专利名称：一种同时分析氨基酸和有机酸代谢物谱的方法
技术领域：
本发明涉及色谱分析技术，特别提供了一种通过毛细管电泳一质谱联用法 同时分析生物样品中氨基酸和有机酸代谢物谱的方法。
背景技术：
氨基酸和有机酸是代谢组学研究中重要的代谢物，与糖、脂、蛋白质和核 酸的代谢密切相关，研究表明人体内氨基酸和有机酸的浓度变化与多种疾病有 密切关系。现有检测氨基酸的方法主要是以离子交换色谱、高效液相色谱、气 相色谱、毛细管电泳等为分离手段，以紫外或荧光检测器为检测方法，由于氨 基酸和有机酸大都紫外吸收较弱或无紫外吸收，不易气化，因此用前述四种方 法时均需要衍生化步骤，操作繁琐，分析时间长或灵敏度低，难以同时检测常 见的几十种氨基酸和有机酸。
发明内容
本发明针对上述技术存在的不足，提供一种尿液中同时分析氨基酸和有机 酸代谢物谱的方法。本发明方法是将生物样本经常规沉蛋白处理后，采用毛细 管电泳为分离手段，检测器选择通用性强、灵敏度高的质谱检测器。本发明通 过以下步骤实现
(1) 样品预处理
取样品(尿液)200 pL，加入20 内标液及400 甲醇，于旋涡混合 器上混合5 min， 12000 r/min离心10min，移取500 上清液，于离心浓縮仪 离心浓縮至干，残渣加入200 |iL水溶解后，12000 r/min离心10min取上清液 进样分析(用于标准曲线试验的标准品溶液处理方式同样品)。
标准品和内标溶液制备分别取各氨基酸、有机酸标准品适量，精密称定，
用水或含一定浓度氨水的水溶液溶解。作为标准品储备溶液。低浓度的标准品 溶液通过用适量水稀释储备溶液得到。取适量盐酸巴马汀标准品，精密称定， 用水溶解，作为内标储备液。
(2) 毛细管电泳一质谱联用法测定
A.毛细管电泳条件缓冲液含有3.0-6.0%甲酸和2.5-15%甲醇，分离 电压为15-18kV，分离温度为25。C，程序进样50mbar压力下进14。/。的浓氨水(v/v) 0-3秒后，再于50mbar压力下进样品溶液40秒，
B.质谱条件SIM模式检测，鞘液为含80-90%甲醇和0.05%甲酸的溶 液，流速为3 ^iL/min，雾化气压力为2 - 4 psig，干燥气流速和温度分别为7 - 8 L/min和250-275°C，毛细管电压为4500V，各氨基酸、有机酸及内标碎片电 压均为10-70V。
本发明是一种不需要衍生化步骤，操作简单，灵敏度高，选择性好，普适 性强的能够同时测定生物样品中22种氨基酸和5种有机酸的分析方法。本发 明的方法具有良好的精密度(日内4.96-14.93%，日间6.22-14.03%)和回 收率(高浓度83.62-111.41°/。，中浓度81.73-105.50%，低浓度80.17-110.94%), 检测限为0.80- 2562 ng/mL。
图1是22种氨基酸和5种有机酸标准品混合溶液的总离子流色谱图 (TIC)。
图2是22种氨基酸和5种有机酸标准品混合溶液的选择离子色谱图。 图3是正常人尿液中氨基酸和有机酸代谢物谱分析的总离子流色谱图 (TIC)。
图4是正常人尿液中氨基酸和有机酸代谢物谱分析的选择离子色谱图。 图5是乳腺癌病人尿液中氨基酸和有机酸代谢物谱分析的总离子流色谱图 (TIC)。
图6是乳腺癌病人尿液中氨基酸和有机酸代谢物谱分析的选择离子色谱图。
具体实施例方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的描述。 实施例1
样品预处理取混合标准品溶液200 iliL，加入400iliL甲醇，于涡旋混合 器上混合2min， 12000 r/min离心10min，移取500 上清液，于离心浓縮仪 离心浓縮至干，残渣加入200 fxL水充分溶解后，12000 r/min离心10min取上
清液进样分析。
标准品和内标溶液制备分别取各氨基酸、有机酸标准品约1.0-8.0mg， 精密称定，用水或含一定1%浓度氨水的水溶液溶解，制成浓度分别为1.0 - 8.0 mg/mL的标准品储备溶液。临用前，用水稀释成一系列浓度的标准品溶液。取 盐酸巴马汀标准品约1.0 mg，精密称定，用水溶解，制成浓度为0.01 mg/mL的内标溶液。
毛细管电泳条件缓冲液含有6.0°/。甲酸和6%甲醇，分离电压为15kV， 分离温度为25i:。进样50mbar压力下进样品溶液40s。
质谱条件SIM模式检测，m/z值见表l;鞘液为含80%甲醇和0.05%甲 酸的溶液，流速为3pL/min;雾化气压力为4psig;干燥气流速和温度分别为 7 L/mki和275 °C;毛细管电压为4500V;各氨基酸、有机酸及内标碎片电压 均为10。
表lSIM离子的m/z及其对应的代谢物名称
离子质荷比 物质名称离子质荷比物质名称
76甘氨酸135苹果酸
90P-丙氨酸、丙氨酸147赖氨酸、谷氨酰胺
104卩-氨基异丁酸148谷氨酸
1053-羟基丁酸150甲硫氨酸
106丝氨酸156组氨酸
116辅氨酸166苯丙氨酸
118缬氨酸175精氨酸
119琥珀酸182酪氨酸
120苏氨酸193柠檬酸
122半胱氨酸205色氨酸
132肌酸、亮氨酸、异亮氨酸241胱氨酸
133鸟氨酸352盐酸巴马汀(内标)
134天冬氨酸
应用毛细管电泳一质谱法对22个氨基酸和5个有机酸进行分析，分析结
果参见附图1和图2。图2中1:甘氨酸，2: |3-丙氨酸，3:丙氨酸，4: p-氨基异丁酸，5: 3-羟基丁酸，6:丝氨酸，7:辅氨酸，8:缬氨酸，9:琥珀 酸，10:苏氨酸，11:半胱氨酸，12:肌酸，13:亮氨酸，14:鸟氨酸，15: 天冬氨酸，16:苹果酸，17:赖氨酸，18:谷氨酰胺，19:谷氨酸，20:甲硫 氨酸，21:组氨酸，22:苯丙氨酸，23:精氨酸，24:酪氨酸，25:柠檬酸， 26:色氨酸，27:胱氨酸。
实施例2
样品预处理取正常人尿液200 L，加入400 L甲醇，于涡旋混合器上混 合2 min， 12000 r/min离心10min，移取500 L上清液，于离心浓缩仪离心浓 縮至干，残渣加入200L水充分溶解后，12000 r/min离心10min取上清液进样 分析。
5毛细管电泳条件缓冲液含有4.0%甲酸和15%甲醇，分离电压为15kV， 分离温度为25。C。进样50mbar压力下进样品溶液40s。 质谱条件同实施例l。
应用毛细管电泳一质谱法对正常人尿液中氨基酸和有机酸进行分析，结果 参见附图3和图4。图4中1:甘氨酸，2: P-丙氨酸，3:丙氨酸，4: P-氨基异丁酸，5: 3-羟基丁酸，6:丝氨酸，7:辅氨酸，8:缬氨酸，9:琥珀 酸，10:苏氨酸，11:半胱氨酸，12:肌酸，13:亮氨酸，14:鸟氨酸，15: 天冬氨酸，17:赖氨酸，18:谷氨酰胺，19:谷氨酸，20:甲硫氨酸，21: 组氨酸，22:苯丙氨酸，23:精氨酸，24:酪氨酸，25:柠檬酸，26:色氨酸， 27:胱氨酸
实施例3
样品预处理取乳腺癌病人尿液200 L，加入400 L甲醇，于涡旋混 合器上混合5min， 12000 r/min离心10min，移取500 L上清液，于离心浓 縮仪离心浓缩至干，残渣加入200 L水充分溶解后，12000 r/min离心10min
取上清液进样分析。
毛细管电泳条件缓冲液含有4.0°/。甲酸和2.5%甲醇，分离电压为18kV, 分离温度为25"C。进样50 mbar压力下进14°/。的浓氨水(v/v) 3 s后，再于 50 mbar压力下进样品溶液40 s。
质谱条件SIM模式检测，m/z值如表1所示；鞘液为含80%甲醇和0.05% 甲酸的溶液，流速为3 L/min;雾化气压力为2psig;干燥气流速和温度分别 为8L/min和250 °C;毛细管电压为4500V;各氨基酸、有机酸及内标碎片电 压均为70。
应用毛细管电泳 一 质谱法对乳腺癌病人尿液中氨基酸和有机酸进行测定，
结果见附图5和图6。图6中1:甘氨酸，2: |3-丙氨酸，3:丙氨酸，4:卩-氨基异丁酸，5: 3-羟基丁酸，6:丝氨酸，7:辅氨酸，8:缬氨酸，9:琥珀 酸，10:苏氨酸，11:半胱氨酸，12:肌酸，13:亮氨酸，15:天冬氨酸，16: 苹果酸，17:赖氨酸，18:谷氨酰胺，19:谷氨酸，20:甲硫氨酸，21:组氨 酸，22:苯丙氨酸，23:精氨酸，24:酪氨酸，25:柠檬酸，26:色氨酸，27: 胱氨酸。
权利要求
1. 一种尿液中同时分析氨基酸和有机酸代谢物谱的方法，其特征在于通过以下步骤实现(1)样品预处理取样品200μL，加入20μL内标液及400μL甲醇，于旋涡混合器上混合5分钟，高速离心10分钟，移取500μL上清液，于离心浓缩仪离心浓缩至干，残渣加入200μL水溶解后，高速离心10分钟取上清液进样分析；(2)毛细管电泳—质谱联用法测定A. 毛细管电泳条件缓冲液含有3.0-6.0％甲酸和2.5-15％甲醇，分离电压为15-18kV，分离温度为25℃，程序进样50mbar压力下进体积百分含量为14％的浓氨水0-3秒后，再于50mbar压力下进样品溶液40秒，B. 质谱条件SIM模式检测，鞘液为含80-90％甲醇和0.05％甲酸的溶液，流速为3μL/min，雾化气压力为2-4psig，干燥气流速和温度分别为7-8L/min和250-275℃，毛细管电压为4500V，氨基酸、有机酸及内标碎片电压均为10-70V。
2. 根据权利要求1所述的一种同时分析尿液中氨基酸和有机酸代谢物谱 的方法，其特征在于步骤(1)所用内标液的制备是取盐酸巴马汀标准品， 用水溶解，作为内标液。
3. 根据权利要求1所述的一种同时分析尿液中氨基酸和有机酸代谢物谱 的方法，其特征在于步骤(2) B中所述的是22种氨基酸和5种有机酸，分别是甘氨酸、丝氨酸、辅氨酸、缬氨酸、琥珀酸、苏氨酸、半胱氨酸、苹果酸、谷氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、柠檬酸、色氨酸、卩-丙氨酸、丙氨酸、卩-氨基异丁酸、3-羟基丁酸、赖氨酸、谷氨酰胺、肌酸、亮氨酸、异亮氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、盐酸巴马汀。
全文摘要
本发明提供一种尿液中同时分析氨基酸和有机酸代谢物谱的方法，是将生物样本经常规沉蛋白处理后，采用毛细管电泳为分离手段，检测器选择通用性强、灵敏度高的质谱检测器。本发明方法具有良好的精密度和回收率，是一种不需要衍生化步骤，操作简单，灵敏度高，选择性好，普适性强的能够同时测定生物样品中22种氨基酸和5种有机酸的分析方法。
文档编号G01N33/48GK101430307SQ20081016316
公开日2009年5月13日 申请日期2008年12月18日 优先权日2008年12月18日
发明者刘昌孝, 朋 沈, 王书芳, 程翼宇, 青 邵 申请人:浙江大学