专利名称：与pkr激酶结构域特异性结合的多肽及其应用的利记博彩app
与pkr激酶，域特异性结合的多uyi其i^
狱领域
本发明属于生物工程与生物医药技术领域，涉及利用噬菌体展示技鄉选能与PKR激酶结构 域(Pit)特异性结合的多月级其应用。 背景駄
PKR是一种由干扰素i秀导的,于双链RNA的蛋白激酶，是^t刻I译起始因子elF2 a激酶家 方M员之一。它是一种有551个氨基酸纟贼的丝氨酸_苏氨酸 ，而近S^开究也发现其具有酪 氨酸激酶的活性[Su, Q. et a丄 Tyrosine phosphorylation acts as a molecular switch to full-scale activation of the eIF2 a RNA-d印endent protein kinase. 2006. PNAS]。结构上， 主要包括2个功能性结构域N端与RNA结合的调节性结构嫩BC端的催化结构域。PKR在干矛綠 诱导的抗病毒防御应答中发挥主要的作用，被认为是IFN诱导的最具有特征性的抗病毒路径。
PKR也可能是治疗多种神经退行性病变的药物靶标[Peel， Alyson L. PKR Activation in Neurodegenerative Disease]。其中，阿尔茨海默症(AD)是一种以进行性认知障碍和记忆力损 害为主的中枢神经系乡Bi行',病，l斑，神经纤维丝缠结和神经细胞死亡，理变化为病理 特征。0 —淀粉诱导的神经细胞凋亡中半胱天冬KCaspase/APKR的Asp251切掉PKR的调节结构域，
释放出组成型激活的elF2a激酶结构域从而导致神经细胞蛋白合成的抑制[MlILl1. et a丄 Activation of caspase-8 in the Alzheimer's disease brain. 2001. Neurobiol Dis.]。以PKRcat
作为耙蛋白筛选抑制剂可以用于开发延缓群痴呆病中神经细胞的死亡，纟 和治疗1痴呆的药物。
在过去的10年间，多肽疗法对医药行 说，被认为是一项很Wltf途的新开发。，范围内 有600—700种多肽正处于开发阶段。其中，在细胞信号fflS各的基5臓究和药物研发方面，激酶多 肽鄉制剂己成为一个非常輸途的领域。例如，多肽PKI抑制PKA的激酶活性棚于研究人淋巴 细胞的调亡通路[Zhang, B. et a丄 Racl inhibits apoptosis in human lymphoma cells bystimulating Bad pho印horylation on Ser-75. 2004. Mol. Cell. Biol.]。豆蔻酰基化蛋白激 歐的抑制肽在细胞水平和动物水平都能够特异的抑制PKC的活性。[Spyridopoulos， I. a丄 Divergence of angiogenic and vascular permeability signaling by VEGF inhibition of protein kinase C suppresses VEGF-induced angiogenesis but promotes VEGF-induced， NOd印endent vascular permeability. 2002. Aterioscler. Throrab. Vase. Biol.]。 尽管PKR激酶结构:I^老 年痴呆等疾病中辦作用，但目前絲舒KR抑制剂和PKR多肽鄉制剂的报道。
多肽药物设计中，禾,噬菌体呈现技^l勾建不同容量的随棚，，从这^l，中快速筛选出 活性多肽，并鉴定其结构，可以简便决速地获得与耙好具有强亲禾叻禾晚异性的小肽或新型蛋 白，这翻太段可以作为纟魏药物进行开发。
发明内容
本发明目的是麟一种倉激与PKR激酶结构域特异性结合的多B级其应用。 PKR是神经细胞凋亡相关疾病，如^^痴呆症药物开发的新耙点。本发明自12肽噬菌体展示
文库对PKIU4行五轮蹄选，获得了能与PKL特异性结合的12肽，并且该12肽倉^q]制PKL的激酶活性。
本发明应用噬菌体展示文库对神经细胞凋亡相关蛋白PKJU謝満选，获得了一，异性结 合Plt的12肽，其氨基,列如下
Ser-Val-His-Leu-Tyr-His-Ser-Thr-Lys-Thr-Leu-Aig。
战多肽，肖的PKR激酶结构域特异性结合，并且倉,制PKR^磷酸化elF2a的能力，IC^ 为2.5yM。
所述的多肽可以用于抑制PKL激酶活性。可应用于开发Pl抑制剂。 本发明提供的与PKR激酶结构域特异性结合的多肽的筛选和鉴定步骤如下
^M人PKIU进行五轮筛选，获躬PKR结合的重组噬菌体；
ELISA法检测噬菌体与PKIC的结合； 单克隆,体的分离制备；
M体基因组单链DNA的提取和获得寡ttl^列；*多肽固相合成，竞争ELISA检测多肽与PKIU的结合；
应用体外生物化学方f叙if究12月树PU鹏活性的影响。
本发明的有 ^是:本发明提供的12肽倉,特异性的与Plt结合糊制Pit的 活性， 可应用于PKIU抑制剂的药物设计。
图1.是免疫印迹法(Western Blot)检测纯化PKR^的激酶活性，
图2.是噬菌体展示中每轮淵兑的噬菌体数，以空孔作为对照，
图3.是ELISA法检测筛选得到的噬菌体和原噬菌体库与包被PKILt的孑L和空孔的结
合，
图4.是ELISA法检测10个噬菌,克隆与Plt及空孔的结合，
图5.是竞争ELISA法检测合成12肽与PKILt的结合，
图6.是体外酶学方法检测合成12月树PKIU激酶活性的影响。
具体实駄式
实施例l:重组PKIC的^i^做活性的初步研究
1. 魏PKILt质粒的构建
利用已有的pET28a-PKR f皿，TM的PCR弓胸和Pfu聚合酶PCR扩增PKR^: 正向引物5 ' —CATGCCATGGGCGACATGAAAGAAACAAAGTATACTG- 3' 反向弓慨5 ' -GGCTCTCGAGACATGTGTGTCGTTCATTTTTCTC-3' 禾,NcoI/XhoI消化扩增DNA片段，并且克[tJtA质粒pET28a (Novagen)。将这样构建的 重组质粒命名为pET28a-PKlU并且导入;yif杆菌BL21 。重组质粒pET28a-PKILt允许在成熟的PKIU 的N ^^具有另夕卜一个甲基硫氨酸残凝口在C ^J需具有另外61^且氨酸的重组PKL的皿。
2. 魏PKIU的纯化
① .齢有pET28a-PKILt的BL21于5raL LB培养基(50ug/ml卡那霉素)，37°C， 250rpm摇菌过 夜。
② 丄50的比例转接到4个大瓶中(^!250mLLB培养基，50 u g/ml卡那霉素)，37°C， 250rpm摇菌2小时。加入300uMIPTG， 27°C， 250rpm，过夜诱导。
③.将诱导过夜的菌液10000rpm,离心15射中。用Lysis Buffer (20mM Tris-HC1， 500mM NaCl， pH 7.5)重悬沉淀，lOOOOrpm，离心15辦中。
.用40mL Lysis Buffer重悬所有沉淀，加入PMSF蛋白,帝挤i」至终浓度为lmM，在冰浴中超声 破碎(功率300W，超声5s，停15s， 90循环)。
. 4 12000rpm， 15射中离心两次。将离心后的上清与4mL Ni树脂4'C结合1小时。
⑥ .在蛋白与树脂结合的同时，清洗蛋白纯化仪:先用清7K清洗B難，彌洗A魏(5mL/射中)； 再用Elution Buffer (20rnM Tris-HCl， 500rnM NaCl， 250mM咪唑，pH 7. 5)清洗B髓(0. 5mL/ 射中)；最后用Lysis Buffer清洗A髓(0. 5mL/^H中)。
⑦ .将结合蛋白的树脂离心，弃上清，装柱，连接于AKTA prime plus蛋白纯化仪(通用电气)。 用Lysis Buffer漂洗Beads,洗下一時寺异结合的蛋白。用Elution Buffer梯度淘说目的蛋白。
⑧ .根据蛋白峰的隨，收集相应管的舰液，跑SDS-聚丙烯醐穷繊电泳(SDS-PAGE)，考马斯 絵她魁正。
3. PKRcat激酶活性的初步分析 反应体系为40 nL:
① .将50ng纯化PKR^加入置于冰上的试管中，其终浓度为25nM。
② .混合底物纯化的elF2 a ， ATP， 5 X Buffer A (lOOmM Tris-HCl， 200nM KC1， lOmM MgCl2)和 双蒸水使反应液中含终浓度为20nMTris-HC1， 40mMKCl， 2mMMgCl2， 500nMelF2 a ， lOOuM ATP， 以此混合液启始反应。
③ .以(D 昆合TO始反应，30。C水浴准确鹏10射中。力口8wL 6 X Loading Buffer终止反应。
. 9(TC沸水中煮5^I中。样品7转PMM温，微型离心机短暂离心( 15s)。
.上样，进行SDS—PAGE电泳。
⑥.Western Blot法检测elF2 a的磷酸化状态。
方法如下
100mA，电转移1.5小时。用3%的腳旨牛^5^寸闭膜，室温摇床轻摇l小时。加入第一抗体(磷酸化elF2a抗体，兔源， Invitrogen)，室温摇床轻摇l小时。1XTBST(含O. 1% Tween附BS， pH 7. 4) 3次，每次5分 钟。与第二抗体反应(HRP偶联羊抗兔二抗，Santa Cruz Biotechnology),室温摇床轻^40射中。 1XTBST鹏3次，每次5射中。去离子7X洗5射中。加化学发舰物(ECL)曝光。曝光5艘经^|$ 成像系统Chemidoc XRS System (Bio-Rad)定量。
Stripe Buffer (7M盐酸胍，lOraMDTT)处理膜30併中。去离子水TO3次，每次5射中。用3% 的腳旨牛^5i寸闭膜，室温摇床轻摇l小时。加入第一抗体(anti-elF2 a antibody,兔源，Santa Cruz Biotechnology),室温摇床轻摇l小时。1XT BST(含0.W Tween附BS， pH 7.4) ^锁3次，每次 5射中。与第二抗体反应(HRP偶联羊抗兔二抗，Santa Cruz Biotechnology),室温摇床^g40分 钟。1XTBST鹏次，每次5射中。去离子7]C洗5併中。力口化学发舰物(ECL)曝光。曝光弓驢经 Ml^成像系统Chemidoc XRS System (Bio-Rad)定量。
eIF2 a磷酸化禾號磷酸化elF2 a曝光弓膨全elF2 a曝光鹏。
结果从1L菌液中纯化出4.8呢的PKIU蛋白，酶活分析表明纯化蛋白具有激酶活性，倉,酸 化elF2a;对照组未加APl elF2a未被磷酸化(图l)。
实施例2:乡S15:轮筛选获得能与PKRcat特异性结合的魏噬菌体
1.第一轮筛选与離
① .用NaHCOs溶 释PKR^蛋白至100 pg/mL的溶液,要求NaHC03的终浓度为0.1M。加100|aL
该溶游U96孑L板的一个孔中，4。C包l舰夜。
② .加150^§^羊配制的含0.5% (w/v) BSA的TBS (BTBS)溶液到上步包被蛋白的孔中，室温
摇摆平台方爐1小时。
③ .与此同时，将噬菌俠10"pfU)加到100iaLBTBS中，加到一个空孔中，室温摇摆平台方燈l小
时，目的是将可以与ELISA板非特异性结合的噬菌体吸收掉。
.倒掉蛋白/BTBS溶液，用200nLTBST (含O. 1% Tween的TBS， pH 7.4)洗6遍，注意每次都 不要让孔干了。最后一次洗完后，将先前与板吸M的噬菌柳TBS溶鹏移到这个孔中。室 温MM平台放置1小时。⑤ .倒掉噬菌^/BTBS溶液，用200nLTBST洗10遍。
⑥ .加100iaL0,2MGlysine 结合的噬菌体，室温 離平台體8射中，立即转移至lj小离心管中，
并用Tris-HCl buffer中和到pH为7—8。 4 'C保存直至顿啶噬菌微度或扩增。
⑦ .对照另一 L不包被蛋白按相同方法操作，得到 噬菌体并测定浓度。
2. 扩增，第二轮奴后几f^与舰
① .保留10-20&上步得到的噬菌做脱、細于测噬菌術商度，^絲除的噬菌体鄉扩增产顿
于下一轮筛选的噬菌体。
提前将大肠杆菌ER2738 [F， lacf1 A(lacZ)M15 proA4^ zzf::Tn10 (Jet"VfhuA2 supE thi A(lac-proAB) A(hsdMS-mcrB)5 ("_1111{^0 0")菌;1*^存在含50%甘油的LB培养基中，存于一70 °C]接到LB培养基中，摇床培养到ODeoto为0.5时，取lmL大肠杆菌ER2738转接到含有30rnL LB培养基的三角瓶中，同喻艘扩增的噬菌糊[]入，37'C摇床培养4,5小时。
② .转移上步的培 到离心管中，室温，10000rpm离心15併中。将80%的上清吸至噺的离心管
中，加入l/6上清^f只的PEG溶液，4'C沉^趙夜。
③ .4。C， 10000rpm离心30 ^H中，缓慢倒出上清，再小心的将管壁上的液体离心下来，用微
液器小心弃掉。
.用200(iLTBS重悬沉淀，转移悬液到0.5mL离心管中，室温10000rpm离心5併中。
⑤.上清转移到新的0,5mL离心管中，逸就是扩增了的II鶴体。4'C保存用于测浓度和下一轮筛选。
包被ELISA板的另一个孔，加入10HpfU第一轮扩增噬菌体。按第一轮的方、 S4行第二轮及之
后几轮的筛选和扩增，每轮噬菌体的力口入M,与第一轮一致。
3. 噬菌^t度的测定的具体实施
① .大肠杆菌ER2738接种到5mLLB培养基中，37。C摇^t咅养魏数早中期(ODeoonm大约0.5)。
② .融^li:层胶(含有0.7。/。琼月謝的LB培养基)，條3mU管，45。C水,衡，准备别顿。
③ .用LB培养翻争疆(或扩增)后的噬菌体进行10倍系列稀释。 稀释比例如下
对于扩增的噬菌，，稀释iow和io"倍。 '对于》 下来的噬菌体液，第一轮按102和103稀释，以后每多一轮就增加10倍##度。
将10|aL噬菌###、柳卩入到200^L第一步的ER2738菌液中，，轻轻混匀，室驗置1 一5分 钟。
.转移第三步噬菌鹏染的ER2738菌液到第二步中45。C平衡的战胶中，fflit摇动，立即倒入 37。C预温的LB平板(涂有IPTG和X-gal)上，均匀铺平。
⑤ .7細5倂中，反转平板，37。C:t歸过夜。
⑥ .计数器统计平fei:的噬m^数量，根据,倍数计算噬菌体的浓度。
结果进行5轮富集筛选，每轮从PKIU上洗脱下来的噬菌体量在总体J^渐升高，与对照孔 比较实现了 104倍富集(表1)。表1中五轮的噬菌,用图1表示。图1中纵坐标用对数值表 示，横坐标條轮数。
表l筛^n特异性结合的噬菌体
Pl (pfu)空白(pfu)
第一轮3.0X1048.0X102
第二轮9.0X1052.0X103
第三轮2.0X1073.2X103
第四轮6.0X1084.7X103
第五轮7.0X108a5.0X103
a.第五轮繊下的噬菌体量与第四轮持平说明对Plt结^離体的富集B^雖iJi魅U，更多轮的鹏并不能增
加富集禾镀。
实施例3: ELISA检测筛选到的噬菌体对PKRcat舰照结合能力
① .用NaHC(V溶、，释蛋白为100|ag/mL的溶液，要求NaHCO3的终浓度为O.IM。加lOO^L该
溶液到96孑L板的两个孔中，4'C过夜固定。同雌照同样的方法将BSA加入另两个孔作对照。
② .每孔加10(VL3。/。的BSA封闭未结合蛋白的部分，室温摇摆平台方爐1小时。
③ .根据所测的第五轮冼脱下的噬菌体的浓度，将噬菌体用TBST稀释，每孔加100nL，噬菌体约
109—101G。室温摇摆平台方燈1小时。
.齡孔用200W TBST洗6次。
⑤.HRP-抗M13抗体(PhaimaciaBiotech公司)按1:5000用TBST稀释，每孔加lOO^L,室温摇摆平台體l小时。
⑥ .針 Lffl TBST洗6次。
⑦ .按60nL四氨基联苯胺OMB， Sigma公司，10mg/mL溶于DMSO)力口到10mL l!1i酸-醋酸
钠(Critate-Ac)中，再加入3(^11202配制底物，每孔加10O|aL所配制的底物显色。
⑧ .1倂中后加100nLlMH2SO4终ih&应。
用RI示仪在OD450^下测定吸光值。
结果第五轮得到的特异性噬菌体库与PKR^结合能力繊大于原始噬菌体库，第五轮得到 的特异性噬菌体库与PKRcat结合能力也繊大于购BSA结合能力，即第五轮得到的噬菌体库能
够特异性与PKRcat结合(图2)。图2中横坐标4懐不同的噬菌体库，輕标表示平均净吸光值，
lib寸様文库噬菌体，R5代表第五轮筛超啲特异性噬菌体，白色柱代表与Plt的结合，黑色柱 代表与对照的结合。
实施例4:单克隆噬菌体的分离制备
1. 特异性结合的噬菌体克隆的确定
① .在测定第五轮淵兑噬菌体的平^h挑取IO个单克隆鉴定多B游列。
② .用灭菌的牙^M取一个蓝色噬m9王转接^i咅养魏数中期的规杆菌ER2738的试管中。③ .37。C摇床培养4—5小时。
④ .转移培INtl到7mL离心管中，10000ipm离心10射中。
⑤ .将80%的上清吸到新的离心管中，加1/6上清体积的PEG溶液，4'C沉淀2小时。
⑥ .4'C， 10000rpm离心30射中，缓漫倒出上清，用微餓液器小心^l繊留的液懒及弃。
⑦ .用200nLTBS重悬沉淀，转移悬游!J0.5mL离心管中，4°C ， 10000ipm离心5併中。
⑧ .上清转移到新的0,5mL离心管中，逸就是所挑取的噬菌脾克隆。4'C保存用于测浓度，如果
要长期保存，加50%甘油，冻于—2(TC。
2. ffi3iELISA检测挑取的单克隆
①.用NaHCO3溶液稀释蛋白为100iag/mL的溶液，要求NaHC03的终浓度为O.IM。对于*单 克隆要包MM少两个孔， 一个孔包l炒万筛的蛋白，另一个孔包被BSA作对照。每孔加100^iL蛋白，4'C过夜固定。
② .每孔加100^L3M的BSA封闭未结合蛋白的部分，室温摇摆平台艘1小时。
③ .根据所测的噬菌脾克隆浓度，将一定量的噬菌脾克隆用TBST稀释，敏L加100^L，使噬
菌体加入量在109—101Q。室温J離平台體1小时。
. *孔用200)ul TBST洗6次。
⑤ .抗條1:5000用TBST稀释，每孔加100^iL，室温摇摆平台驢1小时。
⑥ .^孑固1BST洗6次。
⑦ .按60(jLTMB(10mg/mL溶于DMSO)加到10mLCritate-Ac中，再加入3|01^202配制底物，每
孑L加lOO^L显色。
⑧ .1倂中后加100^L1MH2S04终止反应。
⑨ .用Kt示仪在OD450nm下测定吸光值。
结果10个单克隆都表现出对Plt的高结合性(图3)。图3中横坐标标不同的n織体 单克隆，纵坐标表示平均净吸光值；白色柱^Plt孔的平均净吸光值；黑色柱^BSA孔的平 均净吸光值。图3中齡噬菌脾克隆均与PKR^及BSA结合。洗涤后，用辣M:氧化物謝禺联 M13抗体及其底物誦对針孑U4行ELISA反应，并检测OD450nm。对*克鰣行了两组检 测，图中 为两组检测的平均值。
实施例5:噬菌体基因组单链DNA的提取和12 ，列的获得
① .将所挑取的IO个单克隆噬菌体进行扩增。
② .取60nL扩增后的单克隆噬菌鹏液，加入20^iLPEG溶液，置于4'C》嫌内節^1夜。
③ .10000rpm离心10射中，弃上清并倒扣离心管，使液術紘。
.加入200nL碘化物缓冲液，再加入500^L无水乙醇，室温孵育10併中。
⑤ .10000ipm离心10射中，弃上清，用70%乙||^先沉淀。
⑥ .10000ipm离心10射中，弃上清，千燥，让残余液條发完全。
⑦ .重悬沉淀于30^L去离子水中，该溶液即该单克隆fl筮菌体的基因组单链DNA。
⑧ .以—96 gm弓物(5，-CCCTCATAGTTAGCGTAAC03'， New England Biolabs随机十二肽噬菌体展示文库产品)测序。测序结果用Prime Primier软#0译，得到多月游列。序列如下
Ser-Val-His-Leu-Tyr-His陽Ser國Thr-Lys-Thr-Leu-Arg Asp-Tyr陽Met-Ser陽Thr-Leu-Phe-Met-Ala-His-Gln-Thr
实施例6:固相多肽合成
① .采用Fmoc微魏酸合成的策略，在固相载体上合成多肽；合成完鹏用TFA (三氟乙酸) 切割，乙醚沉淀得到多肽fi^品。
② .用制备色谱(HPLC)纯化多肽，得到多膨屯品。
用Merck C18色谱柱，含0.05%的TFA的乙驗性梯度冼脱(乙腈浓度在30min内从5%变化到 35%)，紫夕卜210nm波长检测，收集单一组分的峰。
③ 质谱测试(MS)。
结果HPLC峰面积积分比较得到两种多膨艘均大于95%，质谱中目标肽的肝离子,口 设计肽的理论M量一致，两啊^验结果表明获得了高 的目标肽。 实施例7:合成多肽的竞争ELISA实验
① .用NaHC03溶液稀释蛋白为20pg/mL的溶液，要求NaHC03的终浓度为0.1M。每孔加60^L，共 48个孔，4。C过夜固定。
② .倒掉蛋白液，齡孔用200^iLTBS洗四遍。
③ .每孔加200(^3%的BSA封闭未结合蛋白的部分，室温J離平台方燈1小时。
.倒掉BSA液，加入不同浓度梯度的多肽1和多肽2 (6个梯度)，每 L加100pL，室温摇摆平 台S5(S1小时。多肽1和多肽2分别以无，列(ScrambledSequence)为对照，其它步骤相同。
⑤ .針 1^应加入109的噬菌体(如加入多肽1的 L用带有多肽1的噬菌体去竞争)，让其和多 肽竞争与蛋白的结合，室温摇摆平台方燈l小时。
⑥ .^NPL用200^LTBST洗8次。
⑦ .抗体按1:5000用TBST稀释，每孔加60pL，室温摇摆平台驢1小时。
⑧ .齡 L用TBST洗8次。
⑨ .60^LTMB(10mg/mL溶于DMSO)加入到10mLCritate-Ac (pH6.0)中，再加入3^11202即
12为底物，每孑L加lOOpL显色。90s后加50|oL 1M H2S04终lhS应。
⑩.用^fe仪在OD450nm下测定吸光值。
结果随着多肽1和多肽2浓度增加，表征噬菌体与Plt结合的OD,逐渐斷氐；而无， 列多肽的加入并不引起0D^的斷氐(图4)。表明合成多肽1和合成多肽2會,与对应噬菌体竞争
结合PKRcat。
实施例8:多JWPKR^t激酶活性的影响
① .用DMSO配制5mg/ml多肽(多肽l，多肽2，对照多肽)储液，保存于一7(TC冰箱。
② .用缓冲液TBS稀释多肽l至100ng/raL，对照多肽至100吗/mL;用含2XDMSO的TBS ■ 多肽2至10pg/mL。用含2%DMSO的TBS ii^释多肽1至浓度为50|ig/mL， 10ng/mL， 5pg/raL， l吗/mL;稀释多肽2至5吗/mL， 2.5|ag/mL， l吗/mL， 0.5|ag/mL。
③ .1(^L不同浓度多肽与50ng纯化PKIU混合，冰上孵育15射中。
其佘歩骤与实施例l (3) PKR^活性的初步分析相同，求得elF2a的磷酸4^號。
结果:对照多月树PKIU激酶活性没有影响，多肽1和多肽2抑制PKR^对elF2 a的磷酸化反应(图 5)。多肽l的IO)约为2.5uM，多肽2的IC5o约为250nM。SEQUENCE LISTING
〈110〉南开大学
〈120〉与PKR激酶结构域特异性结合的多月级其应用
〈歸2
<210> 1
〈211〉 12
〈212> PRT
〈213〉 AX序列
<220>
〈221〉 PEPTIDE
〈222〉 (1)..(12) 〈223〉
〈400〉 1
Ser Val His Leu Tyr His Ser Thr Lys Thr Leu Arg
1 5 10
〈210〉 2
〈211〉 12
〈212〉 PRT
〈213〉 AI序列
〈220〉
〈221〉 PEPTIDE
〈222〉 (1).. (12) 〈223〉
〈400〉 2
Asp Tyr Met Ser Thr Leu Phe Met Ala His Gin Thr
1 5 10
权利要求
1.与PKR激酶结构域特异性结合的多肽，其氨基酸序列如下Ser-Val-His-Leu-Tyr-His-Ser-Thr-Lys-Thr-Leu-Arg。
2. 如权利要求l戶舰的多肽，赚征在于，能与PKR激酶结构鹏异性结合，并且能柳制 PKR^磷酸化elF2 a的能力，ICso为2. 5 P M 。
3. 权利要求1戶腿的多肽在开发PKReat抑制剂中的应用。
全文摘要
一种能够与PKR激酶结构域特异性结合的多肽及其应用。本发明涉及PKR激酶结构域(PKR<sub>cat</sub>)的抑制12肽序列，其氨基酸序列为Ser-Val-His-Leu-Tyr-His-Ser-Thr-Lys-Thr-Leu-Arg。本发明应用噬菌体展示文库，筛选能够与PKR<sub>cat</sub>特异性结合的12肽，该12肽具有与PKR<sub>cat</sub>特异性结合的特性，并且能够抑制其激酶活性。因此，该12肽对研究PKR<sub>cat</sub>在细胞调亡中的作用及PKR<sub>cat</sub>抑制剂的开发具有实用价值。
文档编号G01N33/68GK101293917SQ200810053528
公开日2008年10月29日 申请日期2008年6月16日 优先权日2008年6月16日
发明者常云松, 张宏恺, 张翠竹, 曹又佳, 杜明娟 申请人:南开大学