专利名称：利用细胞自发荧光光谱测定细胞周期的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定细胞周期的方法，特别涉及一种利用细胞自发荧光光谱准确反映 细胞周期变化的方法。
背景技术：
细胞作为生命科学研究的基础， 一切生命的关键问题都要从细胞中寻找。生物的生殖 发育、遗传、神经(脑)活动等重大生命现象的研究都要以细胞为基础。植物与动物生长 发育是依靠细胞增殖、细胞分化与细胞凋亡来实现的， 一切疾病的发病机制也要以细胞病 变研究为基础。细胞分裂是生命起源最基本也最重要的过程。细胞生长和细胞分裂是所有 生物增殖的基本形式，细胞生长和细胞分裂的周期即为细胞增殖周期简称细胞周期(cell cycle)。对于真核细胞而言，其细胞周期由G1期、S期、G2期和M期组成，它是细胞全 部生理过程的综合体现，普遍存在于高等生物中。目前，细胞周期及其调控机制已在肿瘤、 干细胞移植、衰老、生殖和遗传学等领域显示出巨大的指导意义。
目前，对于细胞周期进行判定的研究方法主要有以下几种光学显微镜法、流式细胞 仪分析法(DNA含量分析)、3H-TdR标记法等。光学显微镜法主要是通过显微镜对细胞 的形态进行观察以判断细胞所处细胞周期，该方法是通过人眼观察，判断速度慢；流式细 胞仪分析法在细胞周期研究中应用广泛，但价格昂贵。从DNA含量入手，G1期和G2/M 期含有固定的DNA含量，分别为1倍和2倍，S期细胞的DNA含量介于1倍和2倍之间， 应用流式细胞仪就可通过监测细胞DNA含量的变化确定细胞周期的长短。但是由于G2 期和M期细胞的DNA含量都是2倍，故流式细胞仪无法区分G2期和M期细胞。3H-TdR 标记法是测定细胞的一种经典方法。但其测量中使用的放射性同位素要求专门设备，很容 易对操作者造成伤害和对环境造成污染，同时放射性同位素本身对细胞周期也有干扰且不
可避免。
细胞在细胞周期的变化过程中，细胞内部的氨基酸、蛋白质、核酸等物质都将随着细 胞的生长变化发生巨大的变化。组织细胞的荧光有两种 一种是自发荧光， 一种是继发荧 光。自发荧光是指细胞或组织不经荧光色素染色，在紫外光或短波长光的照射下所发出的
荧光。组织细胞经荧光色素染色后，细胞内某些成分和荧光色素结合后而呈现的荧光称为 继发性荧光。上述两种荧光光谱的变化都可以反应细胞周期的变化，其中自发荧光的变化 主要由蛋白质中的芳香族氨基酸和核酸引起，继发性荧光是荧光色素和细胞内的某些特定 成分结合后而呈现出不同颜色的专一性荧光，虽然这种荧光较强便于观察，但是用于产生 继发性荧光的荧光色素或染剂可能给细胞带来未知的副作用，给细胞生长造成影响。因此 利用细胞的自发荧光光谱法直接对细胞中的荧光团进行研究。核酸和蛋白质是细胞中产生 荧光的非常重要的两类物质。核酸的荧光量子产率很低，给检测带来较大的难度。蛋白质 构成细胞的大部分，占细胞干重的一半以上，在300 350nm范围显示出强荧光，它与生命 活动息息相关，在生物体内具有多种多样的功能。蛋白质固有荧光性质使得利用荧光光谱 法对其进行研究具有独特的优势，它具有天然荧光主要是因为芳香族氨基酸——酪氨酸、 色氨酸和苯丙氨酸。它们的相对荧光强度比为100:9:0.5，苯丙氨酸的最大发射波长为 282nm，酪氨酸304nm，色氨酸340nm。
目前，国内外通过建立细胞自发荧光光谱模型以对细胞的细胞周期进行判断还未见报道。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足，本发明的目的是提供一种能够对真核细胞的细胞周 期各阶段(Gl期、S期、G2期和M期)进行判断的简便方法，将细胞的荧光光谱信息同 细胞生长行为以及细胞增殖过程中生物化学反应对细胞内蛋白质的影响联系起来对细胞 周期进行判断。
本发明的目的是这样实现的利用荧光光谱法测定细胞周期的方法，其特征在于包括
如下步骤1)将某种细胞的单个细胞作为一个变化体系，用处于正常生长状态下的细胞
周期Gl期、S期、G2期和M期的单个细胞制成标准样品。利用荧光分光光度计或荧光光 谱仪测出被测细胞标准样品的最佳激发波长，即以该波长照射样品时，能获得相对强度最 大的荧光谱；
首先用250nm为激发波长在250~700nm范围进行扫描，得到细胞在250nm情况下的发 射光谱过后，测量250nm到发射光谱中的第一个荧光峰波长之间的激发光谱，找到激发光 谱中荧光强度最强的峰，这个峰所对应的波长即为被测细胞样品的最佳激发波长，最后以 最佳激发波长做激发光测量该波长到700nm间的荧光光谱，扫描间隔0. lnm;
对于在荧光光谱范围内只有一个荧光峰的情况，则直接利用该荧光峰强度与细胞周期 的关系建立模型通过荧光峰强度对细胞周期进行判别；对于在荧光光谱范围内有多个吸收
峰的情况，则建立距离激发波长最近的荧光峰强度与细胞周期的关系曲线，再利用该关系 对细胞周期进行判别；
2)利用荧光分光光度计或荧光光谱仪在最佳激发波长到700nm范围内，对被测样品 进行扫描，对所得光谱曲线进行预处理后，将被测样品光谱曲线的吸收峰强度与所述某种 细胞周期的荧光光谱模型的吸收峰强度对比，即可判断出被测细胞处于细胞周期的哪一阶 段。
该方法利用细胞在细胞周期(Gl期、S期、G2期和M期)变化过程中胞内荧光物质(如 氨基酸、核酸、蛋白质等)的不断变化对其荧光光谱的峰位、谱峰及峰强造成的影响，找 出这些参数与细胞所处周期的对应关系，建立特定细胞的细胞周期荧光光谱模型，最终利 用该模型实现对单个细胞周期的准确测定。该方法将一种常规方法用于对细胞周期的测 量，解决以往依赖流式细胞仪对细胞周期进行测定的较为繁琐的判别方法，而且能够对细 胞周期中处于G2期和M期的细胞进行区分，这是流式细胞仪无法实现的。
本发明方法制样简单、操作方便、仪器设备普遍、准确性高、测量速度快，应用细胞 荧光峰强度随细胞周期变化的关系，可很方便的对细胞的细胞周期进行判断，细胞样品无 需采用荧光染剂对染色，从而消除了荧光染剂的使用带来的副作用，使得细胞在测量后还 可用于后继培养和研究，有利于在生物医学研究过程中推广应用。
图1为Hela细胞细胞周期各阶段自发荧光光谱曲线图； 图2为荧光峰强度和细胞周期的关系图。
具体实施例方式
下面通过具体的实施例对本发明作进一步说明。 实施例利用荧光光谱法对Hela细胞进行细胞周期测量的方法-1、首先，建立Hela细胞周期的荧光光谱模型，每一时相的细胞标准光谱曲线按以下 步骤获取
① 样品的获得。为获取准确的光谱数据，首先要保证细胞样品处于自然生长状态下， 采用光学显微镜观察根据形态变化，获取处于细胞周期不同时相(Gl期、S期、G2期和 M期)的单个细胞，将其作为标准样品。
② 各时相细胞最佳激发波长的获取。首先用250nrn为激发波长在250~700nm范围进行
扫描，得到细胞在250mn情况下的发射光谱过后，测量250nm到发射光谱中的第一个荧光 峰波长360nm之间的激发光谱，找到激发光谱中荧光强度最强的峰，这个峰所对应的波长 290nm即为被测细胞样品的最佳激发波长。
③ 各时相细胞荧光光谱的测量。在生理温度(36.5士0.5'C)下利用荧光分光光度计 或荧光光谱仪，测量标准样品的300nm到700nm间的荧光光谱，扫描间隔0. lnm，扫描次 数5次。(测量结果曲线如附图l所示)。
④ 细胞荧光光谱的预处理。将每一细胞周期的5组光谱数据取平均作为该样品组细胞 的标准光谱曲线，将平均所得光谱曲线进行平滑滤波处理，以降低消除测量中各种原因引 起的光谱畸变。
⑤ 细胞荧光光谱模型的建立。完成细胞周期各阶段样品的光谱曲线的测量后得到两个 特征荧光峰，利用距离激发波长290nm最近的360nm波长处的荧光峰强度与细胞所处细胞 周期相应阶段的关系建立对应模型(如附图2所示)。
2、完成细胞周期各阶段的光谱模型建立后，就可对细胞所处周期进行判断。首先， 利用荧光分光光度计或荧光光谱仪在290 700nm范围内，对被测Hela细胞样品进行扫描， 对所得光谱曲线进行平滑滤波等处理后，将光谱曲线建立模型所用波长对应的吸收峰强度 与模型对比，即可判断出被测细胞处于细胞周期的G1期(如附图2所示)。
本发明方法将某种细胞的单个细胞作为一个变化体系，用处于正常生长状态下的细胞 周期G1期、S期、G2期和M期的单个细胞制成标准样品，利用荧光分光光度计或荧光光 谱仪测量各细胞样品在于其最佳激发波长10nm到700nm范围内的荧光光谱。在该范围 内的主要荧光峰处，荧光峰的强度会随着细胞周期变化中胞内物质(如氨基酸、核酸、蛋 白质等)的不断变化的有明显的变化。对于在该范围内只有一个荧光峰的情况，则直接利 用该荧光峰强度与细胞周期的关系建立模型通过荧光峰强度对细胞周期进行判别。对于在 该范围内有多个荧光峰的情况，则以离激发波长距离最近的那个荧光峰对细胞周期进行判 别，建立其强度与细胞周期的关系模型。完成模型的建立后，当要对该种细胞所处的细胞 周期进行测定时，只需测量其在最佳激发波长 700nm的荧光光谱，将所得荧光峰强度与 相关模型对比即可判断其所处细胞周期。
本发明所提供的细胞荧光光谱法是可反映真核细胞在细胞周期过程中各个阶段Gl期、
S期、G2期和M期的变化趋势。细胞的生长、增殖过程都和细胞周期密不可分，在细胞
周期的各个时相中，由于细胞内氨基酸、蛋白质等物质随细胞周期变化而在各时相中的不
均匀分布以及浓度变化，造成了细胞在各时相中荧光光谱的峰值及其强度的差异。故可将
这种差异作为荧光光谱方法测定细胞周期的主要参数，从而准确地对细胞的生长行为进行 描述和判断。
利用荧光光谱可以对细胞周期过程中的蛋白质的变化进行精确的跟踪进而得出在细 胞周期不同时相的特征光谱，并以此作为建立细胞周期光谱信息模型的依据。同时，样品 无需采用荧光染剂对染色，从而消除了荧光染剂的使用带来的副作用，使得细胞在测量后 还可用于后继培养和研究。它还具有设备简单、价格低廉、操作方便、灵敏度高等优点。
权利要求
1、利用细胞自发荧光光谱测定细胞周期的方法，其特征在于，包括如下步骤1)将某种细胞的单个细胞作为一个变化体系，用处于正常生长状态下的细胞周期G1期、S期、G2期和M期的单个细胞作为标准样品；2)利用荧光分光光度计或荧光光谱仪测出被测细胞标准样品的最佳激发波长，以最佳激发波长做激发光测量该波长到700nm间的荧光光谱；3)利用荧光分光光度计或荧光光谱仪在最佳激发波长到700nm范围内，对与所述标准样品同种类的被测样品进行扫描，对所得光谱曲线进行预处理后，将被测样品光谱曲线的吸收峰强度与所述某种细胞周期的荧光光谱模型的吸收峰强度对比，即可判断出被测细胞处于细胞周期的哪一阶段；对于在荧光光谱范围内只有一个荧光峰的情况，则直接利用该荧光峰强度与细胞周期的关系建立模型通过荧光峰强度对细胞周期进行判别；对于在荧光光谱范围内有多个峰的情况，则采用距离激发波长最近的荧光峰，再利用该关系对细胞周期进行判别。
2、 根据权利要求1所述利用细胞自发荧光光谱测定细胞周期的方法，其特征在于， 所述标准样品的获得，要保证细胞样品处于自然生长状态下，采用光学显微镜观察根据形 态变化，获取处于细胞周期不同时相的细胞，将其制成标准样品。
3、 根据权利要求1所述利用细胞自发荧光光谱测定细胞周期的方法，其特征在于， 所述最佳激发波长的测量方法是首先用250nm为激发波长在250~700nm范围对被测细胞 标准样品进行扫描，得到该标准样品细胞在250nm情况下的发射光谱过后，测量250nm到 发射光谱中的第一个荧光峰波长之间的激发光谱，找到激发光谱中荧光强度最强的峰，这 个峰所对应的波长即为被测标准样品细胞的最佳激发波长，最后以最佳激发波长做激发光 测量该波长到700nm间的荧光光谱，扫描间隔0. lnm。
4、 根据权利要求1所述利用荧光光谱法测定细胞周期的方法，其特征在于，所述步 骤2)中荧光光谱的测量是在生理温度36. 5±0. 5'C下利用荧光分光光度计或荧光光谱仪， 进行标准样品的荧光光谱测量，设定分光光度计的扫描范围为最佳激发波长到700nm，扫 描步长O. lnm，扫描次数5次。
5、 根据权利要求1所述利用荧光光谱法测定细胞周期的方法，其特征在于，所述细 胞光谱的预处理是将每一细胞周期的5组光谱数据取平均作为该样品组细胞的标准光谱曲 线，将平均所得光谱曲线进行平滑滤波处理。
全文摘要
本发明公开一种利用细胞自发荧光光谱测定细胞周期的方法。该方法利用细胞在细胞周期(G1期、S期、G2期和M期)变化过程中胞内荧光物质(如氨基酸、核酸、蛋白质等)的不断变化对其荧光光谱的峰位、谱峰及峰强造成的影响，找出这些参数与细胞所处周期的对应关系，建立特定细胞的细胞周期荧光光谱模型，最终利用该模型实现对单个细胞周期的准确测定。本发明制样简单、操作方便、仪器设备普遍、准确性高、测量速度快，应用细胞吸收峰强度随细胞周期变化的关系，可很方便的对细胞的细胞周期进行判断，细胞样品无需采用荧光染剂对染色，从而消除了荧光染剂的使用带来的副作用，使得细胞在测量后还可用于后继培养和研究。
文档编号G01N21/64GK101363836SQ20081007030
公开日2009年2月11日 申请日期2008年9月16日 优先权日2008年9月16日
发明者林晓钢, 潘英俊, 郭永彩, 潮 高 申请人:重庆大学