专利名称：一种水蛭正品与伪品的鉴别方法
技术领域：
本发明涉及到一种水蛭正品与伪品的鉴别方法，属中草药技术领域。
背景技术：
水蛭是环节动物门蛭纲动物[杨潼.中国动物志[M].北京:科学出版社，1996: 110-141.]，我国以水蛭为药材历史悠久，中国药典记载水蛭有通经活络之功效[中华人民共和国药典委员会.中国药典:一部[S].北京:化学工业出版社,2005: 63.]。
中国药典收载的水蛭正品包括蚂蝗(宽体金线蛭，拉丁名Whitmaniapigra Whitman)或7jC蛭(曰本医蛭，拉丁名Hirudo niponnica Whitman)或柳叶蚂蝗(尖细金线蛭，拉丁名Whi加aniaacranulata Whitman)。市场上常见的水蛭伪品为菲牛蛭。
水蛭的正品和伪品外观无显著差异，对于水蛭药材采用薄层色谱法(TLC)和电泳法[丁家欣，张秋海，欧兴长，李损，刘振丽，张玲，杨潼。三种水蛭的薄层色谱和电泳法鉴别，中药材，1994， 17 (11): 19-20.]、高效液相色谱法[姜艳，崔爽。高效液相色谱法对不同产地水蛭的鉴别分析，时珍国医国药，2004， 15 (8): 502]进行鉴别分析曾有文献报道。薄层色谱法与高效液相色谱法与本方法有本质的不同，三种方法的分析原理不同，电泳法相对于高效毛细管电泳法，虽然分析原理相似，但远不如高效毛细管电泳法快捷、高效。
高效毛细管电泳(HPCE)是近年来迅速发展起来的一种重要分离技术，在中药鉴别、中药分析与质量控制等方面显示出越来越广阔的应用前景。目前，尚未发现采用高效毛细管电泳(HPCE)法鉴别水蛭正品与伪品的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种水蛭正品与伪品的鉴别方法，该方法采用高效毛细管电泳法，快捷、高效，对于正品和伪品的区分效果非常显著。本发明的鉴别方法，高效毛细管电泳条件和溶液配制方法可采用常规的电泳条件、溶液配制方法及检测方法对水蛭正品与伪品进行鉴别。本发明的鉴别方法，高效毛细管电泳条件和检测方法优选为
a) 电泳条件电解缓冲液为15-30mmol/l硼酸盐缓冲液，缓冲液pH值为7-10，电压为15-25千伏，紫外检测波长为230-280nm;
b) 供试液配制方法取待测样品约0.3-lg，加入蛋白提取液5ml，在冰浴中研磨成浆状，转移至离心管内，以3000-20000rpm离心15-30min，取上
清液作为供试液，其中蛋白提取液包括以下三种中的任意一种
① 三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸提取液三羟甲基氨基甲烷0.6g，甘氨酸
2.88g，加蒸馏水溶解至1000ml;
② 碱性蛋白提取液三羟甲基氨基甲垸-盐酸0.1mo1/1， 0.1%抗坏血酸，巯基乙醇10mmo1/1， PH为8.0;
③ 酸性蛋白提取液枸椽酸80mmo1/1，磷酸氢二钠32mmo1/1，抗坏血酸5mmo1/1，巯基乙醇10mmo1/1， PH为2.8;
c) 试验方法为开机后先用O.lmol/1氢氧化钠冲洗毛细管2min，再用去离子水冲洗5min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳，取上述方法配置的样品溶液的上清液，0.5psi压力进样IO秒钟，设置电压正向分离20分钟，设定检测波长下记录所得图谱；水蛭正品与伪品的电泳图谱有显著差异。
本发明的鉴别方法，高效毛细管电泳条件和检测方法还优选为
a) 电泳条件电解缓冲液为20mmo1/1硼酸盐缓冲液，缓冲液pH值为8.5，电压为20千伏，紫外检测波长为254nm;
b) 供试液配制方法取待测样品约0.5g，加入蛋白提取液5ml，在冰浴中研磨成浆状，转移至离心管内，以5000rpm离心20min，取上清液作为供试液，其中蛋白提取液包括以下三种中的任意一种
① 三羟甲基氨基甲垸-甘氨酸提取液三羟甲基氨基甲垸0.6g，甘氨酸2.88g，加蒸馏水溶解至1000ml;
② 碱性蛋白提取液三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.1mo1/1， 0.1%抗坏血酸，巯基乙醇10mmol/l， PH为8.0;
③ 酸性蛋白提取液枸椽酸80mmo1/1，磷酸氢二钠32mmo1/1，抗坏血酸5mmo1/1，巯基乙醇10mmol/l， PH为2.8;
c)试验方法为开机后先用O.lmol/1氢氧化钠冲洗毛细管2min，再用去离子水冲洗5min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳，取上述方法配置的样品溶液的上清液，0.5psi压力进样IO秒钟，设置电压正向分离20分钟，设定检测波长下记录所得图谱；水蛭正品与伪品的电泳图谱有显著差异。
或者
a) 电泳条件电解缓冲液为15mmol/l硼酸盐缓冲液，缓冲液pH值为7，电压为15千伏，紫外检测波长为230nm;
b) 供试液配制方法取待测样品约0.3g，加入蛋白提取液5ml，在冰浴中研磨成浆状，转移至离心管内，以3000rpm离心30min，取上清液作为供试液，其中蛋白提取液包括以下三种中的任意一种
① 三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸提取液三羟甲基氨基甲烷0.6g，甘氨酸
2.88g，加蒸馏水溶解至1000ml;
② 碱性蛋白提取液三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.1mo1/1， 0.1%抗坏血酸，巯基乙醇10mmo1/1， PH为8.0;
③ 酸性蛋白提取液枸椽酸80mmo1/1，磷酸氢二钠32mmo1/1，抗坏血酸5mmo1/1，巯基乙醇10mmo1/1， PH为2.8;
c) 试验方法为开机后先用0.1mo1/1氢氧化钠冲洗毛细管2min，再用去离子水冲洗5min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳，取上述方法配置的样品溶液的上清液，0.5psi压力进样IO秒钟，设置电压正向分离20分钟，设定检测波长下记录所得图谱；水蛭正品与伪品的电泳图谱有显著差异。
或者
a) 电泳条件电解缓冲液为30mmo1/1硼酸盐缓冲液，缓冲液pH值为10，电压为25千伏，紫外检测波长为280nm;
b) 供试液配制方法取待测样品约lg，加入蛋白提取液5ml，在冰浴中研磨成浆状，转移至离心管内，以20000rpm离心15min，取上清液作为供试液，其中蛋白提取液包括以下三种中的任意一种
①三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸提取液三羟甲基氨基甲垸0.6g，甘氨酸2.88g，加蒸馏水溶解至1000ml;② 碱性蛋白提取液三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.1mol/l， 0.1%抗坏血酸，巯基乙醇10mmol/l， PH为8.0;
③ 酸性蛋白提取液枸椽酸80mmo1/1，磷酸氢二钠32mmo1/1，抗坏血酸5mmo1/1，巯基乙醇10mmo1/1， PH为2.8;
c)试验方法为开机后先用O.lmol/1氢氧化钠冲洗毛细管2min，再用去离子水冲洗5min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳，取上述方法配置的样品溶液的上清液，0.5psi压力进样10秒钟，设置电压正向分离20分钟，设定检测波长下记录所得图谱；水蛭正品与伪品的电泳图谱有显著差异。
本发明鉴别方法所述水蛭正品为中华人民共和国药典收载的水蛭正品。包括蚂蝗(宽体金线蛭，拉丁名Whitmania pigra Whitman)或水蛭(日本医蛭，拉丁名Hirudo niponnica Whitman)或柳叶蚂蝗(尖细金线蛭，拉丁名Whitmania acranulata Whitman);优选为蚂蝗(宽体金线蛭，拉丁名Whitmania pigra Whitman )。
本发明鉴别方法所述水蛭伪品为除蚂蝗(宽体金线蛭，拉丁名Whitmania pigra Whitman)或水蛭(日本医蛭，拉丁名Hirudo niponnicaWhitman)或柳叶蚂蝗(尖细金线蛭，拉丁名Whitmania acranulata Whitman)三种水蛭以外的一切伪品，优选为菲牛蛭。
按照本发明所述的鉴别方法，各供试液高效毛细管电泳记录的图谱如图1-3所示，由图可见，水蛭正品的图谱与水蛭伪品的图谱有显著的差异，该方法可有效鉴别水蛭正品与伪品。
图1 水蛭正品与伪品酸性蛋白提取液高效毛细管单用电泳图谱(A为水蛭正品，B为水蛭伪品)。
图2水蛭正品与伪品碱性蛋白提取液高效毛细管单用电泳图谱(A为水蛭正品，B为水蛭伪品)。
图3水蛭正品与伪品三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸提取液高效毛细管单用电泳图谱(A为水蛭正品，B为水蛭伪品)。
具体实施例方式
下述实施例用于举例说明本发明鉴别方法对于水蛭正品和伪品的鉴别， 但其不能对本发明的范围构成任何限制。 实施例1
蚂蝗(宽体金线蛭，WhitmaniapigraWhitman)与菲牛蛭的鉴别
a) 电泳条件电解缓冲液为20mmol/l硼酸盐缓冲液，缓冲液pH值为8.5， 电压为20千伏，紫外检测波长为254nm;
b) 供试液配制方法取待测样品约0.5g，加入蛋白提取液5ml，在冰浴 中研磨成浆状，转移至离心管内，以5000rpm离心20min，取上清液作为供
试液，其中蛋白提取液包括以下三种中的任意一种
① 三羟甲基氨基甲垸-甘氨酸提取液三羟甲基氨基甲垸0.6g，甘氨酸
2.88g，加蒸馏水溶解至1000ml;
② 碱性蛋白提取液三羟甲基氨基甲垸-盐酸0.1mol/l， 0.1%抗坏血酸， 巯基乙醇10mmol/l， PH为8.0;
③ 酸性蛋白提取液枸椽酸80mmo1/1，磷酸氢二钠32mmo1/1，抗坏血酸 5mmo1/1，巯基乙醇10mmo1/1， PH为2.8;
c) 试验方法开机后先用O.lmol/1氢氧化钠冲洗毛细管2min，再用去离 子水冲洗5min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳，取上述方法配置的样品溶 液的上清液，0.5psi压力进样IO秒钟，设置电压正向分离20分钟，设定检 测波长下记录所得图谱；
结果蚂蝗与菲牛蛭的电泳图谱有显著差异。 实施例2
水蛭(日本医蛭，拉丁名Hirudoniponnica Whitman)与菲牛蛭的鉴另lj:
a) 电泳条件电解缓冲液为15mmol/l硼酸盐缓冲液，缓冲液pH值为7， 电压为15千伏，紫外检测波长为230mn;
b) 供试液配制方法取待测样品约0.3g，加入蛋白提取液5ml，在冰浴 中研磨成浆状，转移至离心管内，以3000rpm离心30min，取上清液作为供 试液，其中蛋白提取液包括以下三种中的任意一种
①三羟甲基氨基甲垸-甘氨酸提取液三羟甲基氨基甲烷0.6g，甘氨酸2.88g，加蒸馏水溶解至1000ml;
② 碱性蛋白提取液三羟甲基氨基甲垸-盐酸O.lmol/l, 0.1%抗坏血酸， 巯基乙醇10mmol/l， PH为8.0;
③ 酸性蛋白提取液枸椽酸80mmo1/1，磷酸氢二钠32mmol/l，抗坏血酸 5mmo1/1，巯基乙醇10mmol/l， PH为2.8;
c)试验方法为开机后先用O.lmol/1氢氧化钠冲洗毛细管2min，再用去 离子水冲洗5min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳，取上述方法配置的样品 溶液的上清液，0.5psi压力进样10秒钟，设置电压正向分离20分钟，设定 检测波长下记录所得图谱；
结果水蛭与菲牛蛭的电泳图谱有显著差异。
实施例3
柳叶蚂蝗(尖细金线蛭，Whitmaniaacranulata Whitman)与菲牛蛭的鉴
别
a) 电泳条件电解缓冲液为30mmol/l硼酸盐缓冲液，缓冲液pH值为 10，电压为25千伏，紫外检测波长为280nm;
b) 供试液配制方法取待测样品约lg，加入蛋白提取液5ml，在冰浴中 研磨成浆状，转移至离心管内，以20000rpm离心15min，取上清液作为供 试液，其中蛋白提取液包括以下三种中的任意一种
① 三羟甲基氨基甲垸-甘氨酸提取液三羟甲基氨基甲垸0.6g，甘氨酸 2.88g，加蒸馏水溶解至1000ml;
② 碱性蛋白提取液三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.1mo1/1， 0.1%抗坏血酸， 巯基乙醇10mmol/l， PH为8.0;
③ 酸性蛋白提取液枸椽酸80mmo1/1，磷酸氢二钠32mmo1/1，抗坏血酸 5mmo1/1，巯基乙醇10mmo1/1， PH为2.8;
c) 试验方法为开机后先用O.lmol/1氢氧化钠冲洗毛细管2min，再用去 离子水冲洗5min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳，取上述方法配置的样品 溶液的上清液，0.5psi压力进样10秒钟，设置电压正向分离20分钟，设定 检测波长下记录所得图谱；
结果柳叶蚂蝗与菲牛蛭的电泳图谱有显著差异。蚂蝗(宽体金线蛭，WhitmaniapigraWhitman)与不明种别的水蛭的鉴
别
a) 电泳条件电解缓冲液为20mmol/l硼酸盐缓冲液，缓冲液pH值为8.5， 电压为20千伏，紫外检测波长为254nm;
b) 供试液配制方法取待测样品约0.5g，加入蛋白提取液5ml，在冰浴 中研磨成浆状，转移至离心管内，以5000rpm离心20min，取上清液作为供 试液，其中蛋白提取液包括以下三种中的任意一种
① 三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸提取液三羟甲基氨基甲烷0.6g，甘氨酸
2.88g，加蒸馏水溶解至1000ml;
② 碱性蛋白提取液三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.1mol/l， 0.1%抗坏血酸， 巯基乙醇10mmol/l， PH为8.0;
③ 酸性蛋白提取液枸椽酸80mmo1/1，磷酸氢二钠32mmo1/1，抗坏血酸 5mmo1/1，巯基乙醇10mmo1/1， PH为2.8;
c) 试验方法开机后先用0.1mol/l氢氧化钠冲洗毛细管2min，再用去 离子水冲洗5min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳，取上述方法配置的样品 溶液的上清液，0.5psi压力进样IO秒钟，设置电压正向分离20分钟，设定 检测波长下记录所得图谱；
结果蚂蝗与不明种别的水蛭的电泳图谱有显著差异。
权利要求
1、一种水蛭正品与伪品的鉴别方法，其特征在于采用高效毛细管电泳分析的方法。
2、 根据权利要求1所述的水蛭正品与伪品的鉴别方法，其特征在于所述高效毛细管电泳分析方法的电泳条件及检测方法如下a) 电泳条件电解缓冲液为15-30mmol/l硼酸盐缓冲液，缓冲液pH值 为7-10，电压为15-25千伏，紫外检测波长为230-280nm;b) 供试液配制方法取待测样品约0.3-lg，加入蛋白提取液5ml，在冰 浴中研磨成浆状，转移至离心管内，以3000-20000rpm离心15-30min，取上 清液作为供试液，其中蛋白提取液包括以下三种中的任意一种① 三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸提取液三羟甲基氨基甲烷0.6g，甘氮酸 2.88g，加蒸馏水溶解至1000ml;② 碱性蛋白提取液三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.1mol/l， 0.1%抗坏血酸， 巯基乙醇10mmol/l， PH为8.0;③ 酸性蛋白提取液枸椽酸80mmo1/1，磷酸氢二钠32mmo1/1，抗坏血酸 5mmo1/1，巯基乙醇10mmo1/1， PH为2.8;c) 试验方法为开机后先用O.lmol/1氢氧化钠冲洗毛细管2min，再用去 离子水冲洗5min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳，取上述方法配置的样品 溶液的上清液，0.5psi压力进样IO秒钟，设置电压正向分离20分钟，设定 检测波长下记录所得图谱，水蛭正品与伪品的电泳图谱有显著差异。
3、 根据权利要求2所述的水蛭正品与伪品的鉴别方法，其特征在于所述高 效毛细管电泳分析方法的电泳条件及检测方法如下a) 电泳条件电解缓冲液为20mmol/l硼酸盐缓冲液，缓冲液pH值为8.5， 电压为20千伏，紫外检测波长为254nm;b) 供试液配制方法取待测样品约0.5g，加入蛋白提取液5ml，在冰浴 中研磨成浆状，转移至离心管内，以5000rpm离心20min，取上清液作为供 试液，其中蛋白提取液包括以下三种中的任意一种①三羟甲基氨基甲垸-甘氨酸提取液三羟甲基氨基甲垸0.6g，甘氨酸(2.88g，加蒸馏水溶解至1000ml;② 碱性蛋白提取液三羟甲基氨基甲垸-盐酸0.1mo1/1， 0.1%抗坏血酸， 巯基乙醇10mmol/l， PH为8.0;③ 酸性蛋白提取液枸椽酸80mmo1/1，磷酸氢二钠32mmo1/1，抗坏血酸 5mmo1/1，巯基乙醇10mmo1/1， PH为2.8;c)试验方法为开机后先用0.1mol/l氢氧化钠冲洗毛细管2min，再用去 离子水冲洗5min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳，取上述方法配置的样品 溶液的上清液，0.5psi压力进样10秒钟，设置电压正向分离20分钟，设定 检测波长下记录所得图谱；水蛭正品与伪品的电泳图谱有显著差异。
4、 根据权利要求2所述的水蛭正品与伪品的鉴别方法，其特征在于所述高 效毛细管电泳分析方法的电泳条件及检测方法如下a) 电泳条件电解缓冲液为15mmol/l硼酸盐缓冲液，缓冲液pH值为7， 电压为15千伏，紫外检测波长为230nm;b) 供试液配制方法取待测样品约0.3g，加入蛋白提取液5ml，在冰浴 中研磨成浆状，转移至离心管内，以3000rpm离心30min，取上清液作为供 试液，其中蛋白提取液包括以下三种中的任意一种① 三羟甲基氨基甲垸-甘氨酸提取液三羟甲基氨基甲垸0.6g，甘氨酸 2.88g，加蒸馏水溶解至1000ml;② 碱性蛋白提取液三羟甲基氨基甲烷-盐酸O.lmol/l, 0.1%抗坏血酸， 巯基乙醇10mmol/l， PH为8.0;(D酸性蛋白提取液枸椽酸80mmo1/1，磷酸氢二钠32mmo1/1，抗坏血酸 5mmo1/1，巯基乙醇10mmo1/1， PH为2.8;c) 试验方法为开机后先用O.lmol/1氢氧化钠冲洗毛细管2min，再用去 离子水冲洗5min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳，取上述方法配置的样品 溶液的上清液，0.5psi压力进样IO秒钟，设置电压正向分离20分钟，设定 检测波长下记录所得图谱；水蛭正品与伪品的电泳图谱有显著差异。
5、 根据权利要求2所述的水蛭正品与伪品的鉴别方法，其特征在于所述高 效毛细管电泳分析方法的电泳条件及检测方法如下a)电泳条件电解缓冲液为30mmo1/1硼酸盐缓冲液，缓冲液pH值为`10，电压为25千伏，紫外检测波长为280nm;b) 供试液配制方法取待测样品约lg，加入蛋白提取液5ml，在冰浴中研磨成浆状，转移至离心管内，以20000rpm离心15min，取上清液作为供试液，其中蛋白提取液包括以下三种中的任意一种-① 三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸提取液三羟甲基氨基甲垸0.6g，甘氨酸`2.88g，加蒸馏水溶解至1000ml;② 碱性蛋白提取液三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.1mo1/1， 0.1%抗坏血酸，巯基乙醇10mmol/l， PH为8.0;③ 酸性蛋白提取液枸椽酸80mmo1/1，磷酸氢二钠32mmo1/1，抗坏血酸5mmo1/1，统L基乙醇10mmol/l， PH为2.8;c) 试验方法为开机后先用O.lmol/1氢氧化钠冲洗毛细管2min，再用去离子水冲洗5min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳，取上述方法配置的样品溶液的上清液，0.5psi压力进样IO秒钟，设置电压正向分离20分钟，设定检测波长下记录所得图谱；水蛭正品与伪品的电泳图谱有显著差异。
6、 如权利要求1-5所述的水蛭正品与伪品的鉴别方法，所述水蛭正品为中华人民共和国药典收载的水蛭正品。
7、 如权利要求6所述的水蛭正品与伪品的鉴别方法，所述水蛭正品包括蚂蝗(宽体金线蛭，拉丁名Whitmaniapigra Whitman)或水蛭(日本医蛭，拉丁名Hirudo niponnica Whitman)或柳叶蚂蝗(尖细金线蛭，拉丁名Whitmania acranulata Whitman)。
8、 如权利要求6所述的水蛭正品与伪品的鉴别方法，所述水蛭正品为蚂蝗(宽体金线蛭，拉丁名Whitmaniapigra Whitman),水蛭伪品为菲牛蛭。
全文摘要
本发明提供了一种水蛭正品与伪品的鉴别方法，该方法采用高效毛细管电泳法，药典收载的正品水蛭高效毛细管电泳图谱与非药典收载的伪品有明显差异，该方法简便、快捷、准确，可用于水蛭的质量控制。
文档编号G01N30/00GK101634644SQ20081005546
公开日2010年1月27日 申请日期2008年7月25日 优先权日2008年7月25日
发明者刘兴国, 剑 宋, 田青存, 靓 贾, 贾继明 申请人:河北以岭医药研究院有限公司