亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率法Ca²⁺荧光探针及合成方法

专利名称：亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率法Ca²⁺荧光探针及合成方法
技术领域：
本发明涉及一类亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率法(^2+荧光探针 的设计与合成，属于生物化学传感研究领域。
背景技术：
<^2+作为细胞内的第二信使参与并控制一系列重要的生命过程，不仅直接激 活具有重要生理意义的细胞内的机械活动(如肌肉收縮等)，同时也作为细胞内 第二信使介导第一信使(如激素等细胞外信号)对细胞内的反应，其影响几乎 涉及到细胞所有的生理和生化过程，如物质代谢、肌肉收縮、胞吞、胞饮、神
经递质释放、染色体移动、DNA合成、细胞分裂以及细胞凋亡等。有关细胞Ca^ 的研究一直是生物学、化学、基础和临床医学等学科领域的前沿热点课题。
细胞内游离(^2+的分布是极不均匀的，在细胞内外之间以及胞内各细胞器 与胞质之间均有大的浓度梯度存在。C^+行使其胞内信使作用正是通过胞内不同 区域游离(^2+含量及其分布的时空依赖性变化而实现的，其中涉及通过质膜离 子通道的外<^2+内流和泵出，胞内诸细胞器的内(^2+释放和摄取等。因此亚细 胞水平(^2+含量及分布变化的动态监测方法的研究对(^2+信号传递本质的认识 具有十分重要的意义。即要求细胞(^2+的测定不仅能提供全细胞C产的信息， 更能够提供有关(^2+的亚细胞区域的彼此独立又相互关联的信息，诸如胞质、 胞核、线粒体、内质网、高尔基体等。
目前胞内游离钙的测定方法主要是应用Tsien等人合成的Quin-2、 Indo-l、 Fura-2、 Fluo-3及Fluo-4等钙荧光探针而建立的钙荧光指示剂法。然而，该类荧 光探针或需要在紫外区激发，导致细胞自身荧光干扰及光损伤；或与(^2+结合 后无荧光峰的位移，难以采用双波长比率法进行测定；或不具有靶向性而无法 用于亚细胞水平(^2+的测定。迄今为止，尚未见既可长波激发、又与C^+结合 后荧光峰位移、且对胞内Ca"则定具有亚细胞特异性、可在亚细胞水平进行Ca2+ 测定的整体性能优良的小分子钙荧光探针及其在生命科学中的应用研究报道。 本发明的目的在于研制一类结构相对简单、易于合成，具有亚细胞区域靶向性、 长波长、双波长比率法C^+荧光探针。

发明内容
本发明的目的是为了提供一类亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率法 C^+荧光探针及其合成方法，解决现有钙荧光探针需要在紫外区激发，难以采用 双波长比率法进行测定，不具有靶向性而无法用于亚细胞水平C^+的测定等问 题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的
本发明的一类亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率法C^+荧光探针，其 特征在于这类探针具有以下结构通式
式中Rp R2， R3， R4 =氢原子、烷基直链或支链、烷氧基直链或支链、
磺酸基、酯基；Rt， R2， R3， R4可以相同或不同；R5=垸基直链或支链、末端 含羟基或氨基或磺酸基的烷基直链或支链；Y = C(CH3)2， O， S。
本发明的一类亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率法C^+荧光探针的合
成路线如下
5<formula>formula see original document page 6</formula>
(1) <formula>formula see original document page 6</formula>
(2) <formula>formula see original document page 6</formula>
本发明的一类亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率法C^+荧光探针的 合成方法，其具体步骤如下
第一步、室温下将分析纯的iV，7V-二甲基甲酰胺与1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-iV，iV,AT ，7V7-四乙酸乙酯(1 ，2-bis-(2誦aminophenoxy)ethane-7V，A^V5 ,V- tetraethyl ester ， 简称BAPTAtetmethylester)混合，搅拌至溶解，然后冷却到-2。C，向其中滴加三 氯氧磷(POCl3)，然后室温搅拌20 50h。反应结束后，在搅拌下将该反应混合 物倾入是其质量3~15倍的0'C去离子水中，即有沉淀析出，用浓度为1% 8% KOH溶液调节该悬浮液至中性，抽滤，将所得粗产品重新溶解于是其质量25~50 倍的乙酸乙酯中，并用乙酸乙酯体积的1/3~1倍的去离子水和饱和NaCl溶液分 别洗2次。将有机相干燥，过滤，旋转蒸发仪减压蒸发至无液体滴出得棕色油 状物，柱层析分离得纯产物5,5，-二醛基-BAPTA-四乙酯(5，5，-dicarboxo-BAPTA tetraethyl ester )。
其中，三氯氧磷与1，2-双(2-氨基苯氧萄乙垸-AyV,7VW-四乙酸乙酯的摩尔 比为3~8:1， AW-二甲基甲酰胺与三氯氧磷的体积比是5 20:1。
第二步、将第一步制得的5,5，-二醛基-BAPTA-四乙酯(5,5，-dicarboxo-BAPTA tetraethyl ester)悬浮于0.5 2 mol'L" NaOH水溶液中，加热回流40 100 min得清亮淡黄色溶液即5,5'-醛基-BAPTA的钠盐。将所得5，5'-醛基-BAPTA的钠盐溶 液冷却至0'C，搅拌下滴加浓HCl酸化至pH: 1~2，伴随沉淀析出，将析出沉 淀抽滤，用10~100 mL冷水洗涤滤饼3次，立即室温真空干燥。得淡黄色粉未 状化合物5,5，-二醛基-BAPTA (5，5，-dicarboxo-BAPTA)。
其中，NaOH与5,5，-醛基-BAPTA-四乙酯的摩尔比为6 40:1。 第三步、将含活性甲基底物与有机溶剂混合，搅拌至溶解。然后在搅拌下 向其中加入第二步制得的5,5，-二醛基-BAPTA (5,5，-dicarboxo-BAPTA)和分析 纯的三乙胺。上述混合物在氮气保护，在温度25 。C 12(TC下反应0.5h 24h， 用旋转蒸发仪旋转蒸发至无液体滴出，冷却后析出固体，所得固体用纯净水溶 解，然后降温至-5 -15'C，用浓盐酸酸化析出沉淀，过滤得目标产物。
'其中，含活性甲基底物与5，5，-醛基-BAPTA的摩尔比为2 6:1，有机溶剂的用 量使得含活性甲基底物的浓度在10 150mmol/L,三乙胺与有机溶剂的体积比为 1: 10~1: 50。
其中，所使用的有机溶剂是无水甲醇、乙醇、正丁醇、乙二醇或甲醚中的 任意一种或任意比例混合。含活性甲基底物的结构特征是2-甲基苯并吲哚的鐵 盐、2-甲基苯并噁唑的鐺盐和2-甲基苯并噻唑的鑰盐中的任意一种。
本发明的有益效果是
(1) 上述<^2+荧光探针可与乙酸溴乙酯反应得到它的羧酸甲酯型(acetoxy methyl， AM)，与细胞孵育10 min~40 min后就可无损伤性的导入心肌细胞、Hela 细胞、K562细胞、B12细胞、角质层细胞和生长激素细胞等各类细胞，从而实 现对细胞的标记。
(2) 上述(^2+荧光探针进入细胞后，可靶向性的到达特定亚细胞区域，或 可多靶向性的到达几个亚细胞区域并使各细胞区域界限边缘清晰可见。
(3) 上述Ca^荧光探针的激发峰位于400 nm~550 nm，发射峰位于580 nm 700nm之间，它是一种长波长荧光探针，因此可采用可见光激发。上述Ca2+ 荧光探针与(^2+结合前后其荧光激发峰和发射峰均表现出10 nm 150 nm的位 移，而且荧光强度有较大变化，因此可采用双波长比率法进行测定。
(4) 上述C,荧光探针与C^+结合的离解常数在微摩尔到毫摩尔之间，表 现出它们和<^2+间存在适宜的亲和力，因此既可检测低浓度的Ca2+，又能对Ca2+ 浓度的微量变化做出灵敏响应，所以它可用于静息态或激活态时胞内C^+浓度、时空分布变化的实时监测。


图1是在生理pH及离子强度下，目标产物及其与不同浓度C^+结合的紫外 吸收光谱；
图2是在生理pH及离子强度下，目标产物及其与不同浓度(^2+结合的荧光 激发光谱；
图3是在生理pH及离子强度下，目标产物及其与不同浓度<^2+结合的荧光 发射光谱；
图4是心肌细胞(左)及K562细胞(右)的荧光标记图。
具体实施例方式
实施例l
(1)称取29.42 g (50 mmol) 1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-A^V,AT,-四乙酸乙 酯置于250 mL锥瓶中，加150 mL干燥的二甲基甲酰胺，搅拌使1,2-双(2-氨基 苯氧基)乙垸-iV，iV，AP,AP-四乙酸乙酯溶解。冷却到-2 。C，滴加P0C13 18.14 mL(200 mmol)，需2h，然后室温搅拌约40h。反应结束后，在搅拌下将该反应混合物 倾入500mL(TC的去离子水中，即有沉淀析出，用5% KOH溶液调节该悬浮液 至中性，抽滤，将所得粗产品重新溶解于乙酸乙酯中，并用去离子水和饱和NaCl 溶液分别洗2次。有机相用无水Na2S04干燥，过滤，旋转蒸发仪减压蒸出乙酸 乙酯得棕色油状物，柱层析分离得纯产物5,5，-二醛基-BAPTA-四乙酯。该步流 程反应式如下
N(CH2COOC2H5)2 N(CH2COOC2H5)2 N(CH2COOC2H5)2 N(CH2COOC2H5)2
^~^^"tT^I POCI3/DMF ~~Q P"Tf^S
、^ 、<^ ■^" v^
CHO CHO
(2)将5,5，-二醛基-BAPTA-四乙酯3.5 g (5.4 mmol)悬浮于50 mL 1 mol'L" NaOH水溶液中，回流lh得清亮淡黄色溶液，表明5，5，-二醛基-BAPTA-四乙酯 全部水解转化成5，5'-二醛基-BAPTA的钠盐。将所得钠盐溶液在室温稍加冷却 后，置于浮有碎冰的冰水浴中冷却至0 °C，并在冷却和搅拌下缓慢向其中滴加 浓HC1酸化，此时有沉淀析出，继续加酸酸化至pH-l，使5,5'-二醛基-BAPTA的钠盐全部转化为其相应的游离酸型自溶液中沉淀析出。抽滤，冷水洗涤滤饼3
次，立即室温真空干燥。得淡黄色粉未状目标产物5，5，-二醛基-BAPTA。该步流
程反应式如下<formula>formula see original document page 9</formula>
(3)称取化合物2-甲基-7V-乙基苯并噻唑碘盐1.351 g (4.4 mmol)于100 mL
装有回流冷凝管和搅拌器的园底烧瓶中，加入70 mL无水乙醇使其溶解。然后 在搅拌下向其中加入1.064 g (2 mmol)化合物5,5，-二醛基-BAPTA和4.5 mL干燥 的(EthN。反应混合物在氮气保护、温度25 'C下反应24h，用旋转蒸发仪旋转 蒸发至无液体滴出，冷却后析出固体，所得固体用纯净水溶解，然后在冰盐浴 冷却至-5'C，用浓盐酸酸化析出沉淀，过滤得红色目标产物。该步流程反应式如 下
<formula>formula see original document page 9</formula>
实施例2
(1)称取14.71 g (25 mmol) 1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-^^ -四乙酸乙 酯置于250 mL锥瓶中，加150 mL干燥的二甲基甲酰胺，搅拌使1，2-双(2-氨基 苯氧基)乙垸-iV^，A^四乙酸乙酯溶解。冷却到-2 。C，滴加POCl3 18.14mL(200 mmol)，需2h，然后室温搅拌约40h。反应结束后，在搅拌下将该反应混合物 倾入500mL(TC的去离子水中，即有沉淀析出，用5% KOH溶液调节该悬浮液 至中性，抽滤，将所得粗产品重新溶解于乙酸乙酯中，并用去离子水和饱和NaCl 溶液分别洗2次。有机相用无水Na2S04干燥，过滤，旋转蒸发仪减压蒸出乙酸乙酯得棕色油状物，柱层析分离得纯产物5,5，-二醛基-BAPTA-四乙酯。该步流 程反应式如下-
<formula>formula see original document page 10</formula>(2)将5,5，-二醛基-BAPTA-四乙酯1.75 g (2.7 mmol)悬浮于50 mL 1 mol'L NaOH水溶液中，回流lh得清亮淡黄色溶液，表明5,5，-二醛基-BAPTA-四乙酯 全部水解转化成5,5'-二醛基-BAPTA的钠盐。将所得钠盐溶液在室温稍加冷却 后，置于浮有碎冰的冰水浴中冷却至0 °C，并在冷却和搅拌下缓慢向其中滴加 浓HC1酸化，此时有沉淀析出，继续加酸酸化至pH:l，使5,5'-二醛基-BAPTA 的钠盐全部转化为其相应的游离酸型自溶液中沉淀析出。抽滤，冷水洗涤滤饼3 次，立即室温真空干燥。得淡黄色粉未状目标产物5，5'-二醛基-BAPTA 。该步 流程反应式如下
<formula>formula see original document page 10</formula>(3)称取化合物2-甲基-iV-乙基苯并噻唑碘盐1.351 g (4.4 mmol)于100 mL 装有回流冷凝管和搅拌器的园底烧瓶中，加入70 mL无水乙醇使其溶解。然后 在搅拌下向其中加入0.532 g (1 mmol)化合物5,5，-二醛基-BAPTA和4.5 mL干燥 的(E"N。反应混合物在氮气保护、温度80 "C下反应12h，用旋转蒸发仪旋转 蒸发至无液体滴出，冷却后析出固体，所得固体用纯净水溶解，然后在冰盐浴 冷却至-l(TC，用浓盐酸酸化析出沉淀，过滤得红色目标产物。该步流程反应式 如下<formula>formula see original document page 11</formula>实施例3
(1)称取11.77 g (20 mmol) 1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-^^ -四乙酸乙 酯置于250mL锥瓶中，加70mL干燥的二甲基甲酰胺，搅拌使1,2-双(2-氨基苯 氧基)乙烷-AgV,AT，AT-四乙酸乙酯溶解。冷却到-2。C，滴加P0C13 9.07 mL (100 mmol)，需2h，然后室温搅拌40h。反应结束后，在搅拌下将该反应混合物倾 入250mL(TC去离子水中，即有沉淀析出，用5。％ KOH溶液调节该悬浮液至中 性，抽滤，将所得粗产品重新溶解于乙酸乙酯中，并用去离子水和饱和NaCl溶 液分别洗2次。有机相用无水Na2S04干燥，过滤，旋转蒸发仪减压蒸出乙酸乙 酯得棕色油状物，柱层析分离得纯产物5，5，-二醛基-BAPTA-四乙酯。该步流程 反应式如下
<formula>formula see original document page 11</formula>(2)将5，5，-二醛基-BAPTA-四乙酯3.5 g (5.4 mmol)悬浮于35 mL 1 mol'L-1 NaOH水溶液中，回流lh得清亮淡黄色溶液，表明5，5，-二醛基-BAPTA-四乙酯 全部水解转化成5,5'-二醛基-BAPTA的钠盐。将所得钠盐溶液在室温稍加冷却 后，置于浮有碎冰的冰水浴中冷却至0'C，并在冷却和搅拌下向其中滴加浓HC1 酸化，此时有沉淀析出，继续加酸酸化至pH-l，使5，5'-二醛基-BAPTA的钠 盐全部转化为其相应的游离酸型自溶液中沉淀析出。抽滤，冷水洗涤滤饼3次，立即室温真空干燥。得淡黄色粉未状目标产物5，5，-二醛基-BAPTA。该步流程反
应式如下
P(CH2COOC2H5)2 y(CH2COOC2H5)2
CHO
N(CH2COOH):
(3)称取化合物2-甲基-7V-乙基苯并噻唑碘盐2.702 g (8.8 mmol)于100 mL 装有回流冷凝管和搅拌器的园底烧瓶中，加入70 mL无水乙醇使其溶解。然后 在搅拌下向其中加入1.596 g (3 mmol)化合物5,5'-二醛基-BAPTA和4.5 mL干燥 的(Et)3N。反应混合物在氮气保护、温度120 。C下反应4h，用旋转蒸发仪旋转 蒸发至无液体滴出，冷却后析出固体，所得固体用纯净水溶解，然后在冰盐浴 冷却至-15"C用浓盐酸酸化析出沉淀，过滤得红色目标产物。该步流程反应式如 下
N(CH2COOH)2
、 S
CHO
CHO
N、
("N(CH2CH3)3, CH3CH2OH
(2) H30+
N(CH2COOH):
N(CH2COOH)
2
、
STDBT
中间体及目标产物的结构表征如下
5,5，-二醛基-BAPTA-四乙酯
ifi-NMR (400固z， CDC13) S (*1(T6): 9.80(s， 2H), 7.40-6.76(m, 6H)， 4.31(s, 4H)， 4.22(s， 8H), 4.08-4.03(m， 8H)， 1.13(t， /= 8.0 Hz, 12H).
5，5，-二醛基-BAPTA: m.p.: 112.3 114.2 °C。 ^-NMR (400 MHz, DMSO-4) S (*10-6): 12.62(s, 4H), 9.73(s, 2H)， 7.42(d， /= 8.0 Hz, 2H)， 7.369(s， 2H), 6.69(d, /= 8.0 Hz， 2H), 4.38-4.25(m, 4H), 4.14-4.01(m， 8H). 12目标产物
^-NMR (400 MHz, DMSO誦4) 5 (*10陽6): 12.82(s， 4H), 8.40(d, J= 8.0 Hz, 2H), 8.23(d， J= 8.0 Hz, 2H), 8.15(d, /= 16.0 Hz， 2H)， 7.89-7.82(m, 4H), 7.76-7.72(m, 4H)， 7.65(d， J= 8.0 Hz， 2H)， 6.71(d， /= 8.0 Hz， 2H)， 4.97(d， /= 8.0 Hz, 4H)， 4.44(s， 4H)， 4.26(s, 8H)， 1.46(t， / = 8.0 Hz, 6H). MALDI-TOF: [M+H]3+理论值 C44H45N4O10S23+ 853.3测得值853.6。
本专利中所合成的新型<^2+荧光探针的性能特征如下 (1)光谱性能
上述(^2+荧光探针的一个显著特征是与(^2+结合前后其吸收峰、荧光发射峰 及激发峰均表现出较大位移，如目标产物的最大吸收峰在结合C^+前后由506 nm蓝移至404nm，荧光最大激发波长由546 nm蓝移至405 nm;荧光最大发射 峰由600nm蓝移至580nm，因此可用双波长比率法进行Ca"浓度测定，其测定 结果不受探针绝对浓度、光程长度或仪器的绝对灵敏度等测量条件变化的影响， 与单波长法相比所得结果更为准确可靠。
上述Ca"荧光探针的激发和发射波长均在400 nm到600 nm之间，因此可用 可见光进行激发，从而避免了由紫外光激发引起的细胞或生物体系自身荧光的 干扰和对细胞的光损伤。
上述<^2+荧光探针具有适宜的离解常数(如目标产物的离解常数&= 1.32 mM),因此可用于静息态或激活态时胞内(^2+浓度和时空分布变化的实时监测。
在生理pH及离子强度下，目标产物及其与不同浓度C^+结合的紫外吸收光 谱(Cstdbt= 10 |iM， 1~0; 2—0.1 mM; 3~0.2 mM; 4—1.2mM; 5—1.6mM; 6—2.0 mM; 7—5.0mM; 8—10.0mM; 9—25.0 mM; 10—50.0 mM; 11—100.0 mM)，参见图1。
在生理pH及离子强度下，目标产物及其与不同浓度C^+结合的荧光激发光 谱(CSTDBT= 1 ^M， 1~0; 2""0.2mM; 3~0.4mM; 4~0.8 mM; 5—2.0 mM; 6—5.0 mM; 7—10.0 mM; 8—25.0 mM; 9—50.0 mM; 10—100.0mM;发射波 长？iem-600nm)，参见图2。
在生理pH及离子强度下，目标产物及其与不同浓度C^+结合的荧光发射光 谱(CSTDBT= 1 (xM， 1—0; 2—0.2mM; 3~0.4mM; 4—0.8 mM; 5—2.0mM; 6—5.0mM; 7—10.0 mM; 8—25.0 mM; 9—50.0 mM; 10—100.0mM;激发波长Xex^407nm)，参见图3。
根据以上特点可得出，本发明专利中设计、合成的(^2+荧光探针的激发、发 射波长均位于长波长区域，而且探针与C^+结合前后其荧光激发、发射峰均表 现出一定的位移，所以可采用于波长比率法或强度比率法测定(^2+浓度。 (2)标记性能
上述以BAPTA为母体的C^+荧光探针含有羧酸基团，其可以被酯化，从而 得到能靠渗透扩散进入细胞的探针的羧酸甲酯(acetoxy methyl， AM)型，它进 入细胞后在酯酶的水解下可恢复成能与Ca^进行高选择性结合的游离酸型。将 上述探针如目标产物的AM型与不同种类的细胞孵育后，用激光共聚焦观察， 发现探针进入细胞后，能同时标记胞质、胞核，且界限边缘清晰，表明该探针 是一核、质双靶向性C^+荧光探针，该探针可实现胞质、胞核区域(^2+时空变 化的同时实时监测，进而为胞质和胞核C^+调节机理研究提供有效的方法学基 础。
将Ca^荧光探针-AM以二甲亚砜配制成1.0 mmol/L IG备液。向细胞悬液1
mL中加入10 指示剂，于室温孵育10 40 min，离心后吸出上层清夜，以Hanks (或D—Hanks)液冲洗3次，加入0.2 mL Hanks (或D—Hanks)液后用于细
胞荧光图像观察。
心肌细胞(左)及K562细胞(右)的荧光标记图如下，参见图4。 本专利中合成的<^2+探针在研究亚细胞器内Ca^调节机理中的应用 利用新型C^+荧光探针目标产物-AM的双靶向性，结合激光共聚焦技术研
究了 K562细胞胞核[Ca^]n和胞质[CaU勺调节机制。结果表明在K562细胞中
胞核C^+和胞质(^2+在行使其信使作用时具有相对独立性。
权利要求
1、亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率法Ca2+荧光探针，其特征在于这类探针具有以下结构通式式中R1，R2，R3，R4＝氢原子，烷基直链或支链，烷氧基直链或支链，磺酸基，酯基；R1，R2，R3，R4可以相同或不同；R5＝烷基直链或支链，末端含羟基或氨基或磺酸基的烷基直链或支链；Y＝C(CH3)2，O，S。
2、亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率<^2+荧光探针的合成方法，其 特征在于具体步骤如下第一步、室温下将分析纯的AW-二甲基甲酰胺与1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-AyV，AP,AP-四乙酸乙酯混合，搅拌至溶解，然后冷却到-2'C，向其中滴加三氯氧 磷，然后室温搅拌20 50 h;反应结束后，在搅拌下将该反应混合物倾入是其质 量3 15倍的0"C去离子水中，即有沉淀析出，用浓度为P/。 8y。KOH溶液调节 该悬浮液至中性，抽滤，将所得粗产品重新溶解于是其质量25 50倍的乙酸乙 酯中，并用乙酸乙酯体积的1/3~1倍的去离子水和饱和NaCl溶液分别洗2次； 将有机相干燥，过滤，旋转蒸发仪减压蒸发至无液体滴出得棕色油状物，柱层 析分离得纯产物5，5，-二醛基-BAPTA-四乙酯；第二步、将第一步制得的5,5，-二醛基-BAPTA-四乙酯悬浮于0.5 2 mol'L" NaOH水溶液中，加热回流40 100 min得清亮淡黄色溶液即5，5'-醛基-BAPTA 的钠盐；将所得5，5'-醛基-BAPTA的钠盐溶液冷却至0 °C，搅拌下滴加浓HC1 酸化至pH-l 2，伴随沉淀析出，将析出沉淀抽滤，用10 100mL冷水洗涤滤 饼3次，立即室温真空干燥，得淡黄色粉未状化合物5,5'-二醛基-BAPTA;第三步、将含活性甲基底物与有机溶剂混合，搅拌至溶解；然后在搅拌下 向其中加入第二步制得的5，5，-二醛基-BAPTA和分析纯的三乙胺；上述混合物 在氮气保护，在温度25 °C 120 "C下反应0.5 h 24 h，用旋转蒸发仪旋转蒸发至 无液体滴出，冷却后析出固体，所得固体用纯净水溶解，然后降温至-5 15。C，用浓盐酸酸化析出沉淀，过滤得目标产物。
3、 如权利要求2所述的亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率<^2+荧光探针的合成方法，其特征在于第一步中三氯氧磷与1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-iV，A^^,-四乙酸乙酯的摩尔比为3 8: 1， 7V,7V-二甲基甲酰胺与三氯氧磷的体积 比是5 20: 1。
4、 如权利要求2所述的亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率<^2+荧光 探针的合成方法，其特征在于第二步中NaOH与5，5，-醛基-BAPTA-四乙酯的 摩尔比为6 40:1。
5、 如权利要求2所述的亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率Ca^荧光 探针的合成方法，其特征在于第三步中含活性甲基底物的结构特征是2-甲基 苯并吲哚的鎗盐、2-甲基苯并噁唑的錄盐和2-甲基苯并噻唑的総盐中的任意一 种；所使用的有机溶剂是无水甲醇、乙醇、正丁醇、乙二醇或甲醚中的任意一 种或任意比例混合。
6、 如权利要求2所述的亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率(^2+荧光 探针的合成方法，其特征在于第三步中含活性甲基底物与5,5，-醛基-BAPTA 的摩尔比为2 6:1，有机溶剂的用量使得含活性甲基底物的浓度在10~150 mmol/L，三乙胺与有机溶剂的体积比为h 10 1: 50。
全文摘要
本发明涉及一类亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率法Ca²⁺荧光探针的设计与合成，属于生物化学传感研究领域。该类探针的合成是以1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸乙酯为起始原料，首先合成了具有两个醛基活性基团的Ca²⁺受体(5，5’-dicarboxo-BAPTA)作为Ca²⁺荧光探针的关键中间体。然后在适宜的有机溶剂中与含活性甲基的底物进行缩合得到一系列可见光激发的Ca²⁺荧光探针，该类探针与Ca²⁺结合前后荧光激发及发射峰强度及位置均有变化，即可用双波长比率法对Ca²⁺进行测定。该类荧光探针进入细胞后，可对特定亚细胞区域进行靶向性标记。应用该类探针可在亚细胞水平实现胞内Ca²⁺含量、时空分布变化情况的实时动态检测，从而为细胞钙信号转导研究提供有效的手段。
文档编号G01N33/52GK101620225SQ20081019296
公开日2010年1月6日 申请日期2008年12月31日 优先权日2008年12月31日
发明者张小玲, 朱宝存, 贾宏瑛 申请人:北京理工大学