专利名称：早期糖尿病周围神经病变的检测芯片及其制备和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种早期糖尿病周围神经病变的检测芯片及其制备 和应用，属医疗器械分子诊断的技术领域。
背景技术：
随着经济的发展和人们生活方式的改变，以及人口老龄化，糖尿 病患者的数量迅速增加。糖尿病周围神经病变是糖尿病致残、致死的 主要原因，其诊断目前主要通过临床表现计分，并结合电生理检査技 术来明确，但上述现有方法操作复杂，检査准确性受患者配合度的限 制，且对早期周围神经病变的敏感度均较差，难以成为有效的筛査手 段，不能提供适应目前糖尿病周围神经病变患者所需要的早期准确诊 断的高通量标准化检测。
血清蛋白质水平改变常出现于疾病病理及功能改变的更早期，具 有成为预警和早期诊断指标的潜力。目前，对于血清中特异性蛋白的 检测主要依赖于ELISA技术，费用昂贵，而且需要较大量的标本和 试剂，限制了其在大规模筛选中的应用。蛋白芯片技术将各种蛋白质 有序地固定于载体上成为检测用的芯片，集微电子、微机械、化学物 理技术、计算机技术为一体，可同时对多种蛋白质进行检测分析，逐 步发展成为临床诊断等领域的重要技术手段。
但是，蛋白芯片的制备与分析也同时面临着更多的挑战。首先， 受血清蛋白质浓度限制，检测灵敏度难于达到应用研究中的要求；其 次，蛋白质本身复杂的分子结构与各向异向性，为蛋白质在芯片上的 有效固定增添了难度；此外，多个分析物的同时分析也为发展新的分 析模式提出了要求。
本发明利用质谱技术鉴定出的糖尿病周围神经病变患者外周血 清中具有临床诊断意义的标志性蛋白COPE、 DEFA1、 N0TCH1和 BCL-6,构建了一种用于临床诊断糖尿病周围神经病变的检测芯片，
通过优化试验条件实现了有效固定待测蛋白质抗体于基片，质量控制 稳定，数据分析标准化，检测结果可信度高的要求，为糖尿病周围神 经病变提供了一种非侵入性，敏感度和特异性均较好的筛检手段，以解 决现有糖尿病周围神经病变不易早期确诊和检测成本高的问题。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种早期糖尿病周围神经病变的检 测芯片。该检测芯片包括基片1、反应池2和检测微阵列3，其特征 在于，基片1是上表面沉积有琼脂糖凝胶薄膜10的玻片11，琼脂糖 凝胶薄膜的表面设置有反应池2，反应池2由中空正方形的硅橡胶框 4围成，反应池2的个数为n， n介于l 12，硅橡胶框4的边长介于 0.2mm 10mm，每个反应池2的池面上点有检测微阵列3，检测微阵 列3是由蛋白微型固相检测点排列而成的5行xm列的矩形阵列，其 中m是介于3~7的自然数，每一行的所有蛋白微型固相检测点的成 分都相同，5行蛋白微型固相检测微阵列点分别是HIgG蛋白微型固 相检测点30、 Mc抗COPE蛋白微型固相检测点31、 Mc抗DEFA1蛋 白微型固相检测点32、 Mc抗N0TCH1蛋白微型固相检测点33和 Mc抗BCL-6蛋白微型固相检测点34。
本发明的第二个目的是提供所述检测芯片的制备方法。 实现上述目的，本发明采用以下技术方案，现详细说明如下。 一种早期糖尿病周围神经病变的检测芯片的制备方法，其特征在 于，以HIgG、 Mc抗COPE、 Mc抗DEFA1、 Mc抗N0TCH1和Mc 抗BCL-6为原料，具体操作步骤 第一步制备基片1
将1.0wto/o 2.0wt^琼脂糖溶液30ml与1 Onmol/L NaI04溶液10 ml 混合，搅拌均匀，得到混和液40ml，备用，用传统方法洗涤玻片11 并晾干，用胶框将1.0ml 4.0ml混和液封闭在玻片11上，室温冷却， 氮气吹干，琼脂糖凝胶薄膜IO沉积于玻片11的表面，制得基片l;
第二步制备五种不同蛋白的溶液用BPS分别稀释五种蛋白HIgG、 Mc抗COPE、 Mc抗DEFA1、 Mc抗NOTCH1禾卩Mc抗BCL-6至它们的浓度介于 10pg/ml ~200ng/ml，得五种不同蛋白的溶液；
第三步制备检测微阵列3
用点样仪或点样针将第二步制得的蛋白溶液的液滴点在基片1 的表面上，每行用一种抗体溶液点出m个液滴作为m个微型检测点， m是介于3~7的自然数，第一行用五种蛋白溶液中的一种，第二行用 剩余四种蛋白溶液中的一种，余类推，点完五行后，在基片1的表面 上形成一个由5xm个微型检测点组成的矩形阵列，将基片1放入湿 盒中，室温孵育过夜，PBS洗涤2次，以BSA封闭未反应的醛基， 制得检测微阵列3;
第四步制备反应池2
用透明黏合剂将边长介于0.2mm 10mm的中空正方形的硅橡胶 框4以第三步制得的检测微阵列3正好落在其中空部分中的方式黏贴 在基片1的琼脂糖凝胶薄膜10上，形成反应池2,至此制得早期糖 尿病周围神经病变的检测芯片。
用上法制得的早期糖尿病周围神经病变的检测芯片是n=l的检 测芯片。n是反应池2的个数，n介于1~12，当n〉1时，只需重复n 一l次上法的第三 第四步，得反应池2的个数为n的早期糖尿病周 围神经病变的检测芯片。
本发明的第三个目的是提供使用上述检测芯片检测早期糖尿病 周围神经病变的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。现详细说明如下。
一种用上述检测芯片检测早期糖尿病周围神经病变的方法，其特 征在于，具体操作步骤
第一步检测芯片预处理
检测芯片在室温放置5 min 15min，在反应池2中加入10^1 ~100^1 PBS， 37。C水浴15min 30min，加入浓度为3wt。/。的H202， 室温下封闭10min， PBS冲洗2次，加入浓度为lwt%的BSA，
室温下封闭10min 20min; 第二步标记抗体
以lxPBS 280^1、灭菌甘油權nl ~600^1、40 wt %的海藻糖100^1 和Cy3-BSA 20^1配制标记缓冲液，稀释并标记Mc抗HIgG、 Mc抗 COPE、 Mc抗DEFA1、 Mc抗N0TCH1禾卩Mc抗BCL-6浓度达0.5 g/L ~2g/L;
第三步加待检血清标本
将待检血清标本以1:3~7倍用PBS缓冲液稀释，加入反应池2 中，37'C下孵育20min lh， PBS洗涤基片1; 第五步激光扫描及数据分析处理
使用LuxScan IOK-A扫描仪和GenePixTMPro3.0芯片图像分析软 件测定各点的荧光强度，用Excel软件进行数据分析，至此实现对样 品的检测。
与现有技术比较，本发明具有下述特点
1、 以质谱技术为基础，利用蛋白芯片技术，通过检测血清中糖 尿病周围神经病变相关蛋白的存在与含量，为其早期诊断提供依据， 具有重要临床应用价值。
2、 检测方法简便，成本低廉
以血清为待检样品，需要样品量少， 一张芯片可检测数位至数十 位患者的血清，适合人群筛査使用。
3、 信息通量高，特异性强、灵敏度高
每次检测可提供一份血清中四种糖尿病周围神经病变差异性表 达蛋白的相关信息，使糖尿病周围神经病变的诊断符合率由原来的 50% (传统体格检査方法)提高到接近80%。
4、 稳定的质量控制，检测结果准确可靠
高度纯化单克隆抗体蛋白保证了芯片抗体质量的稳定，同时每个 反应池有独立的质控微阵列，检测结果以智能化分析软件判定，减少 导致了检测误差的因素。
图1是本发明的检测芯片示意图，图中，1是基片，2是反应池， 3是检测微阵列，4是硅橡胶框，A-A处有纵向截面。
图2是图1所示的本发明的检测芯片在A-A处的纵向截面图， 图中，IO是琼脂糖凝胶薄膜，ll是玻片。
图3是检测微阵列3的结构示意图，图中，30是HIgG蛋白微型 固相检测点，31是COPE蛋白微型固相检测点，32是DEFAl蛋白微 型固相检测点、33是NOTCHl蛋白微型固相检测点，34是BCL-6 蛋白微型固相检测点。
具体实施方法 现结合附图和实施例，详细说明本发明的技术方案。 实施例l一3完全按照上述的检测芯片制备方法所述的具体操作 步骤进行操作，以下每个实施例仅列举关键技术数据。 实施例1
第一步中，琼脂糖溶液的浓度为1.0wt%，封闭在玻片11上的混 和液为1.0ml;第二步中，用BPS稀释HIgG、 Mc抗COPE、 Mc抗 DEFA1、 Mc抗NOTCHl和Mc抗BCL-6至浓度为10pg/ml;第三步 中，m=3;第四步中，硅橡胶框4的边长为0.2mm。
实施例2
第一步中，琼脂糖溶液的浓度为1.5 wt%，封闭在玻片11上的混 和液为2.5ml;第二步中，用BPS稀释HIgG、 Mc抗COPE、 Mc抗 DEFAl、 Mc抗NOTCHl和Mc抗BCL-6至浓度为lOO^ig/ml;第三步 中，m=5;第四步中，硅橡胶框4的边长为5 mm。
实施例3
第一步中，琼脂糖溶液的浓度为2.0 wt%，封闭在玻片11上的混 和液为4.0 ml;第二步中，用BPS稀释HIgG、 Mc抗COPE、 Mc抗 DEFAl、 Mc抗NOTCHl和Mc抗BCL-6至浓度为200pg/ml;第三步 中，m=7;第四步中，硅橡胶框4的边长为10mm。
实施例4用检测芯片检测早期糖尿病周围神经病变 本实施例的实施过程与上述用检测芯片检测早期糖尿病周围神
经病变的技术方案的描述完全一致，本实施例仅列举关键的技术数据。
第一步中，检测芯片室温放置15min，在每个反应池2中加入 10plPBS， 37。C水浴30min，加入1 .Owt% BSA50pl，室温下封闭20min; 第二步中，以lxPBS 280^1、灭菌甘油600^1、 40 wt %的海藻糖100^1 和Cy3-BSA 20nl配制标记缓冲液，稀释并标记Mc抗HIgG浓度达 lg/L;第三步中，将待检血清标本以1:7倍用PBS缓冲液稀释，加人 反应池2中，37X:下孵育lh;第四步中，在反应池2中加标记的Mc 抗HIgG40pl， 37'C下孵育lh，加甘油与2.0 wt %PBS1:1混和制剂封 片；第五步中，使用LuxScan 10K-A扫描仪扫描Cy3通道，调整扫 描参数Power至95， PMT至900， 曝光时间为335.5s ，用 GenePixTMPro3.0芯片图像分析软件测定各点的荧光强度，用Excel 软件进行数据分析，至此实现对样品的检测。
权利要求
1.一种早期糖尿病周围神经病变的检测芯片，包括基片(1)、反应池(2)和检测微阵列(3)，其特征在于，基片(1)是上表面沉积有琼脂糖凝胶薄膜(10)的玻片(11)，琼脂糖凝胶薄膜(10)的表面设置有反应池(2)，反应池(2)由中空正方形的硅橡胶框(4)围成，反应池(2)的个数为n，n介于1～12，硅橡胶框(4)的边长介于0.2mm～1.0mm，每个反应池(2)的池面上点有检测微阵列(3)，检测微阵列(3)是由蛋白微型固相检测点排列而成的5行×m列的矩形阵列，其中m是介于3～7的自然数，每一行的所有蛋白微型固相检测点的成分都相同，5行蛋白微型固相检测微阵列点分别是HIgG蛋白微型固相检测点(30)、Mc抗COPE蛋白微型固相检测点(31)、Mc抗DEFA1蛋白微型固相检测点(32)、Mc抗NOTCH1蛋白微型固相检测点(33)和Mc抗BCL-6蛋白微型固相检测点(34)。
2、 一种早期糖尿病周围神经病变的检测芯片的制备方法，其特 征在于，以HIgG、 Mc抗COPE、 Mc抗DEFA1、 Mc抗N0TCH1和 Mc抗BCL-6为原料，具体操作步骤第一步制备基片(1)将1.0wt。/o 2.0wt^琼脂糖溶液30ml与10nmol/LNaIO4溶液10 ml 混合，搅拌均匀，得到混和液40ml，备用，用传统方法洗涤玻片(11) 并晾干，用胶框将1.0ml 4.0ml混和液封闭在玻片(11)上，室温冷 却，氮气吹干，琼脂糖凝胶薄膜(10)沉积于玻片(11)的表面，制 得基片1;第二步制备五种不同蛋白的溶液用BPS分别稀释五种蛋白HIgG、 Mc抗COPE、 Mc抗DEFAl、 Mc抗NOTCH 1和Mc抗BCL-6至它们的浓度介于1 Opg/ml ~200tig/ml ， 得五种不同蛋白溶液；第三步制备检测微阵列(3)用点样仪或点样针将第二步制得的抗体溶液的液滴点在基片(l) 的表面上，每行用一种抗体溶液点出m个液滴作为m个微型检测点， m是介于3 7的自然数，第一行用五种抗体溶液中的一种，第二行用 剩余四种抗体溶液中的一种，余类推，点完五行后，在基片(1)的 表面上形成一个由5xm个微型检测点组成的矩形阵列，将基片(1) 放入湿盒中，室温孵育过夜，PBS洗涤2次，以BSA封闭未反应的 醛基，制得检测微阵列(3); 第四步制备反应池(2)用透明黏合剂将边长介于0.2mm 10mm的中空正方形的硅橡胶 框(4)以第三步制得的检测微阵列(3)正好落在其中空部分中的方 式黏贴在基片(1)的琼脂糖凝胶薄膜(10)上，形成反应池(2)， 至此制得早期糖尿病周围神经病变的检测芯片。
3、 根据权利要求2所述的早期糖尿病周围神经病变的检测芯片 的制备方法，其特征在于，n是反应池2的个数，n介于1~12，当n 〉l时，只需重复n—l次权利要求2所述的方法的第三 第四步，得 反应池2的个数为n的早期糖尿病周围神经病变的检测芯片。
4、 用权利要求1、 2或3所述的早期糖尿病周围神经病变的检测 芯片检测早期糖尿病周围神经病变的方法，其特征在于，具体操作步 骤第一步检测芯片预处理检测芯片在室温放置5 min 15min，在反应池(2)中加入10pl ~100nl PBS， 37。C水浴15min 30min，加入50^1浓度为3wt。/。的H202, 室温下封闭10min， PBS冲洗2次，加入50^1浓度为lwt%的BSA, 室温下封闭10min 20min;第二步标记抗体以lxPBS 280^1、灭菌甘油400p卜600nl、40 wt %的海藻糖100^1 和Cy3-BSA 20nl配制标记缓冲液，稀释并标记Mc抗HIgG、 Mc抗 COPE、 Mc抗DEFA1、 Mc抗N0TCH1禾卩Mc抗BCL-6浓度达0.5 g/L~2g/L;第三步加待检血清标本将待检血清标本以1:3~7倍用PBS缓冲液稀释，加人反应池(2) 中，37。C下孵育20min lh， PBS洗涤基片(1); 第五步激光扫描及数据分析处理使用LuxScan IOK-A扫描仪和GenePixTMPro3.0芯片图像分析软 件测定各点的荧光强度，用Excel软件进行数据分析，至此实现对样 品的检测。
全文摘要
一种早期糖尿病周围神经病变的检测芯片，包括基片、反应池和检测微阵列，基片是上表面沉积有琼脂糖凝胶薄膜的玻片，琼脂糖凝胶薄膜的表面设置有反应池，反应池由中空正方形的硅橡胶框围成，反应池的池面上点有检测微阵列，检测微阵列的尺寸为5行×m列，其中m是介于3～7的自然数，每一行的所有蛋白微型固相检测点的成分都相同，5行蛋白微型固相检测微阵列点分别是HIgG蛋白微型固相检测点、Mc抗COPE蛋白微型固相检测点、Mc抗DEFA1蛋白微型固相检测点、Mc抗NOTCH1蛋白微型固相检测点和Mc抗BCL-6蛋白微型固相检测点。还提供制备所述检测芯片的方法。所述检测芯片特别适于用来检测早期糖尿病周围神经病变。
文档编号G01N33/68GK101368968SQ200810042850
公开日2009年2月18日 申请日期2008年9月12日 优先权日2008年9月12日
发明者刘志民, 玮 汤, 瑛 赵, 邹俊杰 申请人:中国人民解放军第二军医大学