专利名称：稳定荧光标记细胞核的方法和试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及半导体材料量子点和细胞荧光标记技术领域，具体而 言，本发明提供了联合使用半导体纳米材料量子点和细胞核有机荧光 染料DAPI或PI对细胞核进行稳定荧光标记的方法，及含有上述量子 点和DAPI或PI的用于细胞核稳定荧光标记的试剂盒。
背景技术：
，.
在传统的细胞核荧光标记技术中，多采用有机荧光染料4、6-二 脒基-2-苯基p引咮(4'， 6-diamidino-2-phenyl indole, DAPI， C6H15N5 2HC1 ， 分子量为 350. 25 )和碘化丙咬(3， 8-Diamino-5-(3-d i e t hy1me t hy1 am i no) propyl)-6-pheny1 phenan t hr i d i n i um diiodide， PI， C27H34NJ2，分子量为668. 4 )进行细胞核标记。DAPI 和PI都可透过细胞膜与细胞核中的染色体DNA强力结合，通常在荧光 显微镜下，经紫外光(364nm波长)激发后使经过DAPI染色的细胞核 呈现亮蓝色荧光，经红色荧光(550nm波长)激发后使经过PI染色的 细胞核呈现亮红色荧光，在细胞生物学研究中用于观察细胞核的定位、 结构和形态改变。
随着材料科学的日益发展，无机染料荧光半导体纳米颗粒量子点 (Quantum dots ， QDs )其独特的光学特性在20世纪70年代就引起 物理学家、化学家、电子工程学家的广泛关注。量子点是由II-VI族元 素(如CdSe、 CdS等)或III- V族元素(如InP、 InAS)组成的尺寸小 于lOOnm的半导体纳米微晶体。1997年以来，随着量子点制备技术的 不断改进，量子点逐渐用于生物医学领域的研究。与有机荧光染料相 比，在激发光波长范围量子点具有更好的光稳定性，荧光度强，激发 光谱宽，发射光谱窄并且对称分布、不易被光解或漂白，它的发光强度比有机荧光染料分子至少强20倍，光化学稳定性提高100 ~ 200倍 [Chan WCW， Maxwell DJ， Gao XH， et al. Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging"]. Curr Opin Biotechnol， 2002; 13(1): 40-46.Jaiswal JK， Mattoussi H， Mauro JM， et al. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates [J]. Nat Biotechnol, 2003; 21(1): 47-51]。这些特性决定了量子点是用于生物检测与成像技术的令人满意的 多元才示^己净勿[Gao XH and Nie SM. Quantum dot—encoded mesoporous beads with high brightness and uniformity: Rapid readout using flow cytometry [J]. Analytical Chemistry 2004; 76(8): 2楊-2410. Gao XH and Nie SM. Doping mesoporous materials with multicolor quantum dots [J]. Journal Of Physical Chemistry B 2003; 107 (42): 11575—11578.Han MY. et al. Quantum-dot-tagged microbeads for mulUplexed opticalcoding ofbiomolecules [J]. Nature Biotechnology 2001; 19 (7): 631-635]。生物学常用的量子点包括 一个硒化镉(CdSe)核心和一个被相应配基包被的溶于水的外壳(如 硫化锌，ZnS)构成。这种内核与外壳结构钝化了 CdSe核心的表面， 使之产生很高的光激发量子点产量，并保持光稳定性[Dabbousi BO. et al. (CdSe) ZnS core-shellquantum dots:Synthesis and characterization of a size series of highly luminescent nanocrystal1ites[J]. Journal of Physical Chemistry B 1997; 101 (46): 9463-9475]。不同粒径的量子点，可以产生不同颜色的荧光。 经激发光照射后，不同大小量子点材料可产生不同颜色的焚光[Smith AM， Dave S， Nie S， et al. Multicolor quantum dots for molecular diagnostics of cancer [J].Expert Rev Mol Diagn， 2006; 6 (2): 231-244]。由于量子限制效应，材料的能级由大小决定，量子点 的激发光也如此。通过改变纳米颗粒的大小和化学组成，量子点的发 射光波长范围可涵盖从紫外到红外区间[Bailey, RE and Nie SM. Alloyed semiconductor quantum dots:Tuning the opticalproperties without changing the particle size[J]. Journal of The American Chemical Society 2003; 125(23): 7100-7106]。量 子点的激发光谱范围很宽，在单一激发光波长下可见不同颜色的量子 点。不同大小的量子点，各自以不同波长为中心发射出一个很窄的居 中对称峰。近年研究发现，将量子与细胞特殊分子的靶向物质，如抗 体、链亲和素-生物素系统结合，可实现对细胞内特殊分子的标记及 其长时间示踪成像[Lidke DS， Nagy P， Heintzmann R, et al. Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction [J]. Nat Biotechnol, 2004; 22 (2):198-203. So MK，Xu CJ，Loening AM，et al. Self-i 1 luminat ing quantum dot conjugates for in vivo imaging [J〗. Nat Biotechnol, 2006; 24 (3) : 339- 343. Wang Q， Xu Y, Zhao X， et al. A facile one—step in situ functionalization of quantum dots with preserved photoluminescence for bioconjugation. J Am Chem Soc. 2007, 129 (20): 6380-6381]。但是，目前国内外尚无在联 合应用量子点与DAPI或者PI的基础上，直接运用量子点独特光学性 质，不经特殊靶向分子介导的细胞核稳定多色长期示踪的标记技术。
发明内容
要解决的技术问题
在细胞生物学研究中，用于细胞核荧光标记的有机荧光染料，如 DAPI、 PI等， 一方面，这些有机荧光染料的主要缺点是光稳定性差， 所发出的荧光在激发光持续照射下迅速发生光漂白(通常持续照射3 分钟后荧光信号很快消失)，很难长时间保持细胞核的焚光标记状态 [Wu XY， Liu HJ， Liu JQ， et al, Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots [J]. Nat Biotechnol, 2003; 21(1): 41-46]。另一方面，当观察细胞核与细胞中多种分子或细胞器的相互 定位关系时，涉及多重荧光标记，需要在同一位置从不同荧光通道中记录不同分子的定位信息，细胞核经过持续荧光照射后荧光定位信号
迅速衰减。例如，联用DAPI标记细胞核、用交联了 FITC的抗细胞角 蛋白抗体(FITC-cytokeratin)联合示踪胞浆角蛋白时，在显微镜下 反复对比观察同一细胞的细胞核和不同细胞器荧光定位时，焚光信号， 尤其是被PAPI染为蓝色的细胞核荧光信号衰减十分迅速，很难全部记 录定位信息和对细胞核长时间示踪。因此，需要开发长期稳定荧光标 记细胞核的示踪方法和产品。 一方面，常规的细胞核焚光染料，如DAPI 和PI，只能使细胞核发出蓝色或红色荧光，而蛋白质对不同焚光染料 具有特殊偏好性，当观察细胞中多种分子的荧光多重定位信息时，需
要研发具有多种荧光颜色的细胞核标记物质，以便实现对细胞核的选 择性多色荧光标记。
另一方面，单纯利用量子点独特的光学优势尚不能实现对细胞核 的选择性定位。利用量子点独特的光学特性实现对细胞核选择性标记 还需要先将量子点与核定位的导向分子，如抗体、链亲和素-生物素 系统或细胞核定位信号(nuclear localization signals, NLS )等 分子交联才能对细胞核进行定位标记，导致采用量子点对细胞核进行 荧光标记步骤繁瑣，效率低下。
所采用的技术方案
为克服使用常规有机荧光染料DAPI或PI和无机染料量子点在细 胞核染色中的上述缺陷，本发明进行了多方面研究，结果出人意料地 发现，当联合使用DAPI或PI与量子点对生物样品细胞核进行荧光标 记时，粒径范围在5 - 2 0 nm之间的表面经羧基化修饰的量子点与DAP I 或PI联合施用到生物样品，经过波长340-380nm的紫外光照射激发， 结果与染色体DNA结合的DAPI或PI和量子点表面发生不可逆的化学 结合反应，量子点不可逆地与细胞核染色体DNA结合，在焚光显微镜 下标记样本用400-700nm波长激发照射时细胞核呈现稳定的荧光，从 而实现了对生物样品的细胞核稳定的选择性示踪标记。
更具体地，本发明提供了下述生物样品的细胞核的焚光标记方法 1)施用粒径范围5-20 run的羧基化量子点到生物样品，使之为3-80 nM量子点/l()5个细胞；
2) 使量子点与生物样品共孵育；
3) 再施用有机荧光染料到生物样品；
4) 对生物样品进行340-380nm的紫外激发光照射，使之发生与 染色体DNA不可逆地结合，然后转到波长400-700rnn的激发光下观察。
任选地，在本发明的方法中，步骤1)中的生物样品是细胞；或 者步骤l)中的生物样品，105个细胞培养于直径3. 5cm的培养皿中； 或者步骤l)中生物样品来自哺乳动物；或者步骤l)中的生物样品来 自人。
任选地，在本发明的方法中，步骤2)中的孵育条件为I、标记 活细胞细胞核时量子点与细胞在37'C共孵育10-24小时，使用含10 %胎牛血清的细胞培养液的緩冲体系；II、标记固定于玻片上细胞的 细胞核时量子点与细胞在室温下共孵育1小时，使用2。/。BSA的緩冲 体系。
任选地，在本发明的方法中，上述步骤1)中的量子点的施用可 以在细胞培养过程中，或者细胞固定后施用。
任选地，在上述步骤2、 3之间和/或步骤3、 4之间还包括洗涤 步骤。
任选地，其中步骤3中的有机荧光染料是DAPI或者PI，当是DAPI 的情况下，使用的浓度为5-20 nM DAPI/1()5个细胞，当是PI的情况 下，使用的浓度为10-20 nM PI/1()5个细胞。
任选地，其中步骤3中的有机荧光染料是DAPI或者PI，也包括 溴化乙锭(Ethidium Bromide, EB)及其4汙生物、丫咬橙(Acridine orange， AO) 、 Hoechst 33258和Hoechst 33342等常用有机荧光染料。
任选地，在上述步骤4中的紫外激发光的波长范围在10-400nm， 进一步优选254-380nm，更优选340 - 380nm。
任选地，在上述步骤4中将生物样品置于焚光显微镜下。
任选地，在上述步骤4之后将生物样品保藏在常温、4。C或者-70 。C环境下。此外，在本发明的方法中采用的羧基化量子点的粒径范围优选5 -20nm，进一步优选5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20認。
所述的荧光标记对象包括细胞、组织和动物的细胞核染色体DM。 适用本发明的方法、试剂盒和方法的适当的细胞类型包括胚胎时期内 胚层、中胚层和外胚层分化的所有类型的正常细胞和肿瘤细胞，其包 括但不限于唇癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、甲状腺癌、食管癌、胃 癌、肠癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌、外阴癌、 阴道癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、阴茎癌、前列腺 癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、尿道癌、眼睑癌、结膜癌和泪腺癌，以 及实验室常规采用的体外培养细胞系C0S-7细胞、CHO细胞、NIH3T3 细胞、BHK-21细胞、HeLa细胞、10T1/2细胞、HepG2细胞、EC0156 细胞、PL45细胞等。优选NIH3T3细胞、BHK-21细胞、HeLa细胞、10T1/2 细胞、HepG2细胞、EC0156细胞、PL45细胞，进一步优选HepG2细胞、 10T1/2细胞、PL45细胞和EC0156细胞，还优选10T1/2细胞、PL45 细胞和EC0156细胞，最优选EC0156细胞；适用本发明的细胞可以是 死细胞，也可以是活细胞，优选在免疫组化的过程中使用的细胞。
适用本发明的方法和试剂盒的组织包括各种动物来源的组织，所 述动物可以是两栖类、哺乳类等的动物，例如斑马鱼、非洲爪蟾、 小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、狗、猴子等；优选小鼠、大鼠、豚鼠、兔 子；还优选小鼠、大鼠；最优选小鼠。
本发明还提供了如下的试剂盒，其中包括(l)标记液，所述标 记液中含有DAPI或PI和量子点，其中量子点是被表面羧基化的，其 粒径范围为5-20nm。所用的量子点的包装为可以配制成工作浓度为 5-80nM量子点/105个细胞的母液形式(如浓度为4 p M )，而且其中 的量子点可以配制在用于细胞培养的培养基緩沖液中，还可以配制在 生理盐水緩冲液或者适合标记细胞核的其它本领域公知的緩沖液中， 工作温度为37°C，也可以在室温。其中DAPI的包装成可以配制成工 作浓度5-20nM /105个细胞的母液(如浓度为6 mM)或者粉末状态；PI包装成可以配制成工作浓度10-20nM/l()5个细胞的母液(如浓度为 lmM)或者粉末状态。所述试剂盒还包括细胞标记、免疫组化等常规使 用的(2)固定液，(3)封片液等，此外，所述试剂盒还可以包括(4) 说明书。所述说明书具体阐述了试剂盒中所含试剂外，还具体阐述了 如何通过前述方法实施所述的焚光标记。
有益效果
通过实验l^证，发明人发现本发明与现有传统有机荧光标记细胞 核的技术相比具有以下优点和效果
1. 成像稳定，在相同的激发光连续照射下，本发明荧光标记的 细胞核具有很强的抗光淬灭能力，其荧光半衰期(1-3天)是DAPI 和PI为代表的传统有机荧光染料荧光淬灭时间(2-5分^t)的1000 - 3000倍。
2. 标记简便、快捷。
3. 荧光标记信号保存时间长，本发明荧光标记的细胞核在4'C 避光条件下保存超过1-3年，优选至少60 - 90天，荧光定位信息仍 然存在，而传统有机荧光DAPI或PI标记的细胞核荧光信号仅能保存 10-20天，最长一个月后荧光定位信息完全淬灭。本发明荧光标记的 细胞核在-20。C或-8(TC避光条件下保存时间更长。
4. 适用广泛，经过多种实验验证本发明的标记方法和试剂盒， 量子点的摄入对于多种固定的细胞和培养的活细胞而言是通用的，进 而所述方法和试剂盒可以进一步应用到流式细胞仪和组织染色，例如 免疫组织化学等中。
5. 成本低廉、方法简单，操作方便，实用性强，本发明与目前 国内外的量子点荧光标记技术方法相比，不必先将量子点与抗体、链 亲和素-生物素系统或细胞核定位信号(NLS )等细胞核定位导向分子 连接，而直接采用游离的量子点标记，节省了中间步骤。
6. 通过选择不同粒径的量子点，可以实现对细胞核的多色荧光 标记，如蓝色、绿色、黄色、红色、桔红色等。
图l是用本发明的方法对固定的食管癌细胞系EC0156细胞的量子 点荧光标记细胞核的成像结果。按照本发明的实施例1固定细胞标记 方法和条件，通过荧光显微镜下观察得到了清晰的食管癌细胞EC0156 细胞核的标记成像(a-c， g-i)。 a、 g是未经紫外激发的绿色荧光成 像；b、 h为有机荧光染料DAPI标记的细胞核区域；c、 i为紫外激发 后，细胞核被量子点标记为绿色。按照本发明的实施例2培养的活细 胞量子点与PI标记方法和条件，通过荧光显微镜，得到了清晰的食管 癌细胞EC0156细胞核的标记成像U-f， j-l) 。 d、 j是未经紫外激 发的绿色荧光成像，e、 k为有机荧光染料PI标记的细胞核区域，f、 l为紫外激发后，细胞核被量子点标记为绿色。
图2是用本发明的方法对不同细胞系细胞核进行荧光标记得到的 成像结果。为了进一步证明本技术细胞核荧光标记的通用性，选用了 不同的细胞系，包括人胰腺癌细胞PL45、人食管癌细胞EC0156和小 鼠成纤维细胞10T1/2,按照本发明的实施例3的固定于玻片上细胞的 细胞核标记方法和条件，通过荧光显微镜，得到了三种细胞系分别经 DAPI或PI与绿色量子点结合后的清晰细胞核荧光标记成像。左侧是 未经紫外激发的绿色荧光成像(a、 d、 g、 j、 m、 p)，中间为有机荧 光染料DAPI标记的细胞核(b、 h、 n)和PI标记的细胞核(e、 k、 q)， 右侧为紫外激发后，细胞核内呈现明亮的绿色量子点标记(c、 f、 i、 1、 o、 r)。
图3为本发明量子点快速标记细胞核的实验结果。按照上述本发 明的活细胞标记方法和条件，标记好的细胞，在焚光显孩吏镜下，经紫 外激发5秒，10秒，15秒和120秒后，分别获取一张绿色荧光图像， 可见不同时间点细胞核内荧光强度的递增情况。
具体实施方式
本申请所要求保护的范围并不局限于所述的实施例。
实施例1:不同量子点标记固定于玻片上细胞的胞核
为了选择合适的量子点联合有机焚光染料标记细胞核，申请人选
择产自北京涌源亮点纳米科技有限公司和本领域熟知的美国Invitrogen公司的绿色的量子点(分别命名为QD1和QD2 )验证所述方法是否能够标记细胞核，联合使用有机荧光染料DAPI或PI和量子点对固定的人食管癌细胞系EC0156细胞进行细胞核标记。具体如下
联合使用DAPI步骤如下
1. 人食管癌细胞系EC0156细胞[Wang， Q. ; Xu， Y. ; Zhao， X.;Chang， Y.; Uu， Y.; J"ng， L.; Sharma， J.; Seo， D" Yan， H. AFacile 0ne-Step in situ Functiona1ization of Quantum Dots withPreserved Photoluminescence f or Bioconjugat ion J. Am. Chem. Soc.2007， 129， 6380-6381]培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基(美国Gibco BRL公司，Grand Island, NY, USA)中，于37°C,含5 % C02条件下培养。每两天更换培养液，每3 5天传代一次。
2. 细胞培养玻片的处理，将20mm x 20mm盖玻片用水洗净，放入石克酸-重铬酸钾液(浓疏酸lQQml，重铬酸钾lQQg，蒸镏水lQQOml)浸泡1天，自来水沖洗30次，蒸馏水洗涤10次，浸泡入100%乙醇中，备用。
3. 细胞爬片制备，将盖玻片平铺于六孔细胞培养板中，0.01%多聚赖氨酸400ul处理盖玻片30分钟。用0. 125%胰蛋白酶(美国Amresco公司，Solon， Ohio, USA)消化细胞，按2 x lo5细胞/孔接种，于37。C，含5%0)2条件下培养。
4. 细胞经1 x PBS溶液(137mMNaCl， 2.7mMKCl， 10mMNa2HPO"2 mM KH2P04, pH7. 4 )洗涤2次，每次2-5分钟。
5. 细胞经4。/。多聚曱醛-PBS固定液固定30分钟，每张盖玻片
2ml。
6. 用1 xPBS溶液洗涤细胞3次，每次2-5分钟。7. 滴加0.06% (体积/体积)Triton X-100溶液lml,室温处理细胞10分钟。
8. 用1 x PBS溶液洗涤细胞3次，每次2-5分钟。
9. 用含2。/qBSA(美国Sigma/>司，Saint Louis, Missouri, USA)的1 x PBS溶液，室温封闭30分钟。
10. 将处理好的细胞分成两组。分别滴加绿色量子点QD1 (北京涌源亮点纳米科技有限公司产品，批号CB-G520 )或QD2 (美国Invitrogen公司产品，批号Q22031MP， Carlsbad, CA， USA)至终浓度为16nM，使量子点与固定于玻片上的细胞室温孵育1小时。
11. 用lxPBS溶液洗涤细胞3次，每次2-5分钟。
12. 滴力口 DAPI (美国Sigma/>司，Saint Louis, Missouri, USA)甘油緩冲液(DAPI 2ug/ral， 50%甘油)，用盖玻片封片。
13. 分别经波长488nm激发光照射、紫外光(380nm波长)照射激发量子点与DAPI标记的细胞核不可逆地结合，然后转绿色荧光激发光488nm波长照射下，观察细胞核成4象。
联合使用PI步骤步骤1-11同上。
12. 滴力口 PI (美国Sigma公司，Saint Louis, Missouri, USA)甘油緩冲液(PI 10ug/ml， 50%甘油)，用盖玻片封片。
13. 分别经波长488nm激发光照射、550認激发光照射观察PI标记的细胞核后、以紫外380nm照射激发量子点与PI标记的细胞核不可逆的结合，然后转绿色荧光激发光488nm波长照射下，观察细胞核成像。
结果具体可以参见图1，从图1中可以发现绿色量子点QD1和QD2在488nm激发光照射下主要存在于胞浆，标记细胞经紫外照射(380nm)激发后改用波长488nm激发的绿色荧光照射，可见细胞核被绿色量子点标记为亮绿色。
14. 除了分别使用6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、17、 18、 19和20nm的量子点QD1和QD2替换上述5認的量子点之外，在与实施例l的l-13相同的条件下重复试验，得到了与上面相似的结果。
变更QD1和QD2的浓度为10、 15、 20、 25、 30、 40、 50、 70、 80nM，在与实施例1的1 - 14相同的条件下重复试验，得到了与上面相似的结果。
实施例2:联合使用DAPI或PI和绿色量子点进行活细胞的胞核
标记
为了验证所述方法中量子点是否能与培养的活细胞共孵育，联合使用有机荧光染料DAPI或PI和量子点对体外培养的食管癌EC0156细l包的细力包核标i己。具体如下
联合使用PI标记步骤
1. 人食管癌细胞EC0156培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基(美国Gibco BRL/〉司，Grand Island, NY， USA)中，于37。C,含
5。/oC0 2条件下培养，每隔两天更换培养液，每3~5天传代一次。
2. 细胞培养玻片的处理，将20mrax 20mm盖玻片用水洗净，放入硫酸-重铬酸钾液(浓石克酸lQQm1,重铬酸钾100g，蒸馏水lGGOml)浸泡1天，自来水沖洗30次，蒸馏水洗涤10次，浸泡入100%乙醇中，备用。
3. 细胞爬片制备，将盖玻片平铺于六孔细胞培养板中，Q. 01%多聚赖氨酸400ul处理盖玻片30分钟。用0. 125%胰蛋白酶(美国Amresco公司，Solon， Ohio, USA)消化细胞，按2 x 105细胞/孑L接种，于37。C，含5%0)2条件下培养。
4. 24小时后，弃培养上清，加入含16nM的绿色量子点QD1 (北京涌源亮点纳米科技有限公司产品，批号CB-G520 )的完全培养液，共孵育24小时。
5. 用1 x PBS溶液洗涤细胞2次，每次2-5分钟。
6. 细胞经40/。多聚甲醛-PBS固定液固定30分钟，每张盖玻片
2ml。
7. 用1 x PBS溶液洗涤细胞3次，每次2-5分钟。8. 滴力口 PI (美国Sigma/>司，Saint Louis， Missouri, USA)甘油緩沖液(PI 10ug/ml， 50%甘油)，用盖玻片封片。
9. 分别经波长488nm激发光照射、550nm激发光照射观察PI标记的细胞核后、以紫外380nm照射激发量子点与PI标记的细胞核不可逆的结合，然后转绿色荧光激发光488nm波长照射下，观察细胞核成像。
联合使用DAPI标记步骤步骤1-7同上。
8. 滴力口 DAPI (美国Sigma 7>司，Saint Louis， Missouri, USA)甘油緩沖液(DAPI 2ug/ml， 50%甘油)，用盖玻片封片。
9. 分别经波长488nm激发光照射、紫外光(380nm波长)照射激发量子点与DAPI标记的细胞核不可逆地结合，然后转绿色荧光激发光488nm波长照射下，观察细胞核成像。
结果具体可以参见图1 (d-f， ，从图1 (i， 1)中可以发
现经过本发明的方法标记的细胞核显示出很强的绿色荧光，由此证明本发明的标记方法能够特异性对培养的活细胞核进行稳定的荧光标记。
实施例3:联合使用DAPI或PI和绿色量子点标记固定于玻片上的多种细胞的细胞核
为了验证所述方法是否能够标记固定于玻片上细胞的细胞核，联合使用DAPI或PI和绿色量子点分别对食管癌EC0156细胞、胰腺癌PL45细胞和小鼠成纤维细胞10T1/2进行细胞核标记。具体如下
联合使用DAPI步骤
1. 人食管癌细胞EC0156，人胰腺癌细胞PL45和小鼠成纤维细胞10T1/2培养于含100/。胎牛血清的DMEM培养基(美国Gibco BRL公司，Grand Island, NY， USA)中，于37。C，含5%(:02条件下培养，每隔两天更换培养液，每3 5天传代一次。
2. 细胞培养玻片的处理，将20mmx 20mm盖玻片用水洗净，放入硫酸-重铬酸钾液(浓硫酸lQQml，重铬酸钾lQQg，蒸馏水10G0ml)浸泡1天，自来水沖洗30次，蒸馏水洗涤10次，浸泡入100%乙醇中，备用。
3. 细胞爬片制备，将盖玻片平铺于六孔细胞培养板中，0.01%多聚赖氨酸400ul处理盖玻片30分钟。用0. 125%胰蛋白酶(美国Amresco公司，Solon, Ohio, USA)消化细胞，按2 x 105细胞/孔接种，于37。C，含5%(:02条件下培养。
4. 细胞经1 x PBS溶液(137mMNaCl， 2.7mMKCl， 1 OmM Na2HP04，2 mM KH2P04， pH7. 4 )洗涤2次，每次2-5分钟。
5. 细胞经4。/。多聚甲醛-PBS固定液固定30分钟，每张盖玻片
2tnl。
6. 用1 x PBS溶液洗涤细胞3次，每次2-5分钟。
7. 滴加0. 06% (体积/体积)Triton X-100溶液lml，室温孵育细胞IO分钟。
8. 用1 x PBS溶液洗涤细胞3次，每次2-5分钟。
9. 用含2% BSA(美国Sigma公司，Saint Louis, Missouri, USA)的lxPBS溶液，室温封闭30分钟。
10. 将处理好的细胞滴加终浓度为16nM的绿色量子点QD1 lOOul，室温与细胞共孵育1小时。
11. 用1 xPBS溶液洗涤细胞3次，每次2-5分钟。
12. 滴力口 DAPI (美国Sigma 7>司，Saint Louis, Missouri, USA)甘油緩沖液(DAPI 2ug/ml， 50%甘油)，用盖玻片封片。
13. 分别经波长488nm激发光照射、波长380nm的紫外光照射激发量子点，使之与DAPI标记的细胞核不可逆地结合，然后转绿色荧光激发光488nm波长照射下，观察细胞核成像。
联合使用PI步骤步骤l-ll同上。
12. 滴力口 PI (美国Sigma 7>司，Saint Louis， Missouri, USA)甘油緩沖液(PI lOug/ml, 50%甘油)，用盖玻片封片。
13. 分别经波长488nm激发光照射、550rnn激发光照射观察PI标记的细胞核后、以紫外380nm照射激发量子点与PI标记的细胞核不可 逆的结合，然后转绿色荧光激发光488nm波长照射下，观察细胞核成 像。
结果具体可以参见图2，从图2中发现经过本发明的方法标记 的细胞核显示出很强的绿色荧光，而且对人食管癌细胞EC0156 (a-c 联合使用DAPI; d-f联合使用PI)、人胰腺癌细胞PL45 ( g-i联合使 用DAPI; j-l联合使用PI )和小鼠成纤维细胞10T1/2 ( m-o联合使用 DAPI; p-r联合使用PI )等三种细胞都取得了相似的结果，由此证明 本发明的标记方法适用于各种固定于玻片上细胞(例如包括正常细胞 和肿瘤细胞)的细力包核标记。所述方法能够特异地对细力包核进4于稳定 的荧光标记。
实施例4:联合有机荧光核染料PAPI和量子点的细胞核标记稳定 性检测为了检测所述方法联合有机荧光核染料PAPI/PI和量子点的 细胞核标记稳定性，选用食管癌EC0156细胞制作玻片上细胞爬片，经 过固定，联合使用DAPI或PI和绿色量子点进行细胞核标记。具体如 下
步骤1 ~ 9.同实施例三，把待标记的EC0156细胞分成3组，组1 单纯用DAPI或PI标记(同实施例三.12 );组2单纯用量子点孵育(同 实施例三.10、 11);组3量子点孵育后用DAPI或PI标记(同实施例 三.IO-12);。在荧光显微镜观察时，组l细胞用紫外激发后，并在 第l-5秒、10秒、30秒、5分钟、15分钟、30分钟、8小时、24小 时、10天和30天分别获取经DAPI标记的细胞核蓝色荧光图像或PI 标记的红色细胞核荧光图像；组2、 3细胞用紫外激发后，再用488nm 或550nm激发光照射，并在第1-5秒、10秒、30秒、5分钟、15分钟、 30分钟、8小时、24小时、10天和30天分别获取经绿色量子的标记 的细胞核绿色荧光图像。标记的细胞片保存在4'C。用分值表示荧光 强度的强弱，其中共分为l-5个等级，其中，l表示不可见；2表示可 见，但很弱；3表示可见，荧光较弱；4表示荧光较强，视野内荧光明 亮，5表示很强，视野内荧光很亮。常温下标记荧光的稳定性检测结果如表1所示:
表l.联合有机荧光核染料DAPI或PI和量子点的细胞核标记稳定性
l-510305153082410306090
秒秒秒W中树转小时小时天天天天
DAPI单独标记55555432211
PI单独标记555555543211
单独量子点标记111111111111
DAPI和量子点5555555544
联合标记
PI和量子点555544
联合标记
改变所用的标记量子点的粒径，将5nm变更为6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、或20認也得到了相似的结果。通 过上述实验可知，本发明的方法对生物样品细胞核的标记具有很好的 稳定性，在长达6 0-9 0天的时间内还能保持很强的荧光标记信号。
权利要求
1. 稳定荧光标记细胞核的方法，所述方法包括下述步骤1)施用粒径范围5-20nm的羧基化量子点到生物样品，使量子点为3-80nM量子点/105个细胞；2)使量子点与生物样品共孵育；3)再施用有机荧光染料到生物样品；4)对生物样品进行340-380nm的紫外激发光照射5-10秒后，在400-700nm波长的激发光照射下观察细胞核。
2. 权利要求l的方法，其中在上述步骤2)、 3)之间和/或步骤 3)、 4)之间还包括洗涤步骤。
3. 权利要求l的方法，其中步骤l)中的生物样品是细胞。
4. 权利要求1的方法，其中步骤1)中的生物样品来自包括人 在内的哺乳动物。
5. 权利要求l的方法，其中步骤2)中的孵育条件为I、标记 活细胞细胞核量子点与细胞在37X:共孵育10-24小时，使用含10 %胎牛血清的细胞培养液的緩冲体系；II、标记固定于玻片上细胞的 细胞核时量子点与细胞在室温下共孵育1小时，使用2。/。BSA的緩沖 体系。
6. 权利要求l的方法，其中步骤3)中的有机荧光染料是DAPI 或PI。
7. 权利要求l的方法，其中步骤3)中的有机荧光染料是DAPI 的情况下，使用的浓度为5-20 nM DAPI/1()5个细胞，是PI的情况下， 使用的浓度为10-20 nM PI/1()S个细胞。
8. 荧光标记细胞核的试剂盒，其中含有粒径范围5-20 nm的羧 基化量子点、有机荧光染料和说明书。
9. 权利要求8的荧光标记细胞核的试剂盒，其中的有机荧光染料 是DAPI或PI。
全文摘要
本发明涉及稳定荧光标记细胞核的方法和试剂盒，具体而言，本发明提供了联合使用半导体纳米材料量子点和有机荧光染料DAPI或PI对细胞核进行荧光标记的方法，及含有上述量子点和DAPI或PI的用于细胞核稳定荧光标记的试剂盒，通过本发明的方法和试剂盒可简便易行、高效稳定地对细胞核进行荧光标记，为细胞的长时间观察研究提供了细胞核稳定示踪的实验方法，所述方法和试剂盒可以用于细胞或组织等的长期示踪。
文档编号G01N21/64GK101531993SQ20081008460
公开日2009年9月16日 申请日期2008年3月12日 优先权日2008年3月12日
发明者乔媛媛, 平 何, 王强斌, 董乔梅, 杨 许, 赵晓航, 颢 颜 申请人:中国医学科学院肿瘤研究所;中国人民解放军海军总医院