专利名称：：鳞状细胞癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种鳞状细胞癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：鳞状细胞癌抗原(scc)是一种特异性很好而且是最早用于诊断鳞癌的肿瘤标志物。它最初从宫颈癌组织中分离获得，就生物活性而言属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，它包括两个基因SCC1和SCC2。SCC广泛存在于不同器官的正常组织中(含量极微)和恶性病变的上皮细胞中。在血清中至少有四种形式的SCC:游离SCC1、游离SCC2、以及与相对应的丝氨酸蛋白酶结合物。SCC在正常的鳞状上皮细胞中抑制细胞调亡和参与鳞状上皮层的分化，在肿瘤细胞中参与肿瘤的生长,它有助于所有鳞状上皮细胞起源癌的诊断和监测，例如子宫颈癌、肺癌(非小细胞肺癌)、头颈部癌、食管癌以及外阴部鳞状细胞癌等。检测总SCC，其临床意义有1.对子宫颈癌有较高的诊断价值对原发性宫颈鳞癌敏感性为44%-69%;复发癌敏感性为67%-100%,特异性90%-96%;其血清学水平与肿瘤发展、侵犯程度及有否转移相关。在宫颈癌根治术后SCC浓度显著下降；可及早提示复发，50%患者的SCC浓度升高先于临床诊断复发2-5个月，它可以作为独立风险因子加以应用。2.辅助诊断肺鳞癌其水平与肿瘤的进展程度相关，它配合CA125、CYFRA21-1，.和CEA联合检测可提高肺癌患者诊断的灵敏性。3.食管鳞癌的预测阳性率随病情发展而上升，对于晚期患者,其灵敏性可达73%，联合检测CYFRA21-1和SCC可以提高检测的灵敏性。4.其它鳞癌的诊断和监测头颈癌、外阴癌、膀胱癌、肛管癌、皮肤癌等。对于SCC的定量分析，目前常用的方法是酶联免疫吸附分析法(ELISA)，但由于酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测灵敏度不够高，检测范围窄，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性等缺点，因此不能满足临床的要求。本发明"鳞状细胞癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒"可以检测出患有子宫颈癌、肺癌(非小细胞肺癌)、食管癌以及头颈癌等人体内的鳞状细胞癌抗原含量，并且根据所含鳞状细胞癌抗原含量的多少来判断治疗的效果及其病情的变化。它具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。根据本发明的试剂盒，酶标记的抗体与固相载体上包被的抗体与被测样品中的鳞状细胞癌抗原形成"包被抗体-抗原-抗体-酶"的夹心复合物结构，因此本发明采用的"双抗体夹心一步法"反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理，又在酶联免疫分析的基础上应用酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而具有与酶联免疫分析同等的特异性，而灵敏度却大大提高，可为临床诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。
发明内容为了解决上述问题因此开发和完成了本发明，即将化学发光技术与scc的免疫分析学有效地结合，同时使用了发光信号强、持续时间长、更高信噪比的自制化学发光底物液，提供了一种能够更加简便、快速、灵敏、稳定地检测scc的试剂盒。同时本发明的试剂盒采用的方法比酶免疫分析法灵敏度高，减少了假阳性和假阴性的出现，并且可以縮短检测窗口期，因此使本试剂盒更适于在产业上有效地进行推广和应用。本发明的目的是提供一种鳞状细胞癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂根据本发明的鳞状细胞癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒包括1)鳞状细胞癌抗原校准品；2)鳞状细胞癌抗原抗体包被的固相载体；3)酶标记的鳞状细胞癌抗原抗体；4)上述酶所作用的化学发光底物液；以及5)浓縮洗涤液。根据本发明的试剂盒，其中，所述固相载体为微孔板、塑料管或塑料珠。根据本发明的试剂盒，其中，所述标记酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。优选地，上述试剂盒中，所述化学发光底物为1,2-二氧乙垸类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺；所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。优先地，上述试剂盒中，所述的浓縮洗涤液为Tris-HCl洗涤液或PBST洗液。本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤1)配制鳞状细胞癌抗原校准品；2)以鳞状细胞癌抗原抗体包被固相载体；3)以酶标记鳞状细胞癌抗原抗体；4)配制上述酶所作用的发光底物液；5)配制浓縮洗涤液；6)分装上述鳞状细胞癌抗原校准品、酶标记的鳞状细胞癌抗原抗体、上述酶所作用的化学发光底物液和浓縮洗涤液；以及7)组装为成品。根据本发明的方法，所述包被固相载体的步骤2)包括以下步骤I)包被采用0.05mol/LpH值为7.2的硼酸盐缓冲液与适当浓度的鳞状细胞癌抗原抗体混合制成包被液，并将其负载于固相载体上；II)封闭配制ly。BSA封闭液，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。其中碱性磷酸酶标记鳞状细胞癌抗原抗体，采用戊二醛交联法进行标记；辣根过氧化物酶标记鳞状细胞癌抗原抗体，采用过碘酸钠法进行标记。所述鳞状细胞癌抗原校准品为标准级，纯度不得低于80%，包被的微孔板为48或96孔的微孔板条。标记抗体的酶为偶联碱性磷酸酶(ALP)，采用的化学发光底物液和浓縮洗涤液分别为AMPPD与Tris-HC1或标记抗体的酶为辣根过氧化物酶(HRP)，所用的化学发光底物液和浓縮洗涤液分别为鲁米诺和PBST。图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图图2为本发明的试剂盒同酶免试剂盒进行临床血样测值的对比具体实施例方式实施例1应用碱性磷酸酶系统制备本发明的鳞状细胞癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒首先对所用的原材料进行了筛选试验和质量鉴定，以保证试验的精确性，然后对包被方法进行了研究，选择出最适合的包被缓冲液和封闭液，找到最佳的浓度条件，并且优先配制出了能够使酶标记物长期保持活性的酶标记物稀释液。一、碱性磷酸酶标记抗体的制备采用经典的戊二醛交联法与碱性磷酸酶偶联，对PBS充分透析，加入等体积的甘油，在低温冰箱(-20°C)中保存。使用时用酶标记物稀释液稀释。经试验证明，酶标抗体的工作浓度范围为1:30005000。具体地，酶标记物稀释液配制方法为Tris12.120gBSA5gProclin-300lmL双蒸水lOOOmL溶解混匀后，加入HC1，调整pH值至7.5。二、鳞状细胞癌抗原校准品的制备以小牛血清或蛋白缓冲液为基质，加入鳞状细胞癌抗原纯品配制而成。制备的最终系列浓度为O、2、10、25、50、150ng/mL。三、抗体包被的固相载体的制备。(1)包被采用0.05mol/LpH值为7.2的硼酸盐缓冲液与适当浓度的鳞状细胞癌抗原抗体混合制成包被液，并将其负载于微孔板上；具体地，所述0.05mol/L硼酸盐缓冲液的配方为-NaH2P04'2H200.495gNa2HP04.12H202.58gNaCl5.8g去离子水lOOOmL溶解混匀后，调整pH值至9.6，加入5.0mg鳞状细胞癌抗原抗体混匀，按110yL/孔的量加入微孔板中，4'C过夜。(2)封闭封闭液的配方为NaH2P04.2H200.2gNa2HP04'12H202.9gBSA10gProclin300lmL双蒸水定容至lOOOmL将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水定容，溶解混匀，调整pH值为7.07.6。按20(VL/孔的量加入微孔板中，室温放置3小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时后立即进行封袋。置于28'C保存，备用。四、化学发光底物本发明所使用的碱性磷酸酶(ALP)的化学发光底物液的配制方法Tris24gNaCl160gKC14gHC115mL.双蒸水lOOOmLProclin300lmLAMPPD200mL五、20倍浓縮洗涤液的制备配方Tris24gNaCl160gKC14gHC115mL去离子水lOOOraL调整pH值至7.4。六、半成品及成品组成上述步骤所得产品分装即为半成品。随机抽取三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格后组装成SCC化学发光免疫分析定量测定试剂盒。利用本发明的试剂盒进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强，更适用于我国在临床上的检测与应用。实施例2应用辣根过氧化物酶系统制备本发明的鳞状细胞癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒一、辣根过氧化物酶标记抗体的制备溶解4.4mgHRP于lmL蒸馏水中，加入0.4mL过碘酸钠(50mmol/L)室温搅拌20min，经lmmol/L醋酸钠缓冲液，pH值为4.4透析后加入8mg鳞状细胞癌抗原抗体，搅拌2h，最后用200mmol/LNaBH4进行还原，经0.02MPBS缓冲液透析后，加等体积甘油，一20'C以下保存。二、化学发光底物的制备化学发光底物A液鲁米诺4-羟基联苯4-碘苯硼酸10mM0.3mM0.05mM硼砂双蒸水定溶调整pH至8.010.0化学发光底物B液过氧化脲3.5mMI.7716g0.051g0.012gII.4g4.9g1000mLTween200.1%Na2HP0412H20NaH2P042H20双蒸水调整pH至7.07.6使用时A液与B液等比例混合。三、20倍浓縮洗涤液的制备配方Na2訓412H2058gNaH2P042H202gNaCl160gTween-20lmLProclin300lmL去离子水1000mL调整pH至7.27.40.329glml51.58g8.74g1000mL其他试剂与组分的配制方法与碱性磷酸酶系统制备鳞状细胞癌抗原化学发光免疫分析定量试剂盒的方法一致。实施例23制备本发明的鳞状细胞癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂除分别以塑料管、塑料珠作为载体外，其余均以与实施例1相同的方法制备本发明的定量测定试剂盒。实施例4本发明的试剂盒的使用方法使用本试剂盒进行实验前，需先取出固相载体、校准品/检测样品、标记抗体溶液在室温放置1530分钟，使它们平衡到室温；之后，准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检査化学发光仪以及辅助仪器，如洗板机等，是否正常工作。使用本试剂盒按照实施例1的方法进行实验的具体操作步骤如下1)将实验需要的微孔板放置在板架上；2)反应孔中分别加各浓度校准品0、2、10、25、50、150ng/mL和待测样品每孔各加25ixL，每次试验设空白1L，然后除空白孔外各孔加酶标记抗体溶液100";3)微量振荡器上振荡30秒混匀；4)用封板膜封板，室温(2027°C)温育60min;5)用洗液弃去孔中溶液，自动洗板机或者手工洗板5次，在吸水纸上拍干；6)每孔加发光底物液100yL，用微量震荡器充分震荡均匀，室温(2027'C)避光反应1030min。7)在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/孔；8)分别读取校准品浓度值和其相对应的RLU值，在建立的双对数曲线上建立标准曲线(参见附图1);9)打印检测结果报告。实施例5本发明的试剂盒在方法学上的鉴定按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行鉴定，经过大量的实验证明，本发明试剂盒方法学指标如下1)检测范围O.3200ng/mL;2)最低检出量平行测定20孔零值校准品血清，计算零值校准品RLU平均值(X)及标准差(S)，以X+2S为定值代入标准曲线方程中，求出其对应的浓度值，所对应的浓度值即为最低检出量为0.3ng/mL。3)精密度:测定SCC质控血清的浓度，重复检测3次，每次重复20孔，进行精密度测定，计算分析内精密度(高、中、低三个质量控制范围)为6.7%，，分析间精密度(高、中、低三个质量控制范围)为7.7%;4)准确性分别进行低中高三个浓度血清(浓度分别5ng/mL、20ng/mL和50ng/mL)的回收实验，其平均分别为101%、110%和96%;5)特异性:分别测定与CEA、CA125、AFP等常见肿瘤标志物进行交叉反应，其交叉反应率分别为0.04%，0.06%，0.05%均小于0.1%;6)稳定性:各试剂组分别置于37'C烘箱中3天、7天和15天，实验发现各组分仍稳定。利用本发明方法进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强，更适用于我国临床检测。因此本发明为临床检测鳞状细胞癌抗原(SCC)，辅助诊断以及手术后观察提供了一种更准确，特异，方便，快捷的方法。实施例6使用本发明的试剂盒同酶免试剂盒进行临床血样测值对比取用医院临床收集肿瘤病人血清标本150份，其中原发性宫颈癌患者52例，复发性宫颈癌患者32例，肺癌患者43例，头颈癌患者8例，食道癌患者15例，正常人血清标本200份。分别使用本发明实施例1的试剂盒和酶免诊断试剂盒进行血样检测，统计实验结果并进行相关分析，这两种方法高度相关。本发明试剂盒与酶免试剂盒的临床实验比对，实验结果见下表1:表1本发明试剂盒与酶免试剂盒的临床实验比对结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>其中200份正常人血样的SCC平均值为2.82ng/mL，正常参考值为小于5ng/mL。经试验结果发现SCC对子宫颈癌是一个较敏感的诊断指标、对肺癌等其他癌症则具有辅助诊断的作用。同时通过比较发现本法与酶免试齐i检检测结果较接近，其相关系数达到0.9708。但本发明试剂盒检出阳性血清的检出率为62.7%高于酶免试剂盒的59.3%，表明本试剂盒明显优于酶联免疫试剂盒。权利要求1、鳞状细胞癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括鳞状细胞癌抗原校准品、鳞状细胞癌抗原抗体包被的固相载体、酶标记的鳞状细胞癌抗原抗体、化学发光底物液；以及浓缩洗涤液。2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品系列是以小牛血清或蛋白缓冲液为基质，加入鳞状细胞癌抗原纯品配制而成；包被鳞状细胞癌抗原抗体的固相载体为包被的微孔板、塑料珠或塑料管；所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液为1，2_二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。4、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述浓縮洗涤液为Tris-HC1洗涤液或PBST洗涤液。5、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记物的工作浓度为1:30005000。6、如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述l,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。7、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤1)配制鳞状细胞癌抗原校准品；2)以鳞状细胞癌抗原抗体包被固相载体；3)以酶标记鳞状细胞癌抗原抗体；4)配制上述酶所作用的化学发光底物液；5)配制浓縮洗涤液；6)分装上述鳞状细胞癌抗原校准品、酶标记的鳞状细胞癌抗原抗体、上述酶所作用的化学发光底物液和浓縮洗涤液；以及7)组装为成品。8、如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述包被固相载体的步骤2)包括以下步骤I)包被采用0.05mol/LpH值为7.2的硼酸盐缓冲液与适当浓度的鳞状细胞癌抗原抗体混合制成包被液，并将其负载于固相载体上；II)封闭配制ly。BSA封闭液，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。9、如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管。10、如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物液为1，2-二氧乙垸类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺；所述浓縮洗涤液为Tris-HCl洗涤液或PBST洗漆液。全文摘要本发明提供了一种鳞状细胞癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒，涉及免疫分析医学领域。本发明试剂盒主要由鳞状细胞癌抗原校准品、鳞状细胞癌抗原抗体包被的固相载体、酶标记的鳞状细胞癌抗原抗体、化学发光底物液、以及浓缩洗涤液组成。所述试剂盒的制备方法，主要包括以下步骤固相载体的包被，校准品、酶标记物的制备，化学发光底物液和浓缩洗涤液的配制。采用本试剂盒及其制备方法，可提高检测的灵敏度、线性范围和定量的准确性，使用方便，安全稳定。文档编号G01N33/574GK101377497SQ20081010266公开日2009年3月4日申请日期2008年3月25日优先权日2008年3月25日发明者超任,唐宝军,宋胜利,应希堂,胡国茂,郑金来申请人:北京科美东雅生物技术有限公司