专利名称：：一种微量终点显色鲎试验方法
技术领域：
：本发明涉及细菌内毒素检测技术，特别是一种微量终点显色鲎试验方法。
背景技术：
：细菌内毒素检测技术在现代医药工业上有重要的应用价值。现行的细菌内毒素检测方法是鲎试验法。鲎试验法需要使用鲎试剂(TAL或LAL)，而生产鲎试剂需要消耗珍贵的鲎资源。在我国，鲎资源已濒临枯竭。目前尚没有更成熟的或更好的细菌内毒素检测方法能够取代鲎试验法。如果由于鲎资源的枯竭而导致鲎试剂供应紧缺，对我国的医药工业将是灾难性的打击。在尚没有更好的替代方法的今天，研究一种消耗资源更少的鲎试验法具有重要和实际的意义。《中国药典》2005年版收载的细菌内毒素检测(BET)方法分类如下-工限量法凝胶法i半定量法BET方法j光度法<L显色"动态显色法L终点显色法上述BET方法的鲎试剂(TAL)用量，凝胶法是每反应试管100^1，光度法是每反应试管或每反应孔50~10(Hil。以下称每反应管(或孔)的TAL用量为每单个试验用量，以pl/T表示(T为Test的縮写)，如凝胶法TAL用量为100fil/T，光度法TAL用量为50100nl/T。终点显色法鲎试验的原理是人工合成一种显色基质，通常是一种寡肽(三肽或四肽)，肽链的末端连接一个显色基团对硝基苯胺(pNA)。当TAL与内毒素反应产生凝固酶时，凝固酶能水解显色基质的肽键使pNA分离，游离的pNA使溶液呈黄色。用光度仪测定溶液的光度值可以建立内毒素浓度与光度值的线性关系。反应过程示意如下-a必a「动态浊度法广浊度法jL终点浊度法内毒素TAL~~^凝固酶凝固酶显色基质~L^肽+pNA(黄色)现行终点显色法鲎试验的实验步骤如下(以下步骤所描述的过程是指每反应试管或每反应孔的试验过程)(1)用水分别复溶冻干的TAL和显色基质。(2)50plTAL+5(^1样品_11^_^反应5~30分钟(3)加入显色基M~~^~~^反应5~30分钟(4)加入10(^1反应终止液终止反应(5)用光度仪测读反应混合溶液(共300ijI)的光度值(6)对实验数据作回归分析
发明内容本发明的目的是改进现行的终点显色法鲎试验，减少BET的TAL耗量，提供一种微量终点显色鲎试验方法。为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案是一种用于细菌内毒素检测的微量终点显色鲎试验方法，该方法使用一种用塑料制作的96孔微孔酶标板作为反应容器及光度测定容器，使用微量的鲎试剂(TachypleusAmebocyteLysate，TAL或LimulusAmebocyteLysate，LAL)作终点显色法鲎试验。所述96孔微孔酶标板外周尺寸及各孔中心位置与美国国家标准学会(AmericanNationalStandardsInstitute,ANSI)及生物分子筛选学会(SocietyforBiomolecularScreening,SBS)标准ANSI/SBS4-2004forMicroplates-WellPositions中Figure1-Wdlpositionsofa96wellmicroplate的酶标板(microplate)的外周尺寸及各孔中心位置相同；所述各孔的直径为①3.(K5.0mm，孔深为712mm。所述96孔微孔酶标板可用作所有光度法鲎试验的反应容器及光度测定容器，包括浊度法和显色法鲎试验。所述孔的最佳尺寸为直径为04.(K4.4mm，孔深为10mm。一种微量终点显色鲎试验方法，其步骤如下(以下步骤所描述的过程是指每单个孔的试验过程)(1)用水复溶冻干的显色基质，用显色基质溶液复溶冻干的鲎试剂，使复溶后的鲎试剂含有显色基质；(2)取1040iJl含有显色基质的鲎试剂加入96孔微孔酶标板的反应孔中，另加入等量的样品(水、标准内毒素或供试品)，混勾，置适宜温度(通常是37t:)反应一定的时间(通常是530分钟)；(3)当反应达到预定的时间，另加入一定量的反应终止液(通常是鲎试剂量的两倍)去终止该反应；(4)把96孔微孔酶标板放入光度仪/酶标仪中测定吸光度值(OD)，对数据作回归分析并计算供试品的内毒素含量。所述微量终点显色鲎试验方法-(1)鲎试验使用96孔微孔酶标板作反应容器及光度测定容器；(2)使用显色基质溶液复溶鲎试剂，使鲎试剂溶液含有显色基质；(3)鲎试剂用量为10^4(Hd/T;(4)显色基质存在于反应全过程。本发明的微量终点显色鲎试验方法消耗的TAL量仅是现行鲎试验方法的10~20%，即1(K20nl/T，而且实验操作更简便快捷。本发明的部分内容同样可以应用到其它光度法鲎试验，使TAL的用量减少8(K900/。。本发明从如下两方面进行探索研究，以达到减少TAL用量之目的-1.反应容器现行显色法鲎试验使用的反应容器是一种用塑料制作的，有96个孔，孔径(D6.4^6.7mm，孔深10mm的标准微孔板(microplate,也称酶标板或细胞培养板)。反应孔结构及尺寸与TAL用量有极大关系。1)一般认为，只要减少被测溶液的体积，就可以相应减少TAL的用量。这只是一种简单的直觉。光度法测定的原理是基于被测量参数(如内毒素浓度C)与光度值的相关性。简单地减少被测溶液的体积会影响到被测参数与光度值的相关性。根据吸光度公式A=8LC,要保证光度值(A)对被测参数(C)的变化有足够的敏感性，被测溶液必须维持一定的深度(L，即透射光程)。以标准微孔板为例，如果想减少被测溶液的体积，又要不影响C与A的相关性，就要保持大致的溶液深度L。要使体积减少而深度不变，只能通过縮小反应孔的孔径①去实现。为此，本发明的96孔微孔酶标板的孔径只有O)3.05.0mm。根据公式V=r2nh，lOOpl的反应混合液(50(JlTAL+50yl样品)在标准微孔板上达到的液深为2.86mm，而同样的液深在(D3.0mm的特制微孔板上只需20pl反应混合液就可以达到。20jj1的反应混合液只需要lOpl的TAL。2)最小孔径虽然反应孔径越小节省TAL越多，但确定最小孔径值时必须考虑如下因素(1)光度仪的透射光束直径光度仪的投射光束直径通常在O2.0mm左右，因此反应孔径的最小值理论上应不小于2.0mm，否则投射光会打在反应孔的边缘，影响光度值测量的准确性。(2)实验操作的适用程度反应孔径太小，会增加实验操作的难度。经过实验比较，反应孔径在0)35mm，孔深在7~12mm较适宜。3)反应孔位置现行的标准96孔微孔板适合绝大多数的光度仪/酶标仪使用。为了提高本发明的适用性，本发明的96孔微孔酶标板，各孔的圆心位置及板的周边尺寸与美国标准96孔微孔板[1]完全相同。这意味着凡适用标准96孔微孔板的光度仪/酶标仪都适用本发明的96孔微孔酶标板。本发明的96孔微孔酶标板的结构及尺寸见图1。2.实验方法学本发明大幅度减少TAL的用量，要使内毒素检测所依据的酶促反应至少保持原有的特性(灵敏度、反应速度以及抗干扰能力)，还需要改进实验的方法。现行的显色鲎试验方法分为动态法和终点法两种，主要区别如下动态法终点法内驗鹏Q"^gjMSTT)内驗喊C)JM^像OD)分另蛉肺梟分另鹏娜含显^^TAL繊力瞎fflfp口口^S^娜tal娜瞎fifR赚液<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>特征①显色基质存在于反应全过程①显色基质在反应后过程才加入参与反应②灵敏度高②灵敏度相对低实验操作方便繁琐制备技术要求高较低制备成本高较低终点显色法鲎试验的灵敏度一般为0.1EU/mL，而动态显色法鲎试验的灵敏度可达0.005甚至0.001EU/mL。动态法鲎试验灵敏度高的原因主要有两个一是反应的时间较长；二是显色基质始终存在于反应的全过程。动态法的试剂制备是把显色基质与TAL混合在一起冷冻干燥而成。这种制备方法对TAL和显色基质的纯度要求以及制备技术要求非常高，因而制备成本也相对高。使用时，用水复溶冻干的TAL，TAL溶液就已经含有显色基质。当TAL与内毒素反应把TAL中的凝固酶原激活成凝固酶时，凝固酶能马上水解溶液中的显色基质，使其释放出显色基团pNA。这就是动态显色法鲎试验灵敏度高的重要原因之一。终点显色法试剂的制备方法是把TAL与显色基质分开冻干。这样对TAL原料和显色基质的要求相对低，制备技术也较简单，因而制备成本也较低。使用时要用水分别复溶TAL和显色基质，先用TAL与样品反应，样品中的内毒素使TAL的凝固酶原激活成凝固酶。反应过一段时间后，才加入显色基质，让溶液中的凝固酶水解显色基质释放出显色基团pNA。这种分段反应的方式使得终点法的灵敏度、反应速度以及抗干扰能力均逊于连续反应方式的动态法。此外，分段反应方式还使得实验操作繁琐，增加了影响实验精确性的因素。正是终点法的这些缺陷导致了该方法的应用日渐式微，在今天终点显色法鲎试验已几乎退出市场，取而代之的是动态法鲎试验。本发明选择显色法作为研究对象，是因为显色法鲎试验使用显色基质参与反应，替代了TAL的部分功能。而显色基质是一种人工合成的寡肽，不存在资源问题。本发明选择终点显色法鲎试验作为研究改进的对象，是因为终点法不需要动态法所必需的较昂贵的光度仪，使本发明易于推广。但是，本发明要解决的一个关键问题是在大幅度减少TAL用量的条件下，如何使鲎试验保持足够的灵敏度、反应速度以及抗干扰能力。本发明分析了动态显色法鲎试验具有较好性能的原因，认为关键在于动态法采用的是连续反应方式，显色基质始终存在于反应溶液中。进而考虑，如果终点法鲎试验借鉴动态法的连续反应方式，是否具有动态法同样的良好性能呢？我们使用动态显色法试剂来作微量终点显色法试验，实验结果表明我们的推测是完全正确的。如前所述，动态显色法试剂的制备技术要求要比终点显色法高，制备成本也高。本发明的目的不仅要研制一种微量的鲎试验方法，而且要使该方法易于被推广应用，包括它的优良性能及低制造成本。我们分析了动态显色法试剂的制备工艺，认为该工艺的主要特点在于TAL与显色基质混合冻干，使得制备工艺对原材料及处理的要求比终点显色试剂更为严格。除了混合冻干法外，是否还有其它方法使显色基质始终存在于反应溶液中呢？经过大量的试验比较，我们找到一种最简捷有效的方法，就是使用显色基质溶液来溶解TAL，使复溶的TAL中含有所需浓度的显色基质，这相当于用水复溶动态显色法试剂的效果。使用这种方法，制备试剂时可以与制备普通的终点显色法试剂一样分别冻干TAL和显色基质，避免象制备动态显色法试剂所需的高要求高成本。使用试剂时，先用水复溶显色基质，再用显色基质溶液去复溶冻干的TAL。这样在实验操作上比动态法鲎试验略显繁琐，但比现行的终点显色法鲎试验省略了一个重要且耗时的操作步骤。综上所述，本发明的微量终点显色法鲎试验在实验方法学上与现行终点显色法有明显的差异。两种方法比较如下现行终点显色法微量终点显色法相关变量C國ODC-ODTAL与显分别冷冻干燥，分别保存色基质存在形态使用方式①用水分别复溶TAL和显色基质；②取50~100|J1TAL溶液加等量样品溶液反应一定激队显^^再鹏"^11司;④加入反应终止液终止反应分别冷冻干燥，分别保存①用水复溶显色基质，用显色基质溶液复溶TAL;②取1040|Jl含显色基质的TAL溶液加等量样品溶液反应一定时间；③加入反应终止液终止反应反应机理特征第①步TAL凝固i第②步:显色,肽+pNA(黄色)①显色基质在反应后过程才加入参与反应②灵敏度相对低，抗干扰能力相对差TAL~^美显色^固酶I肽+pNA(黄色)①显色基质存在于反应全过程②灵敏度较高，抗干扰能力较好实验操作制备技术较低相对方便、快捷较低制备成本较低较低图1是本发明塑料96孔微孔酶标板结构示意图。具体实施例方式举例使用微量终点显色鲎试验法对一种供试品进行细菌内毒素检查的方法及步骤如下。一、制备终点显色法鲎试验使用的鲎试剂(TAL)。二、制备终点显色法鲎试验使用的显色基质。三、制备细菌内毒素检查用水(BET水)。四、制造一种塑料96孔微孔酶标板1(Microplate)，该酶标板各孔2的直径为O3.0~5.0nwn,孔深为712mni，酶标板外周尺寸及各孔中心位置与美国国家标准学会及生物分子筛选学会标准ANSI/SBS4-2004forMicroplates-WellPositions中Figurel-WellPositionsofa96wellmicroplate的酶标板的夕卜周尺寸及各孔中心位置相同。五、制备内毒素标准系列溶液(C溶液)，如0.5、0.25、0.125、0.06EU/mL，制备方法应符合《中国药典》细菌内毒素检査法(BET法)的要求。六、制备供试品溶液(A溶液)和阳性供试品对照溶液(B溶液)，制备方法应符合BET法要求。七、按使用说明用BET水复溶冻干的显色基质，轻轻摇匀，然后按TAL的标示装量吸取相应量的显色基质溶液复溶TAL，轻轻摇匀。八、取步骤四所述的塑料96孔微孔酶标1板一块，按下表设置的反应项目加入相应溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>九、加液完毕，把酶标板置振板器上振310秒，然后置酶标板于37。C恒温孵育530分钟。十、孵育到预定的时间后，往每孔加入40pl反应终止液，然后把酶标板置振板器上振310秒。十一、把酶标板放入光度测定仪/酶标仪中测定每孔的吸光度值(OD)，对OD数据作回归分析，建立标准内毒素浓度与OD关系的标准曲线；用此标准曲线计算供试品的内毒素含量。权利要求1.一种微量终点显色鲎试验方法，其特征是该方法使用塑料96孔微孔酶标板作为反应容器及光度测定容器，使用微量的鲎试剂作终点显色法鲎试验。2、据权利要求1所述的微量终点显色鲎试验方法，其特征是所述塑料96孔微孔酶标板(1)外周尺寸及各孔(2)中心位置与美国国家标准学会及生物分子筛选学会标准中的酶标板的外周尺寸及各孔中心位置相同；所述各孔(2)的直径为①3.05.0mm，孔深为712mm。3、据权利要求2所述的微量终点显色鲎试验方法，其特征是所述各孔(2)的直径为04.(K4.4mm，孔深为10mm。4、据权利要求2或3所述的微量终点显色鲎试验方法，其特征是所述塑料96孔微孔酶标板(1)可用作所有光度法鲎试验的反应容器及光度测定容器，包括浊度法和显色法鲎试验。5、据权利要求1所述的微量终点显色鲎试验方法，其特征是使用微量的鲎试剂TAL或LAL作终点显色法鲎试验，其步骤如下，以下步骤所描述的过程是指每单个孔的试验过程-a)用水复溶冻干的显色基质，用显色基质溶液复溶冻干的鲎试剂，使复溶后的鲎试剂含有显色基质；b)取1040|J1含有显色基质的鲎试剂加入到96孔微孔酶标板(1)的反应孔(2)中，另加入等量的样品，混匀，在温度为37匸的条件下反应530分钟；所述样品为水、标准内毒素或供试品-,c)当反应达到预定的时间，另加入反应终止液，加入量通常是鲎试剂量的两倍，去终止该反应；d)把96孔微孔酶标板(1)放入光度仪/酶标仪中测定吸光度值OD，对数据作回归分析并计算供试品的内毒素含量。6、据权利要求5所述的微量终点显色鲎试验方法，其特征在于a)鲎试验使用塑料96孔微孔酶标板(1)作反应容器及光度测定容器；b)使用显色基质溶液复溶鲎试剂，使鲎试剂溶液含有显色基质；c)鲎试剂用量为d)显色基质存在于反应全过程。全文摘要本发明涉及细菌内毒素检测技术，特别是一种微量终点显色鲎试验方法。该方法使用96孔微孔酶标板作为反应容器及光度测定容器，使用微量的鲎试剂(TachypleusAmebocyteLysate，TAL或LimulusAmebocyteLysate，LAL)作终点显色法鲎试验。本发明的微量终点显色鲎试验方法消耗的TAL量仅是现行鲎试验方法的10～20％，即10～20μl/T，而且实验操作更简便快捷。本发明的部分内容同样可以应用到其它光度法鲎试验，使TAL的用量减少80～90％。文档编号G01N33/579GK101368967SQ200810198228公开日2009年2月18日申请日期2008年8月28日优先权日2008年8月28日发明者冯聚锦,群韦申请人:湛江安度斯生物有限公司