专利名称：检测水产品食物过敏原基因的实时荧光pcr方法
技术领域：
本发明涉及食物过敏原基因的检测，特别是涉及检一种检测水产 品食物过敏原基因的实时荧光聚合酶链式反应(PCR)方法，该方法 主要用于鱼类小清蛋白(Par)和甲壳类原肌球蛋白'(TM)基因的实 时荧光PCR检测。
背景技术：
食物过敏医学上也称变态反应。引起食物过敏反应的物质叫做食 物过敏原，如鱼、虾、蟹、牛奶、蛋类等。其反应机理为过敏原进入 机体以后，会导致机体发生正常或过度免疫应答，即超敏反应。当再 次接触相同过敏原时多个IgE分子和抗体结合，引起IgE的Fc端结 构改变，导致细胞脱颗粒，释放组胺、5-羟色胺、白三烯等生物呼吸 活性物质并作用于效应器官，表现为平滑肌收縮、毛细血管扩张、通 透性增加、皮肤过敏、呼吸道过敏、造血系统过敏甚至过敏性休克(赵 俊芳，等.食物过敏原检测及其应用前景.中华检验医学杂志，2007， 8: 948-950)。
近年来食物过敏问题已引起广大消费者、食品生产者和科学研究 者的普遍关注。根据流行病学调査，全球约有2%-2. 5%的成人受到食 物过敏疾病的困扰，婴幼儿的发病率更高，达到4%-6%，儿童约为 2%-3%。在联合国粮农组织公布的全球八大类过敏食物中，鱼类和甲 壳类水产品是其中重要的两大类，其主要过敏原分别为鱼类小清蛋白 (Par)和甲壳类原肌球蛋白(TM) (Food and Agriculture Organization. Report of the FAO technical consultation on foodallergies. Rome, Italy. 1995.)。
对于食物过敏目前无特别的治疗方法，严格避免接触过敏食物是 最有效的方法。常用的检测过敏原方法有体内过敏原点刺试验、体外 检测特异性IgE (RAST抑制实验和EAST抑制实验)、双盲食物激发 试验和酶联免疫吸附试验等。这些方法中，体内过敏原点刺试验易出 现假阳性；RAST抑制实验和EAST抑制实验的不足是对人体血清的依 赖性，血清是很难保证一致的，因此该方法难以标准化；双盲食物激 发试验易受其它因素影响，实践中也不易操作，实验剂量、安慰剂及 双盲控制等环节还有待完善；酶联免疫吸附试验对于微量蛋白难以检 测(赵俊芳，等.食物过敏原检测及其应用前景.中华检验医学杂志， 2007， 8: 948-950)。
近年来基因检测方法(如PCR、核酸杂交)以其敏感性高、特异 性好、操作简便而倍受检验工作者的青睐。但是常用的PCR检测技术 仍需经历一个对扩增产物进行电泳分析的过程，时间耗费在所难免， 而且电泳过程中所使用的溴化乙啶染料对人和环境都有不同程度的 危害 (Lee C Y, et aL Detection of pathogenic bacteria in shellfish using multiplex PCR followed by CovaLink NH microwell plate sandwich hybridization. Journal of Microbiology Methods, 2003， 53: 199-209)。实时荧光PCR的扩增与产物分析全过程均在 单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对PCR检测进行实时 监测和自动分析的目标，也从根本上解决了常规PCR可能发生的假阳 性污染问题。但目前尚无采用实时荧光PCR方法来检测水产品食物过 敏原基因，因此，公众迫切需要将水产品食物过敏原基因检测方法应 用于实践
发明内容
本发明的目的在于提供一种可定量、快速、灵敏检出水产品食物
过敏原的实时荧光PCR方法。
为实现上述目的，本发明的技术解决方案是提取样品总RNA， 通过SYBR Green或TaqMan探针法实时荧光PCR技术分别检测水产品 食物过敏原基因Par和TM，以及内标基因P-actin，依据扩增动力 学曲线和Ct值对检样进行结果分析。
本发明具体包括以下步骤-
(1) 设计合成用于检测水产品食物过敏原的3组引物及探针。 Par基因的上游引物5， -ATGGCATTCGCTGGAATTCTG-3'， Par基因的下游引物5， -TGCCATTTATGCCTTGACCAG-3'，
Par基因的探针5， -FAM-AGGGCTGCCAAGCTGCTGACTCC-TAMRA-3，； TM基因的上游引物，TM-1: 5， -CGCATGGACGCCATCAAGAAGAAGATG -3，，
TM基因的上游引物5， -AGGTTMTAGCCAGACAGTTCGCT-3，， TM基因的探针5， -FAM-AGCAGCTGTCCGCCGCTAACACTAAG -TAMRA-3，；
actin基因的上游引物5， -AGAGCAAGAGAGGTATCTTGA-3，， actin基因的上游引物5， -GGCGGTCTCGTGGATACCAG-3，， actin基因的探针5' -FAM- CACGGCATCATCACTAACTGGGACGA -TAMRA-3'。
(2) 实时荧光PCR检测。配制荧光PCR扩增反应体系，体系含有 PCR缓冲液、MgCl2、 dNTP、逆转录酶、RNase抑制剂,DNA聚合酶、 上游引物和下游引物、Oligo dT15、 RNA模板、灭菌超纯水(注探 针法需添加TaqMan探针)；荧光PCR扩增反应条件为45_55匸逆转 录20-40min; 93-95。C预变性3—lOmin; 93-95°C/30-60S， 50_60°C/30-60S， 72°C/40-90S， 35-45循环(注:采用SYBR Green法需设 置6(TC到95-C的熔解曲线分析)；检测设立阳性对照(水产品肌肉 总RNA)、阴性对照(猪肉总RNA)和空白对照(灭菌超纯水)。反 应结束后，依据荧光PCR仪器的分析软件，求出每个样品的Ct值， 依据Ct值和扩增动力学曲线对检样进行分析。
本发明可以制成用于检测水产品食物过敏原基因的实时荧光PCR 试剂盒。
由于本发明采用SYBR Green或TaqMan探针法实时荧光PCR检测 水产品食物过敏原基因。SYBR Green是一种与DNA双链结合的荧光 染料，当与DNA双链结合时发出荧光；当DNA解链时，SYBR Green 被释放出来，荧光信号急剧减弱，反应体系中荧光信号强度代表了双 链DNA分子的数量；但SYBR Green染料能与所有DNA双链结合，因 此必须设置熔解曲线来分析扩增产物的特异性(即目标核酸序列的熔 解温度，Tm) 。 TaqMan探针是一种能与PCR产物杂交的寡核苷酸探 针，探针两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团；探针完整时，报告 基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，DNA聚合酶的外 切酶活性将探针降解，破坏了两个荧光分子之间的能量传递，从而发 出荧光；切割下来的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，即荧光信 号的累积与PCR产物形成完全同步(Ke L D， et al. A reliability test of standard-based quantitative PCR - exogenous vs endogenous standards. Molecular and Cellular Probes， 2000， 14: 127-135)。本发明还在反应中设置了内标基因e-actin作为检 测质控，也可用于对目的基因的定量结果误差进行校正，P-actin 是构成细胞骨架的主要成分肌动蛋白的一种，它具有基因序列高度保 守、mRNA表达数量高且稳定的特点，常作为内标棊因被广泛使用(Neuvians T P， et al. Standardization strategy for quantitative PCR in human seminoma and normal testis. Journal of Biotechnology, 2005， 117: 163-171)。
本发明利用实时荧光PCR技术来检测水产品食物过敏原基因Par 和TM，相对于其它方法，该技术具有灵敏度高、检测时间短和可以 定量分析等优点，可用于水产品的未知品种或混合样品中过敏原基因 的定性筛选、定量分析和确认鉴定。 '
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
图1 TaqMan探针法荧光PCR (Par基因)扩增10倍梯度稀释鲤 鱼RNA的动力学曲线；
图2A SYBR Green荧光PCR (TM基因)扩增10倍梯度稀释锯缘 青蟹RNA的动力学曲线；
图2B梯度稀释锯缘青蟹RNA的SYBR Green荧光PCR产物的熔 解曲线；
图3 TaqMan探针荧光PCR检测未知样品中鱼类Par基因的动力 学曲线；
图4A SYBR Green荧光PCR检测未知样品中蟹类TM基因的动力 学曲线；
图4B SYBR Green荧光PCR检测未知样品中蟹类TM基因的产物 熔解曲线。
具体实施例方式
实施例l:用于检测鲤鱼Par基因的实时荧光PCR
用TaqMan探针荧光PCR法对10倍梯度稀释的鲤鱼肌肉总RNA进 行了 Par基因的检测，反应体系为PCR Master Mix 10nL、灭菌超纯水6. 4uL、 'MultiScribe Reverse Transcriptase 0.5"、 RNase Inhibiter 0.4uL、 Par基因上游引物0.5uL、 Par基因的下游引物 0. 5 u L、 Par基因的探针0. 3 u L、 Oligo dT15 1 u L禾卩RNA模板0. 4 uL。反应参数为48。C逆转录30min; 94。C预变性10min; 94°C/40S， 55°C/45S， 72°C/90S，共35循环。结果显示扩增动力学曲线呈典型 的S型，并随着样品浓度的降低而逐渐向后平移；Ct值随着样品浓 度的降低而逐渐增大(如图1所示)。
在图1中，TaqMan探针法荧光PCR (Par基因)扩增10倍梯度 稀释鲤鱼RNA的动力学曲线；A. 1:10稀释，Ct=15.3089; B. 1:100 稀释，Ct=16. 5373; C. 1:1000稀释，Ct二17.4470; D.. 1:10000稀释， Ct=19. 0486;
实施例2:用于检测锯缘青蟹頂基因的实时荧光PCR
用SYBR Green荧光PCR法对10倍梯度稀释的锯缘青蟹肌肉总 RNA进行了 TM基因的检测，反应体系为PCR Master Mix 10 "L、灭 菌超纯水6. 7uL、 MultiScribe Reverse Transcriptase 0. 5pL、 RNase Inhibiter 0. 4 u L、 TM基因上游引物0. 5uL、 TM基因的下游 引物O. 5uL、 Oligo dT15 luL和RNA模板O. 4uL。'反应参数为48 。C逆转录30min; 94。C预变性10min; 94°C/40S， 55°C/45S， 72°C/90S， 共35循环；设置6(TC到95'C的熔解曲线分析。结果显示扩增动力学 曲线呈典型的S型，并随着样品浓度的降低而逐渐向后平移；Ct值 随着浓度的降低而逐渐增大(如图2A所示)；扩增产物的熔解曲线 图谱显示其Tm为87"C，且只有一个特异性峰，表明无引物二聚体及 非特异性扩增出现(如图2B所示)。
在图2A中，SYBR Green荧光PCR (TM基因)扩增10倍梯度稀释锯缘青蟹RNA的动力学曲线；A. 1:10稀释，Ct=15.2523; B. 1:100 稀释，Ct=16.5799; C. 1:1000稀释，Ct=18.0974; D. 1:10000， Ct=20. 7475。
实施例3:未知样品中鱼类Par基因检测
用TaqMan探针荧光PCR法对未知样品中的鱼类Par基因进行了 Par基因的检测，具体条件参照实施例l。结果显示未知样品的扩增 动力学曲线呈典型的S型，阴性对照没有检测到荧光信号变化，表明 未知样品中含有鱼类Par基因(如图3所示)。
在图3中，TaqMan探针荧光PCR检测未知样品中鱼类Par基因的 动力学曲线；A.样品S-I， Ct二15. 2695; B.样品S-II， Ct=16. 0500; C.阴性对照，Ct=Undet。
实施例4:未知样品中蟹类TM基因检测
用SYBR Green荧光PCR法对未知样品中的蟹类TM基因进行了 TM基因的检测，具体条件参照实施例2。结果显示未知样品的扩增动 力学曲线呈典型的S型，阴性对照则没有检测到荧光信号变化，表明 未知样品中含有蟹类TM基因(如图4A所示)；阳性扩增产物的熔解 曲线图谱显示其Tm为87。C，且只有一个特异性峰，阴性对照中没有 出现熔解特异性峰，表明阳性产物为特异性扩增(如图4B所示)。
在图4A中，SYBR Green荧光PCR检测未知样品中蟹类TM基因 的动力学曲线；A.样品S- I , Ct二15.2204; B.样品S-II ， Ct二16.2523; C.阴性对照，Ct=Undet。
权利要求
1、一种检测水产品食物过敏原基因的实时荧光PCR方法，其特征在于其步骤包括提取样品总RNA，通过SYBR Green或TaqMan探针法实时荧光PCR技术分别检测水产品食物过敏原鱼类小清蛋白(Par)和甲壳类原肌球蛋白(TM)基因，以及内标基因β-actin，依据扩增动力学曲线和Ct值对检样进行结果分析。
2、 根据权利要求1所述的检测水产品食物过敏原基因的实时荧 光PCR方法，其特征在于具体包括以下步骤(1) 设计合成用于检测水产品食物过敏原的3组引物及探针； Par基因的上游引物5， -ATGGCATTCGCTGGAATTCTG-3，， Par基因的下游引物5， -TGCCATTTATGCCTTGACCAG-3，，Par基因的探针5, -FAM-AGGGCTGCCMGCTGCTGACTCC-TAMRA-3，； TM基因的上游引物，TM-1: 5， -CGCATGGACGCCATCAAGAAGAAGATG -3，，TM基因的上游引物5， -AGGTTAATAGCCAGACAGTTCGCT-3，， TM基因的探针5， -FAM-AGCAGCTGTCCGCCGCTAACACTAAG -TAMRA-3';actin基因的上游引物5， -AGAGCMGAGAGGTATCTTGA_3，， actin基因的上游引物5， -GGCGGTCTCGTGGATACCAG-3，， actin基因的探针5， -FAM-CACGGCATCATCACTAACTGGGACGA -TAMRA-3，。(2) 实时荧光PCR检测。配制荧光PCR扩增反应体系，体系含有 PCR缓冲液、MgCl2、 dNTP、逆转录酶、RNase抑制剂、DNA聚合酶、 上游引物和下游引物、01igodT15、 RNA模板、灭菌超纯水；荧光PCR扩增反应条件为45-55。C逆转录20-40min; 93-95°(3预变性3-10min; 93-95°C/30-60S， 50-60。C/30-60S， 72。C/40-90S， 35-45循环；检 测设立阳性对照、阴性对照和空白对照；反应结束后，依据荧光PCR 仪器的分析软件，求出每个样品的Ct值，依据Ct值和扩增动力学曲 线对检样进行分析。
3、 根据权利要求1和2所述的检测水产品食物过敏原基因的实 时荧光PCR方法，其特征在于通过SYBR Green或TaqMan探针法实 时荧光PCR技术分别检测水产品食物过敏原基因Par和TM。
4、 根据权利要求1和2所述的检测水产品食物过敏原基因的实 时荧光PCR方法，其特征在于可以制成用于检测水产品食物过敏原 基因的实时荧光PCR试剂盒。
全文摘要
本发明公开了一种检测水产品食物过敏原基因的实时荧光PCR方法，其步骤包括提取样品总RNA，通过SYBR Green或TaqMan探针法实时荧光PCR技术分别检测水产品食物过敏原基因Par和TM，以及内标基因β-actin，依据扩增动力学曲线和Ct值对检样进行结果分析。由于本发明利用实时荧光PCR技术来检测水产品食物过敏原基因Par和TM，相对于其它方法，该技术具有灵敏度高、检测时间短和可以定量分析等优点，可用于水产品的未知品种或混合样品中过敏原基因的定性筛选、定量分析和确认鉴定。
文档编号G01N21/64GK101434991SQ20081007173
公开日2009年5月20日 申请日期2008年9月4日 优先权日2008年9月4日
发明者刘光明, 曹敏杰, 蔡慧农 申请人:集美大学