专利名称：检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏方法及其试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种病毒的检测方法，尤其涉及一种检测禽流感病毒的胶体金免 疫渗滤增敏方法及其试剂盒。
背景技术：
禽流感(AvianInfluenza, AI)是由A型流感病毒引起的禽类的一种从呼吸 病到严重败血症等多种症状的急性高致病性传染病。除了禽类，A型流感病毒还 感染其他种属的动物，如马、猪等，1997年首次发现高致病性禽流感H5N1可 感染人类。自禽流感于1878年在意大利发现以来，给养鸡业造成巨大的经济损 失。历史上危害最大，经济损失最严重的一次禽流感(H5N1)爆发于1983年美 国滨州地区，美国政府为此共花费了 6000多万美元，间接经济损失估计达3.48 亿美元。我国香港地区近期爆发的禽流感，据估计损失约达8000万港币。1997 年及2003年在香港H5N1禽流感己干扰18人，4人死亡，2003年年底开始该病 毒在亚洲国家已造成上百人感染，几十人死亡。2006年2月以来，禽流感疫情 愈演愈烈，马来西亚、俄罗斯、中国、波黑、罗马尼亚、法国、印度、埃及、德 国、奥地利、伊朗、希腊、斯洛文尼亚、意大利等国相继报道了禽流感疫情。因 此对禽流感病毒简便、快捷、高灵敏度、高特异性的检测成为控制禽流感疫情扩 散的当务之急。
现有禽流感病毒检测方法主要分为抗体检测及抗原检测方法。抗体检测方法 包括血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition, HI)、琼脂免疫扩散试验 (Agarose gel immunodiffiision， AGID)、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)、补体结合试验(Complement Fixation Assays, CF)、 神经氨酸酶抑制试验(Neuraminidase inhibitor test, NIT)以及病毒中和试验(Virus neutralization Test, VNT)等。由于抗体检测方法不能区分人工注射疫苗和病毒感 染因而对动物检疫缺乏实际应用意义。因此，目前禽流感病毒检测主要为抗原检 测方法，相对快速的方法为ELISA和荧光RT-PCR，但这两种方法在大范围应用 中存在以下缺陷(1)需要昂贵的仪器设备，检测成本较高且不易在基层单位推
7广；(2)所有这些技术方法都不能在基层生产场、检疫站和临床等现场使用，必 须有专门的实验室；(3)操作较繁琐，检测时间均在数小时以上，直接影响了疫 情的防控速度。
由于胶体金颗粒对许多蛋白质都有很强的吸附功作用，可与SPA、 IgG、毒 素、糖蛋白、酶、抗生素和激素等多种物质非共价结合，从而使其成为免疫反应 的优良标记物，并使得固相膜免疫测定技术(Solid Phase Membrane-based Immunoassay)更加简便。常用的固相膜为硝酸纤维素(nitrocellulose, NC)膜。 斑点免疫测定法(Dot-Immunoboding Assay, DIBA)是在免疫印迹技术基础上改 良发展起来的一项技术。由于其敏感性、特异性与酶联免疫测定法(ELISA)相 当，且操作简单、快速而发展为不同的方法。其中包括斑点免疫渗滤测定法(Dot Immuno Filtration Assay, DIFA)和斑点免疫层析测定法(Dot Immuno Chromatographic Assay, DICA)。以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤测定法称为 胶体金免疫渗滤测定法(Dot-Immunogold Filtration Assay, DIGFA)。然而，上述 几种方法检测禽流感病毒难以满足高灵敏度的要求。以往人们主要利用银染色技 术来提高DIGFA的检测灵敏度。然而，该技术的缺点是背景模糊，增敏效果相 对不强，因而限制了其应用范围。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏方法及其 试剂盒。本发明是在胶体金斑点免疫渗滤测定法(双抗体夹心)的基础上，采用 纳米金颗粒增敏技术，能显著提高检测禽流感病毒的灵敏度，具有敏感、快速和 特异性好等特点，并且价格低廉，能进行样品的高通量筛査，适用于基层或现场 检测禽流感病毒，从而克服了目前胶体金免疫渗滤测定法(DIGFA)检测灵敏度 不高的问题。
本发明检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏测定方法，步骤如下
1.制备免疫渗滤试纸条 免疫渗滤试纸条为A或B之一；
制备免疫渗滤试纸条A:沿长为40-110mm、宽为3-6 mm的矩形聚乙烯 (PE)塑料基片长的方向设有孔间距为2—4 mm的8 — 15个呈一行分布的直径 为0.5-3 mm的圆形进样孔；将与聚乙烯(PE)塑料基片大小相同的硝酸纤维素(NC)膜片粘附于其下面；加样时带有进样孔的聚乙烯(PE)塑料基片在上； 制备免疫渗滤试纸条B:切制8-15个直径0.5-3 mm的圆形硝酸纤维素膜片 粘附于长为40-110mm、宽为3-6 mm的矩形聚乙烯(PE).塑料基片，膜片间距 为3—4mm;每个膜片下方的塑料基片上设有两个吸水孔，吸水孔是将与膜片圆 心重叠、与塑料基片长平行的长轴比膜片圆的直径长0.3mrn、与塑料基片宽平行 的短轴比膜片圆的直径短0.2mm的椭圆未被膜片覆盖的部分去除得到的孔，加 样时带吸水孔的塑料聚乙烯(PE)基片在下面；
2.禽流感病毒多克隆抗体在免疫渗滤试纸条上的固定化
1) 制备固定化禽流感病毒多克隆抗体的免疫渗滤试纸条
a. 制备禽流感病毒多克隆抗体溶液，用800mL蒸馏水溶解8g氯化钠 (NaCl)、 0.2g氯化钾(KCl)、 1.44g磷酸氢二钠(Na2HP04)和0.24g磷酸二
氢钾(KH2P04)，用盐酸(HC1)调节溶液的pH值至7.4,加水至1L，摇匀， 制成pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS， Phosphate Buffer Saline),用磷酸盐缓冲液 PBS稀释禽流感病毒多克隆抗体，使溶液中多克隆抗体重量百分比浓度为 0.05-0.3mg/mL,优选重量百分比浓度为0.1-0.2 mg/mL，制得禽流感病毒多克隆 抗体溶液；
b. 禽流感病毒多克隆抗体在免疫渗滤试纸条上的固定化 禽流感病毒多克隆抗体在免疫渗滤试纸条上固定化采用点样固定化
法或浸泡固定化法之一；
点样固定化法向上述免疫渗滤试纸条A的每个进样孔或免疫渗滤 试纸条B的每个膜片上点1-3 上述禽流感病毒多克隆抗体溶液；点样可为1 次一3次，待渗，风干；得到固定化试纸条A或B;
或浸泡固定化法取500-1000 上述禽流感病毒多克隆抗体溶液置 于小试管中，4'C浸泡5 — 10条免疫渗滤试纸条A或B 10—15小时，取出，风 干；得到固定化试纸条A或B;
2) 试纸条的封闭
将上述用点样法或浸泡法得到的固定化试纸条A或B，放入用双蒸水 稀释的重量百分比浓度为1-5%的牛血清白蛋白溶液(BSA)中，37。C反应 20-60min;取出，风干，得到待用固定化试纸条；4'C保存，备用；3.制备禽流感病毒金标单克隆抗体探针
1) 制备胶体金溶液
a. 制备胶体金溶液的试剂及其体积配比
双蒸水 lOOmL 、
新鲜制备的重量百分比浓度为1%的氯金酸水溶液lmL、 重量百分比浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液 1.0-1.5 mL;
其中重量百分比浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液的优选配比为1.2 mL;
b. 制备胶体金溶液
将所需的双蒸水加热煮沸；加入所需的新鲜制备的重量百分比浓度为 1%的氯金酸水溶液，迅速加入所需的重量百分比浓度为1%的柠檬酸三钠水溶 液，不断搅拌，得到酒红色的胶体金溶液；
2) 胶体金标记禽流感病毒单克隆抗体
a. 制备禽流感病毒单克隆抗体 用禽流感病毒免疫小鼠制备获得能够分泌禽流感单克隆抗体的杂交
瘤细胞株，获得通用A型禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病 毒或H9亚型禽流感病毒的特异性单克隆抗体之一；各亚型禽流感病毒单克隆抗 体只与相应亚型的禽流感病毒抗原发生特异性反应，从而决定了试纸条的特异 性；用上述胶体金标记抗体，制成金标抗体，可与待检样品中的禽流感病毒特异 性的结合；
b. 制备胶体金标记禽流感病毒单克隆抗体 取上述制备的胶体金溶液10mL，用重量百分比浓度为1%的碳酸钾
(K2C03)水溶液调节pH至8.5—9.2(用前调节，过早调节会出现聚集现象)，优 选pH为8.7—9.0;用800mL蒸馏水溶解0.2g氯化钾(KC1)， 1.44g磷酸氢二钠
(Na2HP04)和0.24g磷酸二氢钾(KH2P04)，用盐酸(HC1)调节溶液的pH 值至7.4,加水至1L，摇匀，制成磷酸盐缓冲液(PB， Phosphate Buffer);用磷 酸盐缓冲液(PB)将上述制备获得的禽流感病毒单克隆抗体稀释至蛋白含量为 0.1 — lmg/mL、 pH与上述调节后的胶体金溶液的pH值相同，取0.1-0.5mL，在 13000rpm、 4'C下离心1小时，得到上清液；快速搅拌下将上清液逐滴加入到上 述调节过pH值的胶体金溶液中，至液体的最小蛋白量为10—20ng/mL，优选最
10小蛋白含量为10—16ng/mL;室温放置5min;再分别加入过滤后的重量百分比 浓度为10XBSA溶液lml，继续搅拌10-15分钟，然后在13000 rpm、 4'C离心1 小时，小心弃去上清液(应无色液体，若出现红色则说明离心速度和时间不够)， 得到沉淀物；用10 ml浓度为O.01mol/L、 pH 8.2且其中BSA的重量百分比浓度 为1X的三羟甲基氨基甲烷溶液(TBS， Tris Buffered Saline)将上述沉淀物溶解， 再在1000rpm/min、 4'C离心下10分钟，去除聚集物，留上清液，弃去底部的沉 淀，将上清液13000 rpm、 4'C离心1小时；用5 ml含有重量百分比浓度分别为 0.02%的叠氮钠、1%的蔗糖、1X的BSA且pH为8.2的三羟甲基氨基甲垸溶液 (TBS)重新悬浮底部疏松沉淀，得到禽流感金标单克隆抗体探针；置于4'C冰 箱保存备用；
4. 制备增敏试剂 增敏试剂为试剂A和试剂B;
配制试剂A:配制重量百分比浓度为1% — 10%的氯金酸水溶液；氯金酸水 溶液中氯金酸的优选重量百分比浓度为1-2%;
配制试剂B:配制重量百分比浓度大于O. 1-0.5%的抗坏血酸水溶液；抗坏血 酸水溶液中抗坏血酸的优选重量百分比浓度为0.15%;
5. 检测禽流感病毒
1) 向上述制备的待用固定化试纸条A的进样孔或B的膜片上分别滴加用 PBS稀释成溶液中抗原重量百分比浓度为0.05-O.lmg/mL的通用A型、H5、 H7 或H9型禽流病毒抗原之一作为需要检测的阳性对照、用洗脱离心稀释常规方法 前处理后溶于PBS缓冲溶液的待测样本、针对所要检测的阳性对照抗原通过鸡 胚获得的未经病毒感染的尿囊液的阴性对照，各滴加1一3 nL，每个样品滴加l 一2份(即分别将2份相同的抗原、待测样品或阴极对照细胞液分别滴入或2个 进样孔或2个膜片上，可同时做平行样)，待渗，在室温下反应l分钟以上；得 到带阳性对照抗原、待测样本及阴性对照的试纸条；
2) 取与上述已选定的需要检测的阳性对照抗原相对应的金标单克隆抗体探 针溶液，每份取1一3^L，滴加于上述带阳性对照抗原、待测样本及阴性对照的 试纸条A的每个已加过样品的进样孔或B的每个膜片上;室温反应0.5 2分钟， 优选时间为1—2分钟；再分别加入含体积百分比浓度为0.02%的吐温20的磷酸盐洗液PBST，洗2-5次，每次三滴，每滴2 —lOpL，得到待检测试纸条；
3)分别向上述待检测试纸条A己加过金标单克隆抗体探针的每个进样孔或
试纸条B的每个膜片上先滴加1-3 nL上述增敏试剂的试剂A，然后再滴加3—8 增敏试剂的试剂B,待风干后，再重复述操作1至2次；最后一次滴加后1
一2分钟观察结果，肉眼观察若有灰黑色斑点，则认为该位置对应的禽流感病毒
为阳性结果，与阴性对照显色结果无明显区别，则认为该位置对应的禽流感病毒
为阴性结果。
若待测人或动物的分泌物、血清、尿液或者食品浸提液中含有禽流感病毒血 凝素亚型(H型)和神经氨酸酶亚型(N型)的一种或数种，当NC膜与分泌物、 血清、尿液或者食品浸提液等待测样本接触时，如果禽流感病毒单克隆抗体对应 的斑点呈阳性时，则可特异性地确定禽流感病毒属于某种或某些种病毒亚型。采 用增敏试剂进行一次或多次处理，与原有斑点免疫金测定法相比，禽流感检测灵 敏度可显著提高8~50倍。
本发明所需的通用A型禽流感病毒抗原和各亚型禽流感病毒抗原、禽流 感病毒多克隆抗体可到相关专业的研究单位、公司购买或定制；所需的仪器、设 备、药品均有市售。
图l:免疫渗滤试纸条为A的正视图。 图2:免疫渗滤试纸条为A的俯视图。 图3:免疫渗滤试纸条为B的正视图。
图羊免疫渗滤试纸条为B的俯视图。
具体实施例方式
本发明通过以下实施例作进一步具体描述。
实施例l:各种试剂的配制
1. 氯金酸水溶液称取1.0g氯金酸，溶解于100mL双蒸水中，形成重量
百分比浓度为1%的氯金酸水溶液，摇匀。
2. 柠檬酸三钠水溶液称取1.0g柠檬酸三钠，溶解于100mL双蒸水中， 形成重量百分比浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液，摇匀。
3. 磷酸盐缓冲液(PBS):用800mL蒸馏水溶解8g氯化钠(NaCl), 0.2g
12氯化钾(KC1)， 1.44g磷酸氢二钠(Na2HP04)和0.24g磷酸二氢钾(KH2P04), 用盐酸(HC1)调节溶液的pH值至7.4，加水至1L，摇匀。
4. 磷酸盐缓冲液(PB):用800mL蒸馏水溶解0.2g氯化钾(KCl)， 1.44g磷 酸氢二钠(Na2HP04)和0.24g磷酸二氢钾(KH2P04)，用盐酸(HC1)调节溶 液的pH值至7.4，加水至1L,摇匀。
5. 磷酸盐洗液(PBST):用800mL蒸馏水溶解8g氯化钠(NaCl), 0.2g氯 化钾(KCl)， 1.44g磷酸氢二钠(Na2HP04)和0.24g磷酸二氢钾(KH2P04)， 用盐酸(HC1)调节溶液的pH值至7.4，加水至1L，摇匀，加入200uL的吐温 20，摇匀。
6. 禽流感多克隆抗体用PBS稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体重量百分 比浓度为0.05-0.3mg/mL。
实施例2:禽流感病毒胶体金免疫渗滤增敏试剂盒及使用方法 1.禽流感病毒胶体金免疫渗滤增敏方法试剂盒的装配
1)按上述方法制备的固定化渗滤试纸条A或B100条，平时于4'C冰箱 中保存；
下面结合附图对试纸条A或B作进一步说明
如图l、图2,试纸条A的塑料基片1长为40mrn、宽为3 mm,沿长的 方向设有孔间距为2mm的8个呈一行分布的直径为0.5mm的圆形进样孔3，与 塑料基片大小相同的硝酸纤维素膜片2重叠置于其下面。或试纸条A的塑料基 片1长为llOmm、宽为6 mm，沿长的方向设有孔间距为4mm的15个呈一行分 布的直径为3mm的圆形进样孔3，与塑料基片大小相同的硝酸纤维素膜片2重 叠粘附于其下面；
如图3、图4，试纸条B为切制8个直径0.5 mm的圆形硝酸纤维素膜片1 粘附于长为40mrn、宽为3 mm的塑料基片2上，各个膜片间距为3mm;每个 膜片下方的塑料基片上设有两个吸水孔3，吸水孔是将与膜片圆心重叠、与塑料 基片长平行的长轴为比膜片圆的直径长0.3mm即0.8mrn、与塑料基片宽平行的 短轴为比膜片圆的直径短0.2mm即0.3mm的椭圆未被膜片覆盖的部分去除得到 的孔，加样时带吸水孔的塑料聚乙烯(PE)基片在下面；或试纸条B为切制15 个直径3 mm的圆形硝酸纤维素膜2片置于长为llOmm、宽为6 mm的塑料基片l上，各个膜片间距为4mm;每个膜片下方的塑料基片上设有两个吸水孔3，吸 水孔是将与膜片圆心重叠、与塑料基片长平行的长轴为比膜片圆的直径长0.3mm 即3.3mm、与塑料基片宽平行的短轴比膜片圆的直径短0.2mm即2.8mm的椭圆 未被膜片覆盖的部分去除得到的孔，加样时带吸水孔的塑料聚乙烯(PE)基片 在下面；
2) 磷酸盐缓冲液(PBS) 100ml，置于塑料瓶中；
3) 按上述方法制备的增敏试剂试剂A;取氯金酸1.0g，用双蒸水稀释到 100 mL放在棕色试剂瓶中，分装后每个试剂盒内装10 mL，可以同时检测100 组试纸条。按上述方法制备的增敏试剂试剂B;取抗坏血酸1.0 g，用双蒸水稀 释到100—150mL放在棕色试剂瓶中，分装后每个试剂包装内装10mL;可检测 100条试纸条；
4) 磷酸盐洗液(PBST):取200pL吐温20,用pH7.4、 0.01mol/L的PBS 缓冲液配制成1000mL，分装后每个试剂盒内装100mL;
5) 阳性对照抗原液，用PBS稀释成溶液中抗原重量百分比浓度为 0. 05-0. lmg/mL的通用A型、H5、H7或H9型禽流感病毒抗原之一的溶液lml;可 检测100条试纸条；
6) 阴性对照液，针对所要检测的阳性对照抗原通过鸡胚获得的未经病毒 感染的尿囊液10mL;可检测100条试纸条；
7) 金标探针试剂，取蛋白含量为10—20pg/mL的针对阳性对照的禽流感病 毒单克隆抗体探针液1000 nL，放在小玻璃瓶中，抽成真空后封口，平时于4'C 冰箱中保存；可检测100条试纸条；
8) 塑料滴瓶10个、l一25nL量程的移液枪；
9) 长、宽分别大于渗滤试纸条A或B的滤纸100张。 2.试剂盒的使用方法如下-
1) 取出上述试纸条A或B—条，放于平放在桌面上的一张滤纸上面；
2) 分别将需要检测的阳性对照抗原液、用洗脱离心稀释常规方法前处理 后溶于PBS缓冲溶液的待测样本液及阴性对照液l一3 nL,滴入上述试纸条A 的进样孔或试纸条B的膜片，每个样品分别做2份，待渗；
3)向上述已加入样品的纸条A的进样孔或试纸条B的膜片上分别加入1 HL与上述需要检测的禽流感抗原相对应的金标单克隆抗体探针溶液，置干；
4) 向上述已加入金标单克隆抗体探针试剂的试纸条A的进样孔或试纸条 B的膜片分别滴加10pL磷酸盐洗液(PBST)洗NC膜，每次三滴，洗2-5次， 室温下置干；
5) 向上述己用磷酸盐洗液(PBST)洗过NC膜的试纸条A的进样孔或试 纸条B的膜片上分别加入2 pL增敏试剂的试剂A,再加入5pL增敏试剂的试剂 B，显色1一2分钟；可重复该操作一次或数次；
6) 最后一次显色l一2分钟后观察相应位置有无灰黑色斑点，有则认为该 位置对应的禽流感病毒为阳性结果，没有或颜色与相应阴性对照相比淡则认为该 位置对应的禽流感病毒呈阴性结果。
以上检测过程每次选定一种禽流感病毒的抗原做阳性的对照抗原，再选用与 这种抗原相对应的胶体金标记的单抗，用以确定待测样本所含禽流感病毒的种 类。 一般首先选定通用A型禽流感病毒抗原做阳性的对照抗原，再选用与这种 抗原相对应的的胶体金标记的单抗稀释液，进行筛査；检测呈阳性，再分别选定 亚型病毒抗原做阳性对照及与其相对应的胶体金标记的单抗进一步检测确定具 体的种类。因为每种试剂盒只能针对一种病毒进行检测，如需现场进行种类的定 性甄别，则需携带所需检测的病毒抗原相应的检测试剂盒。 实施例3:胶体金的制备方法
技术领域：
本发明以1%氯金酸、1%柠檬酸三钠与双蒸水为原料，采用柠檬酸三钠还原 法制备胶体金颗粒，可通过改变柠檬酸三钠的加入量，制备不同直径且大小较为 均一 的胶体金颗粒(l 5-150nm);
取100mL双蒸水，加热煮沸，加入lmL新鲜制备的1%氯金酸水溶液 (HAuCU),迅速加入1.2mLP/。柠檬酸三钠，不断搅拌，制备成酒红色的胶体 金用于测试效果最好，此时合成的胶体金较稳定，在4'C下可保存12个月。
实施例4:胶体金标记最适pH值的确定
取若干个5mL试管，分别加入lmL胶体金溶液，用0.1 mol/LHC1和25 mmol/LK2C03将溶液的pH值分别调为3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14;取一96孔培养板，按pH值从低到高将上述胶体金溶液各取100jiL加入孔 中，重复三次；每孔分别加入3nL重量百分比浓度为lmg/mL的纯化好的禽流感单克隆抗体，孔内混合均匀，室温下放置15min;每孔分别加入2(HiL浓度为 10%NaCl,孔内混合均匀，室温下放置10min;观察胶体金的颜色变化，并分别 测定其OD520 nm和OD580 m，记录在OD520 和OD580 nm差值最大时的pH(X); 重复前面的步骤，再进一步细化pH值梯度，将pH值梯度设定为X-0.6; X-0.3;
X; X+0.3; X+0.6; X+l，观察胶体金颜色变化，直到室温下放置2小时，分别
测定其ODs2o腿和OD580nm值，记录在OD520nm与OD580nm差值最大时的pH值， 据此判断标记时的适宜pH值为8.5-9.2，优选pH值为8.7-9.2。 实施例5:确定胶体金标记最低蛋白稳定量
最低蛋白稳定量的确定实验，以0.1 mol/LK2C03溶液调节胶体金溶液至pH 8.5进行标记，稀释后的抗体与其他有关试剂按下表逐项操作。 表2分光光度计测定稳定胶体金最小蛋白计量
试剂 试验管 对照管
12345678910
AVI抗体(n。0卯8070605040302010100(H2O)
缓冲液(pL)01020304050607080卯100
胶体金(mL)1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0
摇匀，放置2min
腦NaCl(nL)1001001001001001001001001001000
摇匀，放置5min后，OD580nm测定
以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线与横轴接近那一 点的蛋白质用量即为最小蛋白质稳定量。在此基础上再加10-20%即为实际蛋白 质稳定量。结果显示，当蛋白含量为10—20|ig/mL时，即认为合适；当蛋白含 量为10—16吗/mL时，更为合适。
实施例6:禽流感病毒NP表达蛋白增敏检测敏感性和特异性试验 将人工表达禽流感病毒NP蛋白用PBS稀释200倍，后进行连续倍比稀释，直至 稀释至200X2S倍，在使用试纸条检测时，即增敏前检测底限为样品800倍稀释， 对检测试纸条进行增敏处理后检测底限为样品6400倍稀释，该金标增敏方法可以 使禽流感病毒NP蛋白检测底线提高8倍。同时用新城疫病毒(NDV)进行检测，
16试纸条检测含NDV的PBS稀释液和正常细胞培养液，都为阴性。这说明NDV对 禽流感病毒通用型的检测不产生干扰。
实施例7: H9N2亚型禽流感病毒胶体金免疫渗滤增敏检测试验 用H9N2亚型禽流感病毒接种鸡胚，收获鸡胚尿囊液用PBS进行连续倍比 稀释，利用本发明提供的增敏检测方法，将增敏试剂A与增敏试剂B按照1: 1 的体积比混合，制成增敏试剂，分别取增敏试剂4UL处理。在使用试纸条检测 时，即增敏前检测底限为血凝素效价(HAU)为2'1,对检测试纸条进行增敏处 理后HAU为2-5，比对试验结果表明，对H9N2亚型禽流感病毒胶体金检测可增 敏16倍以上。
权利要求
1. 一种检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏方法，步骤如下1)制备免疫渗滤试纸条免疫渗滤试纸条为A或B之一；制备免疫渗滤试纸条A沿长为40-110mm、宽为3-6mm的矩形聚乙烯塑料基片长的方向设有孔间距为2—4mm的8—15个呈一行分布的直径为0.5-3mm的圆形进样孔；将与聚乙烯塑料基片大小相同的硝酸纤维素膜片粘附于其下面；加样时带有进样孔的聚乙烯塑料基片在上；制备免疫渗滤试纸条B切制8-15个直径0.5-3mm的圆形硝酸纤维素膜片粘附于长为40-110mm、宽为3-6mm的矩形聚乙烯.塑料基片，膜片间距为3—4mm；每个膜片下方的塑料基片上设有两个吸水孔，吸水孔是将与膜片圆心重叠、与塑料基片长平行的长轴比膜片圆的直径长0.3mm、与塑料基片宽平行的短轴比膜片圆的直径短0.2mm的椭圆未被膜片覆盖的部分去除得到的孔，加样时带吸水孔的塑料聚乙烯基片在下面；2)禽流感病毒多克隆抗体在免疫渗滤试纸条上的固定化(1)制备固定化禽流感病毒多克隆抗体的免疫渗滤试纸条a. 制备禽流感病毒多克隆抗体溶液用磷酸盐缓冲液PBS稀释禽流感病毒多克隆抗体，使溶液中多克隆抗体重量百分比浓度为0.05-0.3mg/mL，制得禽流感病毒多克隆抗体溶液；b. 禽流感病毒多克隆抗体在免疫渗滤试纸条上的固定化禽流感病毒多克隆抗体在免疫渗滤试纸条上固定化采用点样固定化法或浸泡固定化法之一；点样固定化法向上述免疫渗滤试纸条A的每个进样孔或免疫渗滤试纸条B的每个膜片上点1-3μL上述禽流感病毒多克隆抗体溶液；点样可为1次—3次，待渗，风干；得到固定化试纸条A或B；或浸泡固定化法取500-1000μL上述禽流感病毒多克隆抗体溶液置于小试管中，4℃浸泡5—10条免疫渗滤试纸条A或B10—15小时，取出，风干；得到固定化试纸条A或B；(2)试纸条的封闭将上述用点样法或浸泡法得到的固定化试纸条A或B，放入用双蒸水稀释的重量百分比浓度为1-5％的牛血清白蛋白溶液中，37℃封闭20-60min；取出，风干，得到待用固定化试纸条；4℃保存，备用；3)制备禽流感病毒金标单克隆抗体探针(1)制备胶体金溶液a. 制备胶体金溶液的试剂及其体积配比双蒸水100mL、新鲜制备的重量百分比浓度为1％的氯金酸水溶液1mL、重量百分比浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液 1.0-1.5mL；b. 制备胶体金溶液将所需的双蒸水加热煮沸；加入所需的新鲜制备的重量百分比浓度为1％的氯金酸水溶液，迅速加入所需的重量百分比浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液，不断搅拌，得到酒红色的胶体金溶液；(2)胶体金标记禽流感病毒单克隆抗体a. 制备禽流感病毒单克隆抗体用禽流感病毒免疫小鼠制备获得能够分泌禽流感单克隆抗体的杂交瘤细胞株，获得通用A型禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒或H9亚型禽流感病毒的特异性单克隆抗体之一；b. 制备胶体金标记禽流感病毒单克隆抗体取上述制备的胶体金溶液10mL，用重量百分比浓度为1％的碳酸钾水溶液调节pH至8.5—9.2；用磷酸盐缓冲液PB将上述制备获得的禽流感病毒单克隆抗体稀释至蛋白含量为0.1—1mg/mL、pH与上述调节后的胶体金溶液的pH值相同，各取0.1-0.5mL，分别在13000rpm、4℃下离心1小时，得到上清液；快速搅拌下将上清液逐滴加入到上述调节过pH值的胶体金溶液中，至液体的最小蛋白量为10—20μg/mL，室温放置5min；再分别加入过滤后的重量百分比浓度为10％BSA溶液1ml，继续搅拌10-15分钟，然后在13000rpm、4℃离心1小时，小心弃去上清液，得到沉淀物；用10ml、浓度为0.01mol/L、pH8.2且其中BSA的重量百分比浓度为1％的三羟甲基氨基甲烷溶液将上述各沉淀物溶解，再在1000rpm/min、4℃离心下10分钟，去除聚集物，留上清液，弃去底部的沉淀，将上清液13000rpm、4℃离心1小时；用5mL含有重量百分比浓度分别为0.02％的叠氮钠、1％的蔗糖、1％的BSA且pH为8.2的三羟甲基氨基甲烷溶液重新悬浮底部疏松沉淀，得到禽流感金标单克隆抗体探针；置于4℃冰箱保存备用；4)制备增敏试剂增敏试剂为试剂A和试剂B；配制试剂A配制重量百分比浓度为1％—10％的氯金酸水溶液；配制试剂B配制重量百分比浓度大于0.1-0.5％的抗坏血酸水溶液；5)检测禽流感病毒(1)向上述制备的待用固定化试纸条A的进样孔或B的膜片上分别滴加用PBS稀释成溶液中抗原重量百分比浓度为0.05-0.1mg/mL的通用A型、H5、H7或H9型禽流病毒抗原之一作为需要检测的阳性对照、用洗脱离心稀释常规方法前处理后溶于PBS缓冲溶液的待测样本、针对所要检测的阳性对照抗原通过鸡胚获得的未经病毒感染的尿囊液的阴性对照，各滴加1—3μL，待渗，在室温下反应1分钟以上；得到带阳性对照抗原、待测样本及阴性对照的试纸条；(2)取与上述已选定的需要检测的阳性对照抗原相对应的金标单克隆抗体探针溶液，每份取1—3μL，滴加于上述带阳性对照抗原、待测样本及阴性对照的试纸条A的每个已加过样品的进样孔或B的每个膜片上；室温反应0.5～2分钟，再分别加入含体积百分比浓度为0.02％的吐温20的磷酸盐洗液PBST，洗2-5次，每次三滴，每滴2—10μL，得到待检测试纸条；(3)分别向上述待检测试纸条A已加过金标单克隆抗体探针的每个进样孔或试纸条B的每个膜片上先滴加1-3μL上述增敏试剂的试剂A，然后再滴加3—8μL增敏试剂的试剂B，待风干后，再重复述操作1至2次；最后一次滴加后1—2分钟观察结果，肉眼观察若有灰黑色斑点，则认为该位置对应的禽流感病毒为阳性结果，与阴性对照显色结果无明显区别，则认为该位置对应的禽流感病毒为阴性结果。
2.如权利要求1所述一种检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏方法，其 特征在于，制备禽流感病毒多克隆抗体溶液的步骤中，溶液中多克隆抗体重量百 分比浓度为0.1-0.2 mg/mL。
3. 如权利要求2所述一种检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏方法，其特 征在于，制备胶体金溶液的的步骤中，试剂中重量百分比浓度为1%的柠檬酸三 钠水溶液的配比为1.2mL。
4. 如权利要求3所述一种检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏方法，其 特征在于，制备胶体金标记禽流感病毒单克隆抗体的步骤中，将胶体金溶液调节 pH为8.7—9.0。
5.如权利要求4所述一种检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏方法，其 特征在于，制备胶体金标记禽流感病毒单克隆抗体的步骤中，快速搅拌下将上清 液逐滴加入到上述调节过pH值的胶体金溶液中，至液体的最小蛋白量为10— 16(ig/mL。
6. 如权利要求5所述一种检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏方法，其 特征在于，制备增敏试剂A试剂的步骤中，氯金酸水溶液中氯金酸的重量百分 比浓度为1-2%。
7. 如权利要求6所述一种检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏方法，其特 征在于，制备增敏试剂B试剂的步骤中，抗坏血酸水溶液中抗坏血酸的重量百 分比浓度为0.15%。
8.如权利要求1所述一种检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏方法， 其特征在于，试剂盒的装配包括1)按上述方法制备的固定化渗滤试纸条A或B100条，平时于4'C冰箱 中保存；2) 磷酸盐缓冲液PBS100ml，置于塑料瓶中；3) 按上述方法制备的增敏试剂A试剂10mL,可检测100组试纸条；按上 述方法制备的增敏试剂B试剂10 mL，可检测100条试纸条；4) 磷酸盐洗液PBST 100mL;5) 阳性对照抗原液，用PBS稀释成溶液中抗原重量百分比浓度为 0. 05-0. lmg/mL的通用A型、H5、 H7或H9型禽流感病毒抗原之一的溶液lml;可 检测100条试纸条；6) 阴性对照液，针对所要检测的阳性对照抗原通过鸡胚获得的未经病毒感 染的尿囊液10mL;可检测100条试纸条；7)金标探针试剂，取蛋白含量为10—20ng/mL的针对阳性对照的禽流感病 毒单克隆抗体探针液1000 nL,放在小玻璃瓶中，抽成真空后封口，平时于4'C 冰箱中保存；可检测100条试纸条；8) 塑料滴瓶10个、l一25nL量程的移液枪；9) 长、宽分别大于渗滤试纸条A或B的滤纸100张。
全文摘要
本发明提供一种检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏方法及其试剂盒，步骤如下1)制备免疫渗滤试纸条；2)禽流感病毒多克隆抗体在免疫渗滤试纸条上的固定化；3)制备禽流感病毒金标单克隆抗体金标探针；4)制备增敏试剂；5)检测禽流感病毒。本发明利用氯金酸与抗坏血酸发生氧化还原反应生成金原子可被胶体金吸附的特点，来定位胶体金沉积部位进行显色加强，提高了待检抗原的检测灵敏度8～50倍。本发明是在胶体金斑点免疫渗滤测定法(双抗体夹心)的基础上，采用纳米金颗粒增敏技术，能提高检测禽流感病毒的检测灵敏度，能进行样品的高通量筛查，适用于基层或现场检测禽流感病毒。
文档编号G01N33/577GK101470116SQ20081011476
公开日2009年7月1日 申请日期2008年6月12日 优先权日2008年6月12日
发明者李锦丰, 田世民, 强 薛, 邹明强, 涌 金, 齐小花 申请人:中国检验检疫科学研究院