项，在FunctionCoefficients栏中选Fisher's项，在classification栏中选leave-one-outclassification项。其它参数为默认值。预测的平均正确率为90.90%，对恶性卵巢肿瘤的阳性检出率为82.35%。可见，本专利涉及方法筛选出来的标志物具有良好的预测能力，具备开发前景。对表1中的检测离子进行结构鉴定，分别为l-棕榈酰-3-磷酸胆碱甘油三脂、2_棕榈酰_3-磷酸胆碱甘油三脂、1-硬脂酰_3-磷酸胆碱甘油三脂、1-亚油酰_3-磷酸胆碱甘油三脂、色氨酸、胆红素等化合物以及正离子模式下保留时间为2.25分钟，质荷比(m/z)为100的离子以及保留时间14.72分钟，m/z330的离子。以1-亚油酰-3-磷酸胆碱甘油三脂为例，附图3为其在恶性卵巢肿瘤组和健康对照组中的峰面积对比图。1-亚油酰_3-磷酸胆碱甘油三脂在恶性卵巢肿瘤中下调，与健康对照组程显著性差异(P=0.01)。1-亚油酰-3-磷酸胆碱甘油三脂是一种溶血磷脂酰胆碱类化合物，是G蛋白受体。人体中，1-亚油酰-3-磷酸胆碱甘油三脂在胆固醇酰基转移酶(LCAT)催化下由卵磷脂的脂肪酸链水解生成。l-亚油酰-3-磷酸胆碱甘油三脂的浓度显著下调，测推是由于细胞过度增殖抑制了血清胆固醇酰基转移酶的活性，导致l-亚油酰_3-磷酸胆碱甘油三脂减少。而联合使用本方法筛选出的标志物谱在区别恶性卵巢肿瘤血清和健康人血清具有高准确率，则是本申请的创新点。实施例2为了说明本专利所述的筛选方法的重复性，申请人对另外14例恶性卵巢肿瘤样本和14例健康对照样本进行与模型l相同的样本分析和数据处理过程，并建立另一个PLSDA模型，此处称为模型2。与实施例1不同之处在于，模型2的相关数据为A=4、R2X=0.677、R2Y=0.939、Q2Y=0.756。模型2同样可以对恶性卵巢肿瘤和健康对照样本进行区分。通过模型2，根据变量重要性因子筛选出来的10个变量中，8个变量与表1一致。运用本专利所述方法对不同的人群可以筛查出基本一致的标志物，说明该方法确实具有稳定性，重复性，不容易受到受试人群的影响，适合推广到临床应用。利用模型2筛查出的10个标志物离子对模型2中的14例恶性卵巢肿瘤样本和14例健康对照样本进行判别分析。预测的平均正确率为81.80%，阳性检出率为70.58%。为了考察标志物的普适性，利用表l所列的10个质谱离子对模型2中样本进行Discriminant分类分析。预测结果与利用模型2筛选的标志物对模型2样本进行Discriminant分类分析的结果是一样的。可见由本发明所述方法筛查出的标志物具有很好的普适性，即使用于非建模人群的预测，也可以得到很好的结果，因此筛选的标志物谱具备开发成试剂盒的前景。表1恶性卵巢肿瘤潜在标志物谱<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*:在模型2中也是标志物。un:未知化合物a:未得到标样验证本发明是基于超高效液相色谱质谱联用技术的代谢组学方法和多变量数据技术筛选标志物的。经过沉淀蛋白等简单预处理后，用液质联用系统分离检测血清中的小分子代谢物。将得到的数据建立偏最小二程-判别分析(PartialLeastSquaresDiscriminantAnalysis,PLS-DA)模型，以此判别恶性卵巢肿瘤组和健康对照组的代谢轮廓。同时，根据不同化合物的在模型中的载荷因子筛查出潜在的标志物谱。本发明通过建立标准化血清采集储存流程、加入内标，最大程度地减小血清采集和分析带来的误差，使用质量控制(QC)样本对分析过程中仪器状态进行监控，提高了实验结果的可靠性。本发明涉及的筛选方法重复性好，筛选的标志物预测性能好。经Discriminant分类分析验证，预测平均正确率达到90.90%，阳性检出率为82.65%。涵盖多个化合物的标志物谱可以在一次分析中获得，表明该标志物谱适合高通量分析，具有推广到大规模样本筛选以及开发成试剂盒的前景。权利要求一种从血清代谢轮廓筛选恶性卵巢肿瘤标志物的方法，其特征在于采用超高效液相色谱-质谱联用技术对血清进行分析得到血清代谢轮廓；然后用多变量统计方法分析恶性卵巢肿瘤和正常人血清代谢轮廓数据，筛选标志物谱。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于；所述获取血清代谢轮廓的具体步骤如下，1)取在相同条件下收集的n个恶性卵巢肿瘤患者和m个健康人的血液，血液分别置于负压管中，离心15分钟后取上清液，即为所需的n+m个血清样品；n为^10的正整数，m为>10的正整数；2)血清样品预处理于血清样品中分别加入其3-5倍体积的乙腈沉淀蛋白，于0-4°C12000-15000g离心8-12分钟，上清液冻干重溶于2/3-4/3血清样品体积的水/乙腈v/v为1/3-1/5的溶液中，得n+m个样本；乙腈沉淀蛋白的过程中，体系内加入有3ng/yl的亮氨酸脑啡肽作为内标；3)对n+m个样本依次进行超高效液相色谱质联用分析；液相条件为色谱柱为AcquityC18柱，柱温35°C，进样量1_10iiL，流动相A为体积浓度0.1%甲酸溶液，B为乙腈；梯度洗脱条件00.5min为98%A相，224.5min线性变化至100%B相并保持3.5min，再切换98%A并保持2min;流速0.35mL/min，柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测；质谱条件为电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；脱溶剂气流量为400-600L/h，脱溶剂气温度为280-30(TC，锥孔气流量为50L/h，脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气；离子源温度12(TC，毛细管电压为3100V，锥孔电压为35V，微通道板电压为2800V;每0.48秒采集一次数据；质量扫描范围m/z100920，获得被分析样本的总离子流图；最终得到n+m个样本的总离子流图，其即为血清代谢轮廓谱。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于于n+m个样本中随机抽取一个样品或一个以上样品的混合物为质量控制(QC)样，作为质谱检测过程中的质量控制标准，在对n+m个样本依次进行超高效液相色谱质联用分析过程中，先将QC样进样一次，然后每分析4-8个样本后，再将QC样进样一次，通过分析QC样总离子流图，来监控实验过程中超高效液相色谱质联用仪有无较大系统偏差，确保数据的可靠性。4.根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤1)中获得的血清样品可储存于超低温-8(TC的冰箱中，备用。5.根据权利要求1所述方法，其特征在于采用LC-MS数据处理软件对n+m个样本的血清代谢轮廓谱进行峰提取，然后进行峰匹配，形成一个数据矩阵，数据矩阵用偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)方法进行统计分析，对恶性卵巢肿瘤患者以及健康人血清的代谢轮廓数据进行建模，根据模型中的变量重要性因子筛选对分类贡献最大的5个或5个以上的检测离子，这些检测离子对应的代谢物可被认为是在恶性卵巢肿瘤代谢产生影响的生物标志物谱。6.根据权利要求l所述方法，其特征在于对筛选出的标志物谱进行判别分类(discriminant)分析，计算判别正确率和阳性检出率；然后对筛选出的标志物谱进行结构鉴定。全文摘要本发明公开了一种从血清代谢轮廓筛选恶性卵巢肿瘤标志物的方法，采用超高效液相色谱-质谱联用技术对血清进行分析得到血清代谢轮廓；然后用多变量统计方法分析恶性卵巢肿瘤和正常人的血清代谢轮廓数据，筛选标志物谱。本发明的筛选方法重复性好，筛选的标志物预测性能好。经判别分类分析(Discriminant)验证，预测平均正确率达到90.90％，阳性检出率为82.65％。涵盖多个化合物的标志物谱可以在一次分析中获得，表明该标志物谱适合高通量分析，具有推广到大规模样本筛选以及临床应用的前景。文档编号G01N33/48GK101769910SQ20081023038公开日2010年7月7日申请日期2008年12月30日优先权日2008年12月30日发明者万小平,吴小华,张晓燕,徐丛剑,曹锐,许国旺,赵素敏,路鑫,陈静申请人:中国科学院大连化学物理研究所;复旦大学附属妇产科医院;大连市妇产医院;上海交通大学附属第一人民医院;复旦大学附属肿瘤医院