一种测定一氧化氮生成的荧光探针及其应用的利记博彩app

专利名称：一种测定一氧化氮生成的荧光探针及其应用的利记博彩app
一种测定一氧化氮 的荧光徽及其鹏
^:领域本发明属于生trtt测及临床医学检测技术领域，涉及翻胞或者组织中NO的 测定，特别是一种可用于活细胞中NO成像测定的铜配溯荧光微及其鹏。
背景狱NO是一种肝小、结构简单的气体，难溶于水，极易ilil^鹏扩散。由于 其分子中有一未,电子，具自由基结构，极不稳定，容易与氧、超氧化物自由基、逝脸属离 子起反应。在组织内的半衰期极短，1小于lmin，但在组织》卜棘氧气對牛下半衰期可延长至 4minS右。NO能很快被氧化成石^fe舰硝麟，与超氧化离子、血红蛋白以及含血红素蛋白质 结合.而M生物活性。80年f^发现内皮细胞舒张因子(EDRF)就劍O，因此有翔0的研究开 始兴起。现已査明NO在细胞内信息传导方面,Sg的作用，它 有第二信使和神经递质的性 能.又;1^肿瘤细M寄生虫争 鹏肝。正是由于NO的生tffi^性.研究腳!INO可倉树某 些赚，如细胞增殖病、新生儿缺氧舰'賊病及细胞的凋亡、生长及死t^"面影响駄。因此， 研効0的检测技术具有很高的自价值。
由于NO在生物体内含量低，半衰期短，有氧气，^K牛下极易被氧化，3^就给其准确测定带
来困难。目前主要采用测^NO的稳定f^終;^t;硝酸盐，亚硝酸盐间接反,o^量的方法。硝
麟可用硝麟还原喊镀铜镉法将其还原为亚^4k稱Griess试剂发缝氮化腿，4^@红 色化^3Xma^546nm，显M与亚^^lfc浓;g^lE比。
化学发光法根据NO可与臭ma^化学反跡^a态^ft化氮，后者顿回基态过程中释放 育讀，部分育遣以光子形^lt，利用敏感的光电倍增管来检测光子的皿强度，以此推飾0^ 量。此法具Wi^灵M和高特异性的优点，尤其适用于呼出^NO^S的检测，但由于#^属、 鹏、塑料等固糊料，NH3、麟气体，以淑O易溶于液將因素的干扰作用，其临床卿受 到一定限制。其它还有高效色谱法、高 红素,，由于需^m仪器，操^ 杂，难于在临 床推广糊。
由^J见在的NO检测技术局限于)(^NO先氧化舰硝鹏或硝^m帮则定，无法实现实时直 接的测定，使f翻啶结果的科学性受至顿疑。荧光光谱测定是一种灵敏的化^t测手段，微测下限一般可超i糊摩尔(10—摩尔)甚至皮 摩尔(10—12摩尔)级。自1995年以来，世l!^实^^力于开劍0的生物荧光检测i^iJ，如二 氦萘及其衍生物(Diaminonaphthalene,DAN)， 二氯荧光素(dichlorofluorescir^DCFH), 二條和 钴离子的配合物，二SS荧光素(DAFs)和二MS罗丹明(DARs)等等，但目前存在的各种荧 光检测试剂^ffi着各种缺陷妨碍其进一步l^ffl，如缺2N0检测^H4 (DAN^DCFH)，检测灵敏 度低(二,和钴离子的配^tl),需要其他HI^物(典型为M氧)的参与(如DAFsSJDARs) ，，使得细胞内或机体内WNO检测i4M缓侵。目前应用的ft^功WNO荧光检测试剂;！DAF和
dar，但由于禾PN0His激活荧光时需^02的参与，尽管其j^ffiii:接禾PNoas^^3ta行检
测，但在一定割牛下(如5^境中的细鹏组织)臓不能实1则0在细胞内赫机体内的实时 三维空间检测。
铜离子和一些荧光基团形成的配合 近期受到了大家的关注，Cu (n)形成的配合物具有
M的氧化性，在溶液中或生理^K牛下可以和no ， ，形成新的荧光化，，cu (n)被
还原成Cu (1)，这是一种很灵敏的縱(tunwm)荧光检测法，并且不需要其他,鹏物的参 与。苯并咪唑或萘并咪麟衍生物是一类荧光件质优秀，斯托克斯位移駄，较为稳定的激发态 好内质子转移(Excited-State Intramolecular Proton Transfer, ESIPT)型荧光化^t/，它们的最大 ^^波长在350nm左右，与经典的细胞凋t^i!l荧光染料DAPI位于相同的区域，大部，， 微微配絲相应的M^滤光片，易fit行检测。它们可以和铜离子形成稳定'腿中的配合物， 招艮NO反鹏，微出荧光。并且由于它们的荧光顿比较稳定独特，在细胞内可以和其他荧 光染料结湖亍双鹏，进一雜细化检测结果。

发明内容本发明目的是划艮现有技术，的，不足，皿一种测定一氧化氮生成的荧光探 针及其鹏。这种荧光探针可以为研究人类的各种炎症、心血管疾病刻中瘤发組程中的机制、 以及为某^^疾病的早期诊断与预 ^良好的辅助手段。 本发明的技术方案为
1、测定1化氮4^的荧光,的结构及其合成方法与合成路线本发明提供的测定NO生成的荧光探针的结构为式(I )或(II):
3a-Cu: RfRfRfl^H, R=H 3b-Cu: R广R3-R4-H, R2=OMe, R=H 3c-Cu: R广RfH， R2=R4=OMe, R=H 3d誦Cu: RfRfF^-H, R3=C1, R=H 3h-Cu: RfRfF^H, R3=C1， R=CH3
4a-Cu : R, =R2=R3= H; 4b"Cu: R广R广H R2=OMe 4c-Cu : R,=H, R2=R3=OMe 4d-Cu: R^RfHR^Cl 4bCu: R2=R3=H R广OMe 4f-Cu: R^R^HR^OH
该荧光徽的合駄法如下步骤
&分别将300mmol取f^K杨歐l^l喊,下溶于125ml的甲醇中，然后加入150mmol的 取代邻苯二胺(2a或2b)用刊ij备式(I )的H^fi^J，锄卩入150mmol的邻萘二銜2)用刊iJ 备式(II)的 ￡^#/,室^mt半1小时，^ffl应的沉淀物，过滤i^K淀物，甲,涤，真 空千Jtf导到配体Aa Ah (或Da^Df)。
b. 分别将13mmo1上步得到的配体Aar~Ah (或DbDf)溶于100ml氯仿中，再加入由2.5g Mn (n) Cl2'4H2O溶于40ml乙醇戶顾U得的溶液，顿褐色溶液，再将此溶MSA空气的情况下搅
拌12小时，f娜啡色溶液，室W^24小时并,，^咖啡色沉淀，过滤出沉淀物，用DMF 洗涤，再用少量乙^fe涤，真空千麟到三i^配糊Ba Bh (或Ea Ef)。
c. 分别将200mg上步得到的三 配，BhBh (或Ea~Ef)溶于10ml水和5ml甲醇中， 加入少量6mol/LNaOH溶液，调节溶液的PH为IO，然后室温下離12小时，过滤出沉淀物， 、搶液中力口入少量醋酸，中和至PH=5，用乙酸乙酯提取溶液，有丰細用^7jC硫,千燥，繊， 得，，用薄层层析赫據析分离，乙酸乙酚正己烷l: l为展开剂，分离出目的产物，用乙 酸赫乙醇重结晶得到2-(2-羟基^S)苯并咪t^f行生物3a 3h (或4"f)。
cL分别将上步 的2-(2-羟基苯基)苯并咪( ^生物3a 3h (或4"f) 2mg溶于10ml乙醇， 与等^R等摩尔硫,水溶液在室温下形成配，，常温挥发^M， ^以乙醇和去离子水各洗 涤三次，即得2-(2-羟基^8)苯并咪1 衍生物- ^/产物。具体合^S各线如下:<formula>formula see original document page 7</formula><formula>formula see original document page 8</formula>2、本发明麟的测定NO顿的荧光徽的鹏
在^^物及非生物环境中，利用0M的i^e^i荧光探针捕,系中的No，使^^针的荧
光3MM著增强，然后M荧光测定S^确定NO的产生。0M荧光测定法除了常规的荧光测定 法外，还包括时间^^光测定法及时间^#荧 微皿像测定法。
本发明的应用具体包括但不限于
鹏于化学体系中NO的检测，生物翻鹏Mi且织内的NO的分析检测和荧光成像检测，
1e: R2=R3=R4=H RfOCHg Da. 1f: RfRfRfH R2=OH ^_^临床医学上病变组织中NO的检测以及生物活体的NO即赚测。 本发明的^feMh具有如下皿
1. 稳定'断，l滩长期保存f顿，翻于中性，弱酸隨碱性多种环境。
2. 具有极高,O观啶灵鹏，其最低检测下限为17nmol/L (以4M:u为例)。
3. 对NO有很好的选择性，与其他的含活性氧、活性氮自由S5HH乍用后荧光信号几乎无变 化。
4. 糊0鹏前后荧光变4tM，荧光稳定，适舒体系内NO的即时荧光测定。
5. 可简单ax活细鹏口離织，特异'鹏获细鹏且织中,O，导致配糊的荧光鹏显
著增强，进而用于活细胞中NO的时间^^光测定。
6. 配^K体内稳定性强，可以直接用于体内,0荧 ^,皿生物即时荧光检测自 中优势较为明显。
本发明的荧光徽为研効O介导的生物信号鹏、NO在炎症中的功能、以淑O御中瘤发
^程中的意XS诊断,了，的理论基础和实验方法。

图l是化激3a-CA 3d-Cu^ 3h-Cu^4b"Cu与不同鹏肝反应后的荧光变化倍数图，用以证明
它们^NO鹏的选择性。其中，A是3a《u、 B影h^Cu、 C彭cUCu、 D是4b-Cu;
图2是化^I3a-Cu^d"QUh-Cu^4b"Cu執0反赫后的荧光光i魏化图，其中，A彭a-Cu、
B彭d-Cu、 C影h-Cu、 D是4bCu;
图3是化糊4W:u^小鼠巨噬细胞(Raw264.7)組PS刺激前后NO变化的荧舰像； 图4是化^J4M:u检测肝急性炎症小鼠中肝脏组织,0局部变化的冰冻切片荧舰像图； 图5是i!3lMALDI—TOFSlFT-IR测定确定4b"CuS]NOaS的机理，其中，A是4lvCu的
MALDI-TOF测定图、B是4W:u别0反应后，的MALDI-TOF测定图、C是4b的FT-IR测定图、D
是4b^Cu^NOSiS后^的FT-IR测定图。
具体实lfi^
实施例中化糊的编号对应于战方案中的化激编号。^Jfi例1:化，3a-Cu， 3b"Cm 3c-Cu^ 3dCu^ 3h-Cu的共同合^线
分别将300mmo1取f^JC杨醛(la ld) ^ 下溶于125ml的甲醇中，然后加入15Ommo1的 取代邻苯二腐2a或2b)，室W^1小时，4jtffi应的沉淀物，过滤收敏淀物，甲纖涤，真 空千嫩导到配体Aa^Ah。
分别将13mmo1的配体Aa^Ah溶于100ml氯仿中，再加入由2.5gMn (n) C124H20溶于40ml 乙醇戶賴i照的溶液，4^褐色溶液，翔每此溶MSA空气的情况下,12小时，徵加啡色溶液， 室^^24小时并M， 咖啡色沉淀，过滤出沉淀物，用DMF洗涤，再用少量乙S ^涤， 真空千激导到相应的三倾配，Ba Bh。
分别将200mg的三催配糊Ba Bh溶于10ml 7jCf 口 5ml甲醇中，力口入少量6mol/LNaOH溶 液，调节溶液的PH为IO，然后室温下,12小时，过滤出沉淀物，'搶液中加入少量醋酸，中和 至PH=5，用乙酸乙,取溶液，有机相用^7K硫,千燥，繊，得，，用薄层,1析赫柱 层析分离，乙酸乙酚正己烷=1: l为展开剂，分离出目的，，用乙酸赫乙醇重结晶，得纯品 2-(2-羟基苯基)苯并咪 配体化^13a 3h。
将上步顿的3a， 3b，3c,3(Uh配体化^f2mg分别溶于10ml乙醇，与^f只等摩尔硫, 7jC溶^S^温下形成配糊，常鹏发^IJ， ；^以乙醇和去离子水各洗涤三次，即得2-(2名基 ^^萄苯并咪1 ^生物-铜配^/产物，分别称为3a"Cm 3b"Cu^ 3o(X 3d-Cu和3h《u。
配体化激3a的基本,
NMR (400MHz^ deuteriodimethyl sulfoxide): .5= 13.22 (br s， 2F^ OH and NH), 8.10 (d4 lli arom H J = 1.6,7.2 Hz)， 7.76 " lli arom H J =5.6 Hz)， 7.65 (4 arom Ii J =5.6 Hz)， 7.44~7.32 (11% 3H, arom H), 7.10-7.04 arom H); 13C nmr (100 MHz^ deuteriodimethyl sulfoxide):. = 157.9,
151.6， 140.7, 133.0， 131.7, 126.2， 126.0, 123.2， 122.3， 119.0, 117.1, 112.5, 111.4; EI-MS: m/z (relative intensity) = 210 (100，), 182 (20)， 91 (18), 78 (14).
配体化，3b的基本M:
& NMR (400MHz^ deuteriodimethyl sulfoxide): 6^ 13.35 (br s， OH)， 13.00 (s， NH)， 7.95 " 1H,咖m H J = 8.4 Hz), 7.62 (cH 2H, arom H J = 3,2， 9.2 Hz)， 7.25 (私2H, arom H J = 3.2,9.2 Hz)， 6.62 (d《lli arom H, J = 2.4,8.4 Hz)， 6.58 (41H, arom Ii J = 2.4 Hz)， 3.80 (s, 3H， C恥);13C證(100 MHz^ deuteriodimethyl sulfoxide) . = 162.2,159.7， 151.6,139.9， 132.8,127.5,127.3,122.6,122.4,106.5, 105.3,101.4， 101.3, 55.4; H-MS: ni/z (relative intensity) = 240 (100,1VT ), 197 (24)， 169 (7), 143 (5), 120 (6)， 106 (7)， 65 (7).
配体化激3c的基本繊
& NMR (400MHz, deuteriodimethyl sulfoxide): 5= 14.68 (br s， 1H， NH), 12.09 (hr s， 1H， OH)， 7.64(d4 2H， arom H J = 3.2， 9.2Hz)， 7.23 (d4 arom H J = 3.2， 9.2 Hz)， 6.35 (s, 2H, arom H)， 4.01 (s， 3H， CH3。)， 3.80 CH30); 13C nmr (100 MHz^ deuteriodimethyl sulfoxide): . = 162.3， 161.6， 158.8，
150.2， 139.0,132.4， 122.3， 122.2， 116.8,111.9， 95.3， 94.3,90.2， 55.6， 55.1; EI陽MS: m/z (relative intensity) =270 (100，)， 240 (16)， 193 (20), 143 (12)， 136 (20)， 121 (17)， 78 (6), 65 (5)， 58 (10).
爿na/. Calcd. for C15H14N203: C， 66.66; H 5.22; N, 10.36. Found: C， 66.38; H， 5.31; N, 10.13.
配体化，3d的鉢繊
NMR(400MH^ deuteriodimethyl sulfoxide): 5= 13.26 (br s, 2H， OH and NH)， 8.15 " 1H， arom H J = 2.8 Hz)， 7.80 " lli arom H J = 8.4Hz)， 7.69 (4 1H arom H, J = 8.4 Hz), 7.47 (d4 lli arom H， J =2.8， 8.8 Hz), 7.37 (hr s, 2H, arom H)， 7.14 " 1H， arom H J = 8.8 Hz); 13C證(100 MHz^ deuteriodimethyl sulfoxide): . = 156.5， 150.1， 133.2， 133.1， 125.5， 125.4， 123.1， 123.0,122.6， 122.5， 119.0， 118.9， 113.9;EI-MS: m/z (relative intensity) = 246 (33， +2)， 244 (100, )， 216 (8), 181 (16)， 149 (7), 90 (11)， 57 (10).
配体化^|311的基本 :
nmr(400MH^ deuteriodimethyl sulfoxide): 5=13.24(br s, l还NH)， D.10(br s， 1H， OH)， 8.14(4 lli arom H J=2.8Hz)， 7.59" 1H， arom H， J=8.0Hz)， 7.45(br s， arom H), 73, 1H， arom H J=2.8, 8.8Hz)， 7.12(4 lli arom Ii J=8.0Hz), 7.06(4 arom Ii J=8.8Hz), 2.45(s， 3H, CH3); 13C nmr (100
MHz^ deuteriodimethyl sulfoxide): S= 156.4， 149.5,133.2， 131.1， 125.5， 125.4， 124.7， 122.6， 122.5， 118.9,
113.9， 113.8,21.3; EI-MS: m/z (relative intensity) = 260 (31, NT +2)， 258 (91，)， 193 (97)， 136 (100)，
107 (66), 77 (33)， 58 (53).
爿na/. Calcd. for C14HUC1N20: C， 65.00; H 4.29; N， 10.83. Found: C， 64.71; H， 4.40; N, 10.62.
鄉例2:化糊4a，4b，4c，4d，4e，4f的共同合鹏駄其鹏糊的合成
分别将300mmol取f^jC杨斷la lf) M拌下溶于125ml的甲醇中，然后加入ISOmmol的邻
萘二胺(2)，室fflt半1小时，^S应的沉淀物，过滤收敏淀物，甲l^fe涤，真空千Mt导到
配体Da Df。
分别将13mmol的配体Da~Df溶于100ml氯仿中，再加入由2.5gMn (n) C124H20溶于40ml 乙醇鹏暢的溶液，4 色溶液，翔每此溶S^1A空气的情况下離12小时，娜啡色溶液， 室M^24小时并繊，顿咖啡色沉淀，过滤出沉淀物，用DMF洗涤，再用少量乙^fe涤， 真空千Mf寻到三籠配^tl Ea^Ef。
分别将200mg的三i/r^配^！ Ea~f溶于10ml 7KfB 5ml甲醇中，加入少量t&和的NaOH溶液， 调节溶液的PH为10，然后室温下離12小时，过滤出沉淀物，滤液中加入少飄酸，中和至 PH=5，用乙酸乙酯提取溶液，有机相用^7K硫,千燥，t缩，得产物，用薄层层析或者腺 析分离，乙酸乙酚正己烷l: l为展开剂，分离出相应的目的,，用乙酸或者乙醇重结晶，得纯品4a 4f。
分别将上步顿的4b, 4c， 44 4e, 4f 2mg溶于10ml乙醇，与^R等摩尔硫,水溶鹏 室温下形成配^tl，常Sf发^FU， ^以乙醇和去离子水各洗涤三次，即得2-(2-,5S^^湊并 咪挫^f行生物-KHg^t;产物，分别称为4a-C^ 4b"Cu^ 4c-Cu^ 4d-Cu^ 4e《u和4f"Cu。
配体化^t!4b的基本im:
'H nmr(400MH^ deuteriodimeihyl sulfoxide): 5=13.50(br s， 1H, NH), 13.03(br s， OH)， 8.18(br s， 1H arom H)， 8.05(4 arom H， J=8.8Hz)， 8.oi(br s, 1H aiom H), 8.02(m^ arom H)， 7.40(m^ 咖m H), 6.68(d4 IH arom H， J=2.8， 8.8Hz), 6.63" 1H， arom J=2.8Hz)， 3.84(s， 3H， OCH3); 13C nmr
(100 MHz^ deuteriodimethyl sulfoxide): 5= 162.8， 162.6， 156.0, 141.6， 141.5， 130.0， 127.98, 127.94，
127.85,127.82， 123.56， 123.50， 113.67， 113.62， 106.7,105.2， 101.4， 55.4; EI-MS:m/z (relative intensity" 290 (100， M), 261 (120)， 247 (23), 219 (6)， 193 (4). Jna/. Calcd for C18H14N202: C， 74.47; H 4.86; N，
9.65. Found: C， 74.21; H 4.95; N， 9.48.
其它配体化的基本娜略
鄉例3:配^WNO的选離
取3a-OUcM:iUh-Cu^4W:u，溶于DMSO中，至终浓度为lmmol/L。向96孑L板中加入各种 铜配J，分另咖入亚硝微，铵根，硝離，过氧{複，ONOCT， NO，而后向鄉样品中补加 去离子水，使針孔得到探汁浓度是100,1/L。亚硝艦，铵根，硝麟，过氧化氢，ONOa， NO的摩尔量分别为相应探针的100倍。反应1小时后在,示处测定荧光3艘，鹏后的荧光强 度除以原本铜离子复^tl的荧光强度，进行荧光值的归一化(noimalized)。结果如图1 B^，其 中，A是3a《u、 B是3d-Cu、 C是3h-Cu、 D是4M:u。
由图中可以看出，徽3a-Cu^3d-CA 3h-Cu^4l>Cu对NO具有很高的选择性和灵敏度。
实施例4:配，3a^3cUh， 4b~Cu与NO M^的荧光图谱
麟针34 3d3h4W:u溶于DMSO中，至终浓度为100pmoI/L，与1000当量的NO反应15 ，后，测定荧光弓驢变化，驗光分别为3a-Cu:316nm， 3d-Cu:326nm， 3h-Cu: 326nm， 4l>Cu: 353nm。结果如图2，其中，A是3a-Cu、 B是3d《u、 C是3h-Cu、 D是4b^Cu。所有的荧光弓艘 进行归一化(normalized )。由图中可以得出,配^t;的本底荧光3艘在一个很低的本底水平，而跟no反应后，荧光 弓艘在i餅内即剤腿著的增强。这种荧光增强的'鹏性和明显性说明这几f^f^针完全可以用
于NO的即时测定。
其他配，(除3b"Cu和3c-Cu夕卜，这两种化，跟NOH^后不具有荧光增强性)显示出 类似的荧光光谱睐
实施例5:配，4b>Cu检测细胞内NO的实验
取4b"Cu配，溶于DMSO中，浓度为lmmol/L，力口入RAW264.7细胞中，探针的终浓度为 10nmol/L。 RAW264.7细胞以含有10%小牛血清的Dulbecco，s modified Eagle's medium if^iS行 i^。在1 12小时后照荧光照片作为空白对照;用M杆菌脂多糖LPS(500ng/ml)刺激RAW264.7 细胞后，同样加A^浓度为10Mmol/L的4b"Cu,每隔2小,摄荧光照片。为了确认4b"Cu在细 胞内的荧光增^^应于NO的顿，我们取1分Raw264.7细胞，在以LPS刺'鄉lfet前，加 入NO合成酶的抑制剂1400w (N-[3"(aminomethyl)benzyl]acetamidine),同步"ia行荧^M测，结果 如图3。
从图3中看，探针4b"Cu的检测结果非常明显，在普通的RAW264.7细胞中，它的荧光5SJ^R 有微弱的增强，这可能与RAW264.7细胞本j^生的NO量有关，而在LPS剌、,RAW264.7细 胞中，4b"铜复激的荧光^gW了很大的提高，在10 12小时这个区域内荧光3驢超IJ了一个 极大值，这与LimM.H.等人的结果很吻合(Nature Chemical Biology, 2， 375-380， 2006)，而当加入 NO合成,制剂1400w后，LPS臓导的相应荧光3艘升i^嫁消失，证明4b~Cu鄉胞内的 荧光变舰应于细胞内即时的NO变化，因此t隨合作细胞内NO的实时直接检测荧光徽。
实施例6: 配糊4b^Cu荧光^"测急14fF损伤舰(Acute Severe Hepatic Injuiy, ASffl)
小,中NO局^l^化(冰冻切片)
取Balb/c小鼠(雄性，8周左右，18 20g)， M0i4lt 300mg/kg的氨基半乳糖和5ng/kgLPS 诱导急'断损伤，6个小时后，进行肝门静咏皿41>01 (10mg^g，溶于DMSO:生S^/JC =1: l的混合溶液中)，半小时后处死小鼠，取肝于一20。C冰冻，接着肝组织浸润于OCT复^/中1小时(SakuraFinetek公司，Torrance, CA)，于一22'C以Sakuracm—41冰冻切片机切成4Mm厚 的薄片，4'C翻加于薄片进根且织固定，固定后1小时进行荧舰微徵见测。结果显舒图4。 从图4可以看出，急'SfF损伤小鼠的肝中4b-Cu的荧光3艘有了显著的提高，而正常小鼠肝中荧 光亏艘提高不慰艮明显。为了舰4W:u在体内的荧光弓艘变化也是NO相关的，我们以三氯化 钆(GdCl3) (10mg/kg)職24小时尾静咏湖Balb/c小鼠，去除NO顿细胞K，ffere细胞， 再以GalN+LPS诱导急断损伤炎症。诱导后半小时,门静咏激眷Cu微10mg/kg， 由于巨噬细胞的消除，肝冰冻切片中的3麟光消失，证明4b"Cu徽在急'l4lf损伤中确^t测的 是肝中的NO变化，仍参见于图4。在急'SfF损伤中，肝脏组织是免 胞(尤其是巨噬细胞)的 攻击)^，急性的ifeg也会伴随着组织中NO浓度的;U:升高。这与4b"铜复，的检测结果是一 致的。
实施例7: 4b"Cu和NOM^TO盼测定
为了测定和NO反应后物质的结构，我们M3lMALDI-TOF (基质辅助的激，离厲子化飞 行质i普，Bruker Autoflex n timeof-flight (TOF)质i靴(Bruker Daltonics, Billerica^ MA)测定了 4b~Cu 和NO SiS itr后^量的变化。m^激光波长为X=337nm， a-氰S^羟基肉桂酸(HCCA)作为 做基质，在点样feJl的上样量为基质1W，复^t/0.5Ml。结果参见图5 (A)和(B)。与原化合 物对比，对于41> ^|而言，m/z(4b)是289.887, m/z=351.893 4惊了[4b4Cu"-H^,m/zp633.962 條[2(4b) +012+-21^， andm/z=319.415條[4嫌0-rf]。
同时，以Nexus 870 FT-IR傅立叶变换红外测定仪测定4b"Cu和NO M^tr后的光i魏化。结 果参见图5 (C)和(D)。与原化^tl对比，SSAT^cm-1峰的娜，以及1500cnT1， 1103.0011_1处 峰的出现，证明了-N-N《基团的产生，结合^^量变化的结果，可鄉ij腿后，结构如下
权利要求
1. 一种测定一氧化氮生成的荧光探针，其特征在于该荧光探针是二价铜离子Cu2+与有机配位体2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物形成的铜配合物，其结构为式(I)或(II)id="icf0001" file="S2008100532455C00011.gif" wi="119" he="32" top= "56" left = "47" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/> 4a-CuR1＝R2＝R3＝H；3a-CuR1＝R2＝R3＝R4＝H，R＝H 4b-CuR1＝R3＝H R2＝OMe3b-CuR1＝R3＝R4＝H，R2＝OMe，R＝H 4c-CuR1＝H，R2＝R3＝OMe3c-CuR1＝R3＝H，R2＝R4＝OMe，R＝H 4d-CuR1＝R3＝H R2＝Cl3d-CuR1＝R2＝R4＝H，R3＝Cl，R＝H 4e-CuR2＝R3＝H R1＝OMe3h-CuR1＝R2＝R4＝H，R3＝Cl，R＝CH3 4f-CuR1＝R3＝H R2＝OH。
2、一种权利要求l臓的荧光探针的合舫法，辦征在于&分别将300mmo1取f^K杨醛(la<l) #下溶于125ml的甲醇中，然后加入15Ommo1 的取代邻苯二胺(2a或2b)用刊ij备式(I )的 2^1，或加入150mmol的取代邻萘二胺(2)用刊恪式(n)的iffi激，室w^半i小时，^a应盼沉淀物，过滤iB^:淀物，甲麟涤，真空千Bt寻到配体Aa-h或Da-f;b. 将13mmo1的配体Aa-h或Da-f溶于100ml氯仿中，再加入由2.5g Mn (n) C12'4H20溶于 40ml乙醇MU得的溶液， 褐色溶液，翔每此溶KfflA空气的情况下搅拌12小时，得咖啡 色溶液，室 #24小时并 ， ^fe咖啡色沉淀，过滤出沉淀物，用DMF洗涤，再用少量乙 ,涤，真空千激寻到三籠配激Ba-h^Ea-f;c. 将200mg以上得到的三ifi^配^1 B溶于10ml tKI口 5ml甲醇中，力口入少量6mol/L NaOH 溶液，调节溶液的PH为IO，然后室温下,12小时，过滤出沉淀物，赚中加入少量醋酸，中 和至PH=5，用乙酸乙酯提取溶液，有机相用^7K硫,千燥，、鹏，得，，用薄层层析或者 ttM析分离，乙酸乙醱正己烷=1: 1为展开剂，分离出目的产物，用乙酸或者乙醇重结晶得到2-(2-P5基^S)苯并咪P^I^生物3a-h 4a-f;d. 分别社步生成的2-(2-羟基^S)苯并咪Pi^^生物3a-h^ 4a-f 2mg溶于10ml乙醇，与等体3卜Cu: R广RfR4-H， R2=OMe, R=H 3c-Cu: R广RfH, R2=R4=OMe, R=H 3d-Cu: RfRfF^H, R3=C1, R=H 3h陽Cu: R^R^R^H, R3=C1, R=CH34a-Cu : & =R2=R3= H; 4b-Cu: R广R^H R2=OMe 4c-Cu : R广H, R2=R3=OMe4d隱Cu:R产RfHR2K:i 4isCu: R2=R3=H R广OMe 4f-Cu: R产R广H R2=OH积等摩尔硫,水溶^^温下形成配^t/，常Sf^FU， rt/以乙醇和去离子zK各洗涤三次, 即得2"(2一逮^S)苯并咪t^^生物-llllfi^t1^ 3a-h-Cu^ 4a-fCu。
3、 一种权利要求l臓的荧光徽的顿，辦征在于在錢生物及非生物环境中，利用 臓的舰激荧光探针捕辦系中的NO，使得荧光徽的荧光^SM著增强，然后淑荧光测 定、^I5确定N0的产生。
4、 根据权利要求3皿的鹏，，征在于,荧光测定法除了常规的荧光测定法外，还 包括时间^^光测定法及时间i)fJ荧^^微M^像测定法。
5、 根据权利要求3,的自，，征在于iSffl于化学体系中的NO的检测。
6、 根据权利要求3m的应用，，征在于应用于生物、^lfi^^且织内的NO的分析检 测麟爐象检测。
7、 根据权利要求3 m的iSffl，，征在于自于病理研究中NO的检测i叙U盒，进行 NO即離测。
全文摘要
本发明涉及一种测定一氧化氮生成的荧光探针及其应用。该荧光探针是二价铜离子Cu²⁺与有机配位体2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物形成的铜配合物，具有如下式(I)或(II)的结构。该配合物可简单迅速的进入活细胞，进而特异性的捕获细胞或组织中的活性NO，导致配合物的荧光强度显著增强，进而可以应用于化学体系中NO的检测，生物活细胞或活组织内的NO的分析检测和荧光成像检测，临床医学上病变组织中NO的检测以及生物活体的NO即时检测。本发明的荧光探针具有极高的NO测定灵敏度，其最低检测下限为17nmol/L，对NO有很好的选择性，和NO反应前后荧光变化迅速，荧光稳定，同时该探针具有稳定性好，能够长期保存使用，适用于中性，弱酸性及碱性多种环境。
文档编号G01N21/64GK101302425SQ20081005324
公开日2008年11月12日 申请日期2008年5月26日 优先权日2008年5月26日
发明者张峻峰, 张有来, 李明亮, 欧阳杰, 沈红芹, 浩 洪, 勇 赵 申请人:天津理工大学