检测猪圆环病毒2型特异性抗体的合成肽偶联抗原及试剂的利记博彩app

专利名称：：检测猪圆环病毒2型特异性抗体的合成肽偶联抗原及试剂的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及动物检疫，尤其涉及一种猪圆环病毒2型的合成肽偶联抗原制备，以及基于合成肽偶联抗原的猪圆环病毒2型抗体检测方法和检测试剂。
背景技术：
：猪圆环病毒2型(PCV2)是新近发现的一种圆环病毒，可导致断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)。世界许多国家都有该病发生，近几年我国也有该病流行。PMWS主要侵害68周龄的仔猪，发病率一般为10%20%，病死率高达50%100%，并能造成免疫抑制降低抗病力，给养猪业带来了严重的经济损失。成年猪一般为隐性感染，不表现任何症状，但可以传染给仔猪。目前，针对该病尚未开发出商品化的疫苗，通过检疫排除感染猪是最有效的防控措施。因此，建立一种准确、快速检测PCV2感染的方法，是当前该病防控工作中急待解决的问题。猪圆环病毒包括两种血清型PCV1和PCV2。猪群中PCV1感染非常普遍(尤其是在我国)，感染率远超过PCV2，虽不引起发病，但会交叉干扰PCV2感染的检测。免疫学试验表明，PCV1病毒与PCV2病毒有明显的交叉反应。因此，检测PCV2感染的关键技术在于如何尽可能地排除PCV1的干扰。研究表明，PCV2基因组有两个主要阅读框0RF1和0RF2。0RF1编码与病毒复制有关的R印蛋白，0RF2编码的结构蛋白Cap蛋白是病毒的主要免疫原性物质，并含有型特异性的抗原表位，这些表位在Cap蛋白65位87位，113位139位和193位207位氨基酸区域内。因此，0RF2编码的C即蛋白最有希望用于PCV2抗体的特异性检测。但是，国内外研究表明，PCV1和PCV2的Cap蛋白的氨基酸序列同源性为62X，两者的部分抗原表位相同。此前，国内外运用基因工程技术获得的重组表达PCV2C印蛋白，可以检测出PCV2抗体，但未见重组PCV2Cap蛋白与PCVl抗体的交叉试验数据。实际应用表明，用这种表达蛋白作为抗原来检测PCV2抗体，其结果与猪群实际发病情况及病原学诊断结果往往出现较大差异，存在较多的假阳性结果。申请人研究发现，重组表达的PCV2Cap蛋白(包括截短的Cap蛋白及以此开发的试剂盒)，与PCV1抗体有明显的交叉反应，因此，检测结果会受到PCV1的干扰。这是由于重组表达的PCV2C即蛋白肽链较长(长度一般在30个氨基酸以上)，其中包含与PCV1相似的抗原表位。为了寻找更为特异的PCV2抗体检测方法，尽量排除普遍存在的PCV1抗体的交叉干扰，申请人针对我国流行的PCV2毒株的Cap蛋白氨基酸序列，采用人工合成肽技术，合成了多条备选的短肽(长度在20个氨基酸以下)，并与KLH血兰素蛋白偶联，制成大分子偶联抗原;采用PCV1和PCV2分别感染实验猪，制备了可靠的PCV1血清抗体和PCV2血清抗体；在此基础上，用ELISA方法筛选出型特异好、反应活性优良的合成肽偶联抗原PCV2-Mix;用PCV2-Mix抗原研制成检测PCV2抗体的ELISA试剂盒和免疫微球快速检测试剂。原有的重组表达PCV2Cap蛋白抗原及基于重组抗原的PCV2抗体检测试剂，存在以下技术缺陷1、重组表达的PCV2Cap蛋白抗原与PCVl抗体存在交叉反应，因此，用重组抗原检测PCV2抗体，会受到普遍存在的PCV1感染的影响，出现大量的假阳性结果；2、重组的PCV2Cap蛋白抗原含有表达系统的细胞等杂质成份，远不如合成肽抗原纯净，容易出现非特异性反应，需要用较高的提纯工艺来降低非特异反应。3、表达的重组PCV2Cap蛋白抗原，批次之间质量的稳定性受多种因素影响，不易控制，不如用仪器自动化生产的合成肽抗原的质量均一。因此，采用经筛选获得的人工合成短肽，制备合成肽偶联抗原，研制高度特异的PCV2抗体检测试剂，具有良好的应用前景。
发明内容本发明所解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能特异性地检测猪圆环病毒2型抗体的合成肽偶联抗原(命名为PCV2-Mix)以及使用该抗原制成的ELISA试剂盒和免疫微球快速检测试剂，其特异性优于常见的重组表达PCV2Cap蛋白抗原及其试剂盒。本发明提供的合成肽偶联抗原PCV2-Mix包含以下氨基酸序列或其截短序列的多肽，以及载体蛋白。SEQIDN0:1:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDN0:2:AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrSEQIDN0:3:AspArgGlyValGlySerThrAlaVallieLeuAspAspAsnpHepHeProLysAlaSerSEQIDN0:4:SerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeVal进一步地，载体蛋白优选KLH血兰素蛋白。本发明提供的检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒，其中包含合成肽偶联抗原PCV2-Mix包被的ELISA反应板，进一步地包括ELISA试剂盒常用的其他组分如样品稀释液、酶结合物、洗涤液、底物溶液和终止液。本发明提供的检测猪圆环病毒2型抗体的免疫微球快速检测试剂，其中包含合成肽偶联抗原PCV2-Mix和微球颗粒(可以是金属颗粒、塑胶微粒)，进一步包括免疫学试剂常用的其他组分如样品稀释液、纤维素膜等组分。本申请还提供一种制备猪圆环病毒2型合成肽偶联抗原PCV2-Mix的方法。本申请还涉及上述合成肽偶联抗原在制备检测猪圆环病毒2型感染的试剂盒中的应用。本申请还涉及上述合成肽偶联抗原在制备检测猪圆环病毒2型感染的免疫微球凝集试剂中的应用。本申请还涉及上述合成肽偶联抗原在制备检测猪圆环病毒2型感染的免疫微球快速检测试纸条中的应用。本发明是通过以下技术途径实现的一、所用材料和试剂1、兔抗猪酶标抗体辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgQ，购自Sigma公司；2、ELISA板96孔聚苯乙烯微量反应板，购自厦门怡新美公司；3、胶体金按《现代免疫学实验技术》第二版(湖北科学技术出版社，2002年1月)所述方法制备；4、塑胶微粒直径约l陶的聚苯乙烯胶乳微粒，见《现代免疫学实验技术》第二版。二、短肽合成参考国内外检测到的PCV-20RF2的基因序列，推导0RF2的氨基酸序列，并用计算机辅助分析其主要抗原表位，设计多肽的氨基酸序列。多肽采用FMOC固相合成法，参见《现代免疫学实验技术》第二版和《多肽的固相合成法研究进展》(安徽农业科学，2006年22期)，由多肽合成仪自动完成。其合成过程包括(1)氨基酸活化；(2)去F-nioc保护反应；(3)肽链合成反应；(4)纯化；(5)与固相载体分离；(6)冻干保存。三、制备偶联抗原采用戊二醛偶联法制备偶联抗原(参见《现代免疫学实验技术》第二版)。取载体蛋白和多肽，共同溶解在硼酸溶液中，加入戊二醛溶液混合后反应2h，再加甘氨酸溶液封闭未反应的戊二醛，然后用硼酸透析纯化。四、筛选偶联抗原用PCV1、PCV2标准毒株分别感染SPF试验猪，在感染后0、7、14、21、35、49天采集猪血清,作为评价用血清。将制备的所有偶联抗原，包被在ELISA板上，分别与PCV1、PCV2感染猪血清反应，用兔抗猪酶标抗体和TMB(四甲基联苯胺)底物进行检测，筛选出4个反应活性较好、能明确区分PCV1、PCV2感染的偶联抗原。将筛选出的偶联抗原按等体积混合，获得偶联抗原PCV2-Mix。五、制备ELISA试剂盒将偶联抗原PCV2-Mix包被ELISA板，并用兔抗猪酶标抗体作为第二抗体，经方阵试验优ELISA反应体系，建立了检测PCV-2抗体的间接ELISA方法。用该方法检测PCV-1和PCV-2人工感染猪，测定抗体消长曲线，结果表明，与基因工程表达的抗原介导的ELISA相比，该合成肽抗原ELISA方法能特异地检测PCV-2血清抗体，与PCV-1阳性血清无交叉反应，可用于两者的鉴别检测。将配制好的ELISA反应试剂，包括合成肽偶联抗原PCV2-Mix包被的ELISA反应板，以及ELISA试剂盒常用的其他组分样品稀释液、酶结合物、洗涤液、底物溶液和终止液按一定的规格分装、包装，加入说明书，组装成试剂盒。六、制备免疫微球快速检测试剂方法l制备免疫微球凝集试剂将PCV2-Mix包被到胶体金或塑胶微粒表面，在缓冲液中制成均匀的悬液。该悬液可以作为凝集抗原试剂，与被检血清混合后，通过观察悬液中是否产生凝集块，判定血清中是否存在PCV2抗体。该试剂可与PCV2阴性、阳性对照血清配套使用。方法2制备免疫微球快速检测试纸条制备结合物垫将PCV2-Mix包被到胶体金或塑胶微粒表面，在缓冲液中制成均匀的悬液，将标记好的胶体金结合物均匀地喷在条状的玻璃纤维膜上，冷冻干燥。喷制检测膜在同一块硝酸纤维膜上，用Bio-dotXYZ3000喷膜机将稀释好的兔抗猪IgG喷成检测线(T带)，在间隔210mm处，平行地喷上PCV2抗体作为质控线(C带)。放于温箱内干燥，取出后密封保存备用。组装试纸条将样品吸收垫(玻璃纤维膜)、结合物垫、喷有检测线(T带)和对照线(C带)的硝酸纤维素膜、吸收垫(吸水纸)依次粘贴在PVC底板(PVC等硬质薄板)上，用Bio-dot切割机将组装好的试纸切成36mrn宽的试纸条，装入有干燥剂的铝箔袋内，密封，室温保存。七、PCV2抗体检测方法方法lELISA检测方法取猪全血样品，按常规方法分离血清，在稀释板上稀释待检血清。分别在ELISA板相应孔中加入阳性对照血清、阴性对照血清、稀释好的待检猪血清。置2038。C孵育3060分钟；弃去各孔中液体，洗涤；每孔加入酶结合物液100uL，贴上封板膜，置2038t;孵育3060分钟；弃去各孔中液体，洗涤；每孔加入底物液A50100uL，再加入底物液B50100uL，置2038。C避光显色1015分钟；每孔加入终止液50100uL，用酶标仪测定各孔的吸光度值，根据吸光度值判定结果。方法2免疫微球凝集试验取猪全血样品，按常规方法分离血清。取凝集抗原一滴、被检血清一滴，充分混合后，在20分钟内观察悬液中是否产生凝集块。出现肉眼可见的凝集块，判定血清中存在PCV2抗体，说明猪被PCV2感染；否则，判定血清中不存在PCV2抗体，说明猪未被感染或在急性感染期。方法3快速检测试纸条取猪全血样品，按常规方法分离血清。取被检血清一滴，滴在试纸条的样品吸收垫上，在20分钟内观察纸条上是否同时出现检测线和对照线。同时出现检测线和对照线，判定血清中存在PCV2抗体，说明猪被PCV2感染；仅出现对照线，判定血清中不存在PCV2抗体，说明猪未被感染或在急性感染期；对照线未出现，判定试验失败，可能是试剂失效。下列实施方式仅用于举例说明本发明的目的，但不构成对本发明的限制。附图1试纸条组装方式示意图。具体实施方式实施例1备选短肽合成参考国内外检测到的PCV-20RF2的基因序列，推导0RF2的一级结构氨基酸序列，并用计算机辅助分析其主要抗原表位，设计一系列的多肽氨基酸序列。包括SEQIDNO:5SEQIDNO:26.SEQIDNO:5:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDNO:6:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnA印pHeValProProGlyGlyGlyThrSEQIDNO:7:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlySEQIDNO:8:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuSEQIDNO:9:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnSEQIDNO:10:AspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDNO:11:ArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDNO:12:lieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDNO:13:AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaSEQIDNO:14:AspArgGlyValGlySerThrAlaVallieLeuAspAspAsnpHepHeProLysAlaSEQIDNO:15:AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrSEQIDNO:16:AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnSEQIDNO:17:AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuSEQIDNO:18:ValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrSEQIDNO:19:SerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrSEQIDNO:20:lieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrSEQIDNO:21:ArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaSEQIDNO:22:GlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysSEQIDNO:23:ValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrSEQIDNO:24:GlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValSEQIDNO:25:SerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValSEQIDNO:26:GlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHe多肽采用F-moc固相合成法，由多肽合成仪自动完成，其合成过程如下1、氨基酸活化氨基酸与1-羟基苯并三唑(简称HOBT)合成氨基酸-HOBT酉旨。2、去保护反应用哌啶清洗氨基酸-OBTE酯数次，以除去F-moc保护基。用二氮己环(醒P)清洗，除去残余的哌啶。3、合成反应启动多肽合成仪自动合成程序，仪器自动加入活化的氨基酸与二异丙基碳二亚胶至反应器中，合成的过程是由C端开始至N端，依照上述序列不断地重复合成步骤。反应完成后，用醒P清洗，以除去残余的氨基酸。4、纯化加入2.5%乙酰咪唑，对未合成的肽链进行乙酰化处理，终止多余的肽链生成，并使肽链纯化。用NMP清洗，除去剩余的乙酰咪唑。按步骤2的方法，除去多肽氨基酸端的F-moc保护基。用隨P洗涤固相板，干燥备用。5、多肽与固相载体分离反应配制含90%三氟乙酸(TFA)、4%异硫氨酸丙酯、5%苯酚和1%去离子水的反应溶液。将干燥的肽一树脂放入玻璃烧杯内。将反应溶液缓慢加入烧杯内，匀速搅拌。将烧杯置O'C下反应10分钟，反应结束后取出，置室温下，使其逐渐恢复至室温(2025°C)。用分液漏斗将TFA/肽混合物从树脂中萃取出来。利用真空挥发技术将TFA及其余保护试剂分离除去。将所有成分移至漏斗内，用叔丁基甲醚及二乙醚洗涤肽，以除去保护剂及其它杂质。6、冻干及保存将多肽在真空干燥机中冷冻干燥3日，形成冻干品，-2(TC保存。用此方法，共合成22条短肽。实施例2偶联抗原制备采用戊二醛偶联法制备偶联抗原，具体方法如下-1、取载体蛋白10mg，以0.lmol/LpH10的硼酸溶液充分溶解，加入多肽15mg混匀；2、边振荡边加新鲜配制的0.3%(V/V)戊二酸溶液,室温作用2h，倒转试管数次；3、加lmol/L甘氨酸，以封闭未反应的戊二醛，继续反应30min;4、0.lmol/LpH8.5的硼酸透析过夜，换透析液，继续透析4h，-20。C保存备用。用此方法，将实施例1的22个多肽制备成22个偶联抗原备选。实施例3筛选和制备PCV2-Mix偶联抗原阳性血清制备取PCV抗原及抗体阴性的SPF试验猪10头，分成5头/组，各组分别隔离饲养。用PCV1、PCV2标准毒株分别感染一组猪(5头)，在感染后0、7、14、21、35、49天采集猪血清，作为评价抗原用的血清。用ELISA试验方法筛选抗原用PH9.6的碳酸盐缓冲液，将备选的偶联抗原稀释成5Pg/mL，分别包被ELISA板，25X:过夜反应。将不同时间采集的猪血清,用含2%BSA的PBST(0.02mol/L,PH7.2)稀释5倍，按每孔加入IOO化的量，分别加入到各种ELISA抗原板中，37。C反应60分钟。PBST洗板5次。用含2%BSA的PBST按1:10000稀释兔抗猪酶标抗体，每孔加入IOO叱,37°C反应60分钟。PBST洗板5次。每孔加入TMB底物IOOML，37。C显色反应15分钟。每孔加入50叱2mol/L^04终止反应。结果筛选出4个反应活性较好、能明确区分PCV1、PCV2感染的偶联抗原(PC1、PC9、PC10、PC21)。将筛选出的偶联抗原按等体积混合，获得偶联抗原PCV2-Mix。筛选出4个偶联抗原检测5头PCV1感染猪的血清，结果均为阴性；检测PCV2感染猪的血清结果见表l:表14个偶联抗原在感染后不同时间对PCV2抗体的检出比例<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>ProGlyGlyGlySerPC90/51/52/54/55/55/5AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrPC100/51/53/53/54/54/5AspArgGlyValGlySerThrAlaVallieLeuAspAspAsnpHepHeProLysAlaSerPC210/51/52/53/55/55/5SerSerAlsVallieLeuAspAspAsnpHeVal实施例4用偶联抗原PCV2-Mix制备ELISA试剂盒1、建立ELISA方法将偶联抗原PCV2-Mix包被微量反应板，并用兔抗猪酶标抗体作为第二抗体，经ELISA方阵试验，优选ELISA反应体系，建立了检测PCV_2抗体的间接ELISA方法。确定的ELISA反应体系如下PCV2-Mix抗原板制备方法用PH9.6的碳酸盐缓冲液，将PCV2-Mix抗原稀释成5Pg/mL，按lOO^L/孔的量包被ELISA板，在室温下(2030°C)过夜反应。用含2%BSA的PBST(0.02mol/L,PH7.2)在室温下(2030°C)过夜封闭。弃去ELISA板中的封闭液，PBST洗涤一次，室温下充分晾干，装入铝箔袋，密封保存。ELISA反应条件将被检猪血清用样品稀释液作5倍稀释，按100化/孔的量，分别加入到PCV2-Mix抗原板中，同时设立PCV2阴性和PCV2阳性猪血清对照孔，37。C反应30分钟。PBST洗板5次。按100A/孔加入兔抗猪酶标抗体溶液，37'C反应30分钟。PBST洗板5次。每孔加入TMB底物A溶液和B溶液各50A，37'C显色反应15分钟。每孔加入终止液50化。在酶标仪上，测定ELISA板孔的0D450nm值。判定结果被检样品0D450值<阳性对照孔OD450nm值XO.25，为PCV-2抗体阴性；样品OD450值》阳性对照孔OD450nm值XO.25，为PCV-2抗体阳性。2、溶液配制PCV2阴性猪血清无菌采集SPF猪的血液，分离血清，56。C灭活30分钟。用0.2pm滤膜滤过，无菌分装，每瓶1.2mL;PCV2阳性猪血清取感染后1428天的5头猪的血清等体积混合均匀，进行系列稀释后用ELISA方法检测，选择0D450nm值在1.5左右的稀释度，用0.2pm滤膜过滤，无菌分装，每瓶1.2mL;样品稀释液0.02mol/L,PH7.2PBST含2%BSA，加入万分之一叠氮钠，分装成每瓶15mL;20倍PBST浓縮洗涤液的制备称取Na2HP04358.1g，KH2P0424.5g，NaCl818.2g，KC120.1g，硫柳汞5g，加入4000mL去离子水，用磁力搅拌器混合，使其充分溶解，加入100mLTween20，再加水定容至5000mL用，分装成每瓶30.0mL。使用时稀释20倍。兔抗猪酶标抗体溶液用0.02mol/L,PH7.2PBST含2%BSA的溶液，按1:10000稀释兔抗猪酶标抗体(Sigma公司产品)，加入万分之一叠氮钠，分装成每瓶12mL;TMB底物A溶液往容器内依次加入1000mL甲醇和5g3，3'，5，5'-四甲基联苯胶(TMB)，混合均匀，分装成每瓶8.0mL;TMB底物B溶液往容器内加入600mL的无菌去离子水，持续搅拌的同时，加入16.7g醋酸钠、2g柠檬酸和3.4g过氧化脲，混合溶解后，用去离子水定容至1000mL，分装成每瓶8.0mL;终止液用去离子水将硫酸稀释成2mol/L，分装成每瓶8.0mL。3、组装ELISA试剂盒将配制好的ELISA反应试剂各组分，按表2组装成试剂盒。组装试剂盒的环境必须洁净无尘，室温应低于25t:，组装好的试剂盒应及时放入4'C冰库保存。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例5制备免疫微球(胶体金)凝集试剂将PCV2-Mix包被到胶体金微粒表面，在缓冲液中制成均匀的悬液。具体方法为取2ml的WHAuC14溶液加热沸腾，加入2.5ml的1%柠檬酸三钠水溶液，继续加热5min，冷却后于4'C保存备用。按2ixl/ml的量加入0.2mol/LK2C03，搅拌10min。用0.01MpH7.4PBS稀释PCV2-Mix多肽抗原，按3.75ug/ml的量加入胶体金溶液中，继续搅拌30min。按5u1/ml的量加入20%BSA水溶液，搅拌5min;按10"1/ml加入腦PEG20000水溶液，搅拌5min，4"C静置过夜。以17000rpm离心20min，再用悬浮液(含5%BSA、5%PVP40的PBST溶液)悬浮至原体积的1/2。该悬液可以作为凝集抗原试剂，与被检血清混合后，通过观察悬液中是否产生凝集块，判定血清中是否存在PCV2抗体。该试剂可与PCV2阴性、阳性对照血清配套使用。以塑胶颗粒为载体时，按《现代免疫学实验技术》(第二版)，采用常规的EDCI法将PCV2-Mix多肽抗原与塑胶颗粒连接，用悬浮液(含5%BSA、5%PVP40的PBST溶液)制成悬液。实施例6制备免疫微球(胶体金)快速检测试纸条制备结合物垫将PCV2-Mix包被到胶体金微粒表面，在缓冲液中制成均匀的悬液，将标记好的胶体金结合物均匀地喷在条状的玻璃纤维膜上，冷冻干燥。喷制检测膜在同一块硝酸纤维膜上，用Bio-dotXYZ3000喷膜机将稀释好的兔抗猪IgG喷成检测线，在间隔37mm处，平行地喷上PCV2抗体作为质控线。放于温箱内干燥，取出后密封保存备用。组装试纸条按图1所示的方式，将样品吸收垫(玻璃纤维膜)、结合物垫、喷有检测线(T带)和对照线(C带)的硝酸纤维素膜、吸收垫(吸水纸)依次粘贴在PVC底板(PVC等硬质薄板)上，用Bio-dot切割机将组装好的试纸切成36m宽的试纸条，装入有干燥剂的铝箔袋内，密封，室温保存。实施例7合成肽偶联试剂与市售重组抗原试剂的应用效果比较1.被检血清采用实施实例3中制备的，PCV1、PCV2标准毒株分别感染5头猪、在其后0、7、14、21、35、49天采集的猪血清，作为被检血清。2.试剂偶联抗原PCV2-Mix制备的ELISA试剂盒、免疫胶体金凝集试剂、免疫胶体金快速检测试纸条；市售重组表达PCV2C即蛋白抗原制备的ELISA试剂盒。3.检测方法(1)用偶联抗原PCV2-Mix制备的ELISA试剂盒来检测洗涤液配制使用前将20倍PBST浓縮洗涤液恢复至室温，并摇动使沉淀的盐溶解，然后用去离子水或双蒸水作20倍稀释。洗涤工作液应在配制后尽快使用，在28"C下可保存2d，再次使用时应恢复到室温。样品稀释取出试剂盒中提供的样品稀释板，在稀释板孔中按1:5的体积比稀释待检血清(120uL样品稀释液+30uL待检血清)和对照猪血清。操作步骤①剪开抗原反应板的包装袋，取出PCV2-Mix抗原板，在记录表上记录阳性对照、阴性对照和样品的位置。②别在相应孔中加入PCV2阴性猪血清对照(2孔)原液和PCV2阳性猪血清对照(2孔)、稀释好的待检血清各100iiL。充分混匀后，贴上封板膜，置37D孵育30分钟。③小心揭掉封板膜，弃去各孔中液体、拍净。每孔加满洗涤液，静置约30秒，重复洗涤5次，最后在吸水纸上拍净。④每孔加入兔抗猪酶标抗体100uL，贴上封板膜，置37'C，孵育30分钟；⑤重复步骤③。(D每孔加入TMB底物A溶液50uL，再加入TMB底物B溶液50uL，轻振混匀，置37'C避光显色15分钟。⑦每孔加入终止液50uL,轻振混匀，立即置酶标仪450nm波长处测定各孔A450nm值(注意加终止液后应在15分钟内读取A450nm值)。判定结果a.试验结果同时符合下列条件，方为有效①两孔阴性对照A450nm平均值应<0.15;②每孔阳性对照A450nm值均》0.60;b.临界值的计算临界值=阳性对照孔A450nm均值XO.25c.结果判定①被检样品A450nm值<临界值，判为PCV-2抗体阴性；②样品A450nm值》临界值，判为PCV-2抗体阳性。(2)用免疫胶体金凝集试剂检测操作方法用一次性塑料吸管，吸取凝集抗原一滴(约30uL)、被检血清一滴(约30uL)，用一次性牙签在玻片上搅拌，充分混合，在20分钟内观察悬液中是否产生凝集块。同时设阴性、阳性血清对照。判定方法当阴性、阳性血清对照成立，样品出现肉眼可见的凝集块，判定血清中存在PCV2抗体，说明猪被PCV2感染；否则，判定血清中不存在PCV2抗体，说明猪未被感染或处在急性感染期。(3)用免疫胶体金快速检测试纸条检测操作方法用一次性塑料吸管，吸取被检血清一滴(约100UL)，滴在试纸条的样品吸收垫上，在20分钟内观察纸条上是否同时出现检测线和对照线。判定方法同时出现检测线和对照线，判定血清中存在PCV2抗体，说明猪被PCV2感染；仅出现对照线，判定血清中不存在PCV2抗体，说明猪未被感染或处在急性感染期；未出现对照线，判定试验失败，可能是试剂失效。(4)用市售重组表达PCV2Cap蛋白抗原制备的ELISA试剂盒检测市售ELISA试剂盒购自北京测迪生物技术公司，按试剂盒的说明书操作、判定结果。4.检测结果四种试剂盒对PCV1、PCV2感染猪的检测结果见表3、表4。特异性比较从对PCV1、PCV2感染猪的检测结果来看，市售重组表达PCV2C邵蛋白抗原制备的ELISA试剂盒，能检出PCV1、PCV2感染，因此与PCV1存在交叉反应；偶联抗原PCV2-Mix制备的ELISA试剂盒、免疫胶体金凝集试剂、免疫胶体金快速检测试纸条仅能检出PCV2感染，因此特异性较好。敏感性比较从PCV2感染后不同时间的检出结果来看，重组表达PCV2C邻蛋白抗原制备的ELISA试剂盒与偶联抗原PCV2-Mix制备的ELISA试剂盒敏感性相似；免疫胶体金凝集试剂、免疫胶体金快速检测试纸条的检出时间较晚，因此敏感性较低。但后者具有操作简单、适合在现场操作的优点。表3各种试剂盒在PCV1感染后不同吋间的检出情况<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>〈110〉中国动物疫病预防控制中心〈120〉一种检测猪圆环病毒2型特异性抗体的合成肽偶联抗原及试剂〈160〉4〈170〉PatentInVersion3.0〈210〉1〈211〉20〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉1TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySer〈210〉2〈211〉20〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉2AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThr〈210〉2〈211〉20〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉3AspArgGlyValGlySerThrAlaVallieLeuAspAspAsnpHepHeProLysAlaSer〈210〉2〈211〉11〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉4SerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeVal权利要求1、一种猪圆环病毒2型的合成肽偶联抗原，包含载体蛋白和以下氨基酸序列或其截短序列的多肽SEQIDNO1TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnIleAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDNO2AspArgGlyValGlySerSerAlaValIleLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrSEQIDNO3AspArgGlyValGlySerThrAlaValIleLeuAspAspAsnpHepHeProLysAlaSerSEQIDNO4SerSerAlaValIleLeuAspAspAsnpHeVal。2.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型的合成肽偶联抗原，其特征在于所述载体蛋白是KLH血兰素蛋白。3、一种检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒，其中包含权利要求l所述的合成肽偶联抗原包被的ELISA反应板。4、一种猪圆环病毒2型抗体的免疫微球快速检测试剂，其中包含权利要求l所述的合成肽偶联抗原和微球颗粒，优选微球颗粒是胶体金颗粒或塑胶微粒。5.如权利要求4所述的猪圆环病毒2型抗体的免疫微球快速检测试剂，其特征在于包括免疫微球凝集试剂或免疫微球快速检测试纸条。6.如权利要求1所述的猪圆环病毒2型的合成肽偶联抗原的制备方法，包括(1)按照SEQIDNO:1SEQIDNO:4的氨基酸序列，采用F-moc固相合成法分别合成四条多肽；(2)采用戊二醛偶联法，将这四条多肽分别与载体蛋白连接，形成四种偶联抗原；(3)将这四种偶联抗原按等体积混合，获得猪圆环病毒2型的合成肽偶联抗原。7、如权利要求1或2所述的猪圆环病毒2型的合成肽偶联抗原在制备检测猪圆环病毒2型感染试剂盒中的用途。8.如权利要求1或2所述的猪圆环病毒2型的合成肽偶联抗原在制备检测猪圆环病毒2型感染免疫微球快速检测试剂中的用途。全文摘要本申请涉及一种猪圆环病毒2型的合成肽偶联抗原，以及用合成肽偶联抗原研制的ELISA试剂盒和免疫微球检测试剂，用于特异性地检测猪圆环病毒2型抗体。文档编号G01N33/569GK101357945SQ200810118570公开日2009年2月4日申请日期2008年8月19日优先权日2008年8月19日发明者振曹,王传彬,田克恭,萍金,陈西钊申请人:中国动物疫病预防控制中心