含甲状腺素化合物的分析方法

专利名称：含甲状腺素化合物的分析方法
相关申请的交叉引用
本申请是于2006年2月8日提交的名称为“Amine-containingCompound Analysis Methods”的美国专利申请No.11/350147的部分继续申请，并且本申请要求该申请的权益和优先权，所述美国专利申请No.11/350147要求于2005年2月9日提交的名称为“Amine-containingCompound Analysis Methods”的美国临时申请No.60/651,734的权益和优先权，这两个申请各自的全部公开内容通过引用并入本文中。
引言 含胺化合物代表重要的生物学和医药学化学物。含胺化合物的实例包括蛋白质、肽、多胺、氨基酸、儿茶酚胺和硝基呋喃代谢物。用于定量含胺化合物的当前方法包括利用紫外可见(UV)荧光或电化学检测的高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱法联用质谱法(LC/MS)以及串联质谱法(MS/MS)。
通过上述方法进行含胺化合物的绝对定量可能存在问题。例如，为通过HPLC分析多种含胺化合物，在分析之前必须进行困难又耗时的衍生化步骤。此外，HPLC具有分析时间长、运行之间偏差大、缺乏多重能力(multiplexing capability)以及非特异性等缺点。
更近些时候，利用LC/MS和MS/MS进行含胺化合物的检测和定量提供了下述优点灵敏度和特异性增加、以及具有迅速测量一种样品中多种含胺化合物的能力。然而，这些技术缺乏多重分析能力。为进行绝对定量，要将昂贵的同位素富集化合物用作内标物，所述内标物与某些串联质谱方法不相容。


发明内容
本教导提供了利用同量异位(isobaric)标记物和母离子-子离子跃迁监测(parent-daughter ion transition monitoring，PDITM)分析一种或多种样品中的一种或多种含胺化合物的方法。在多个方面，本教导提供了测定一种或多种样品中的一种或多种含胺化合物的相对浓度、绝对浓度、或相对浓度和绝对浓度两者的方法。在多个实施方案中，本教导提供了可以多重分析方式测定样品中的多种含胺化合物、或者多种样品中的一种或多种含胺化合物、或者它们的组合的的相对浓度、绝对浓度、或相对浓度和绝对浓度两者的方法。
可应用本教导的多个实施方案的含胺化合物可来自各种来源，例如生理流体样品、细胞或组织裂解物样品、蛋白质样品、细胞培养样品、发酵液培养基样品、农产品样品、动物产品样品、动物饲料样品、供人消费的食物或饮料的样品、以及它们的组合。在多个实施方案中可将本教导用于广泛的含伯胺化合物，所述含伯胺化合物包括但不限于氨基酸、儿茶酚胺、硝基呋喃代谢物、多胺、肽、蛋白质、多肽、以及它们的组合。
术语“同量异位标记物组”、“同量异位标签组”可互换使用，指例如一组试剂或化学结构部分，其中所述组的成员(即个体的“同量异位标记物”或“同量异位标签”)具有基本相同的质量但其中所述组中每一个成员在经受离子断裂(例如通过碰撞诱导解离(CID)、光诱导解离(PID)等)时均可产生不同的子离子(daughter ion)信号。可用于区分组中成员的同量异位标签或标记物的子离子可称为所述同量异位标签或标记物的报告物离子。在多个实施方案中，同量异位标签组包含胺衍生的含胺化合物，在缺乏断裂的情况下，其基本上不能通过色谱学方法区分并且基本上不能通过质谱学方法区分，但在CID后其产生了强的低质量MS/MS信号离子。
术语“母-子离子跃迁监测”或“PDITM”指例如利用质谱法的测量，由此选择第一质量分离器(常称为质谱法的第一维)的所传输质量电荷比(m/z)范围以便将分子离子(常称为“母离子”或“前体离子”)传递到离子裂解器(例如碰撞池、光解离区域等)中以产生片段离子(常称为“子离子”)，并且选择第二质量分离器(常称为质谱法的第二维)的所传输m/z范围以便将一种或多种子离子传递到测量所述子离子信号的检测器。所监测的母离子和子离子质量的组合可称为所监测的“母离子-子离子跃迁”。对于给定的所测母离子-子离子组合而言，检测器处的子离子信号可称为“母离子-子离子跃迁信号”。在本教导的多个实施方案中，所述母离子是利用同量异位标签标记的含胺化合物，所述子离子是所述同量异位标签的报告物离子；因此，对于给定的同量异位标记的含胺化合物的母离子而言，在检测器处所测量的报告物离子的离子信号可称为“含胺化合物-报告物离子跃迁信号”。同样，对于给定的同量异位标记的标准化合物而言，在检测器处所测量的报告物离子的离子信号可称为“标准化合物-报告物离子跃迁信号”。
例如，母离子-子离子跃迁监测的一个实施方案是多重反应监测(MRM)(又称为选择性反应监测)。在MRM的多个实施方案中，对给定母离子-子离子跃迁的监测包括使用第一质量分离器(例如停在目标母离子m/z上的第一四极杆)来传输目标母离子，利用第二质量分离器(例如停在目标子离子m/z上的第二四极杆)来传输一种或多种目标子离子。在多个实施方案中，可通过使用所述第一质量分离器(即停在目标母离子m/z上的四极杆)来传输母离子并在其中包括所述一种或多种目标子离子m/z值的m/z范围内扫描所述第二质量分离器而进行PDITM。
例如，串联质谱仪(MS/MS)仪器(或者更一般而言，多维质谱仪(MSn)仪器)可用于进行PDITM，例如MRM。合适的质量分析器系统的实例包括但不限于含有三重四极杆、四极杆线性离子阱、四极杆TOF以及TOF-TOF中一种或多种的那些系统。
在多个方面，本教导提供了利用同量异位标签和母离子-子离子跃迁监测(PDITM)来分析一种或多种样品中的一种或多种含胺化合物的方法。在多个实施方案中，方法包括以下步骤(a)利用来自一组同量异位标签中的不同同量异位标签分别标记一种或多种含胺化合物，所述同量异位标签组中的每种同量异位标签均包含报告物离子部分；(b)合并每种同量异位标记的含胺化合物的至少一部分以产生合并样品；(c)对所述合并样品的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测；(d)测量一种或多种被传输报告物离子的离子信号；以及(e)至少基于所测的相应报告物离子的离子信号与所测的标准化合物的一种或多种离子信号的比较，来测定一种或多种同量异位标记的含胺化合物的浓度。因此，在多个实施方案中，可以多重分析方式来测定多种含胺化合物的浓度，例如通过合并两种或更多种同量异位标记的含胺化合物以产生合并样品，并对所述合并样品进行PDITM(其中监测两种或更多种同量异位标记的含胺化合物的报告物离子)。
在多个方面，提供了分析一种或多种样品中的一种或多种含胺化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供标准化合物；(b)利用来自一组同量异位标签中的同量异位标签标记所述标准化合物；(c)利用来自所述同量异位标签组中的不同同量异位标签分别标记一种或多种含胺化合物；(d)合并所述同量异位标记的标准化合物的至少一部分与各种所述同量异位标记的含胺化合物以产生合并样品；(e)将所述合并样品的至少一部分加载到色谱柱上；(f)对来自所述色谱柱的洗脱物的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测；(g)测量一种或多种所传输报告物离子的离子信号；以及(h)至少基于所测的相应报告物离子的离子信号与所测的和所述同量异位标记的标准化合物相对应的报告物离子的离子信号的比较，来测定一种或多种含胺化合物的浓度。
在多个方面，提供了分析一种或多种样品中的一种或多种含胺化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)利用来自一组同量异位标签中的不同同量异位标签标记一种或多种含胺化合物；(b)合并所述同量异位标记的含胺化合物的至少一部分以产生合并样品；(c)将所述合并样品的至少一部分加载到色谱柱上；(d)对来自所述色谱柱的洗脱物的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测；(e)测量一种或多种所传输报告物离子的离子信号；以及(f)至少基于所测的相应报告物离子的离子信号与标准化合物浓度曲线的比较来测定一种或多种同量异位标记的含胺化合物的浓度。
在多个方面，提供了分析一种或多种样品中的一种或多种含胺化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)利用来自一组同量异位标签中的不同同量异位标签标记一种或多种含胺化合物；(b)合并各种所述同量异位标记的含胺化合物的至少一部分以产生合并样品；(c)利用基质辅助激光解吸电离(matrix assisted laser desorption ionization)对所合并样品的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测；(d)测量一种或多种所传输报告物离子的离子信号；以及(e)至少基于所测的相应报告物离子的离子信号与所测的标准化合物的离子信号的比较来测定一种或多种同量异位标记的含胺化合物的浓度。
在多个实施方案中，可通过以下步骤产生标准化合物的浓度曲线(a)提供具有第一浓度的标准化合物；(b)利用来自一组同量异位标签中的同量异位标签标记所述标准化合物；(c)将所述同量异位标记的标准化合物的至少一部分加载到色谱柱上；(d)对来自所述色谱柱的洗脱物的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测；(e)测量所传输的报告物离子的离子信号；(f)针对标准化合物的一个或多个不同的浓度，重复步骤(a)～(e)；以及(g)至少基于在两个或更多个标准化合物浓度上的所传输报告物离子的所测离子信号产生所述标准化合物的浓度曲线。
在多个实施方案中，所述测定一种或多种同量异位标记的含胺化合物之浓度的步骤包括测定一种或多种所述同量异位标记的含胺化合物的绝对浓度。
虽然例如可将同位素富集的氨基酸用作绝对定量氨基酸浓度的内标物，但在MALDI质谱法中使用氨基酸的稳定同位素类似物的一个缺点在于在某些情形下，与基质相关的信号可能干扰目标氨基酸的m/z区域。例如与氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)相关的在约m/z＝147的信号可干扰赖氨酸及其稳定同位素类似物；同样地，与二羟基苯甲酸(DHB)相关的在约m/z＝175的信号可干扰精氨酸及其稳定同位素类似物。在多个实施方案中，本教导提供了利用同量异位标签和PDITM促进减少基质相关信号对来自内标物或目的含胺化合物的信号之干扰的方法。
在多个实施方案中，所述一种或多种目的含胺化合物包含赖氨酸、赖氨酸异构体以及翻译后修饰赖氨酸中的一种或多种，并且所述基质包含氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)。在多个实施方案中，所述一种或多种目的含胺化合物包含精氨酸、精氨酸异构体以及翻译后修饰精氨酸中的一种或多种，并且所述基质包含二羟基苯甲酸(DHB)。
在多个方面，提供了设计用于确定一种或多种样品中目的含胺化合物存在状况的方法。所述方法可以是例如用于帮助发现各种生物化学途径、用于药物发现或诊断测试的生物标志物验证测试(biomarkervalidation assay)。所述测试可以是例如疾病或病症的诊断、疾病或疾病的预测(prognostic)、或者二者皆有。
在多个方面，本教导提供了一种制品，其中本教导方法的功能作为计算机可读指令包含于计算机可读介质中，所述计算机可读介质例如但不限于软盘、硬盘、光盘、磁带、PROM、EPROM、CD-ROM或DVD-ROM。
根据以下说明以及附图，可更充分理解本教导的前述和其它方面、实施方案以及特征。在附图中，同样的附图标记通常指所有不同附图中同样的特征和结构元件。附图不必按比例绘制，而是重点放在举例说明本教导的原理上。



图1是分析一种或多种样品中一种或多种含胺化合物的方法的多种实施方案的示意图。
图2图示说明了同量异位标签的多种实施方案。
图3是使用多种样品类型的多种实施方案的示意图。
图4A和4B举例说明了利用iTRAQTM品牌试剂进行同量异位标记之步骤的多种实施方案。
图5是在合并样品中使用标准化合物的多种实施方案的示意图。
图6A图示说明了未标记的腐胺(putrescene)和利用iTRAQTM品牌试剂进行标记的腐胺的结构，图6B和6C描绘了在PDITM之前和之后同量异位标记的腐胺的质谱。
图7A图示说明了未标记的尸胺和利用iTRAQTM品牌试剂进行标记的尸胺的结构，图7B和7C描绘了在PDITM之前和之后同量异位标记的尸胺的质谱。
图8A图示说明了未标记的1，7-二氨基庚烷和利用iTRAQTM品牌试剂进行标记的1，7-二氨基庚烷的结构，图8B和8C描绘了在PDITM之前和之后同量异位标记的1，7-二氨基庚烷的质谱。
图9A图示说明了未标记的亚精胺和利用iTRAQTM品牌试剂进行标记的亚精胺的结构，图9B、9C和9D描绘了在PDITM之前和之后同量异位标记的亚精胺的质谱。
图10A图示说明了未标记的精胺和利用iTRAQTM品牌试剂进行标记的精胺的结构，图10B、10C、10D描绘了在PDITM之前和之后同量异位标记的精胺的质谱。
图11图示说明了各自利用来自一组同量异位标签中的不同同量异位标签进行标记的多胺混合物的液相色谱。
图12A图示说明了利用iTRAQTM品牌试剂进行标记的腐胺的色谱图。图12B图示说明了利用iTRAQTM品牌试剂进行标记的尸胺的色谱图。图12C图示说明了利用iTRAQTM品牌试剂进行标记的1，7-二氨基庚烷的色谱图。
图13图示说明了各自利用来自一组同量异位标签中的不同同量异位标签进行标记的多胺混合物的液相色谱图。
图14A、14B、14C描绘了包含ACN和HCCA的基质的样品的正交MALDI(O-MALDI)背景质谱。
图15描绘了在ACN和HCCA基质中的实施例4的四种多胺的O-MALDI质谱。
图16A图示说明了未标记的腐胺和利用iTRAQTM品牌试剂进行标记的腐胺的结构，图16B描绘了在PDITM之后同量异位标记的腐胺的O-MALDI质谱。
图17A图示说明了未标记的尸胺和利用iTRAQTM品牌试剂进行标记的尸胺的结构，图17B描绘了在PDITM之后同量异位标记的尸胺的O-MALDI质谱。
图18A图示说明了未标记的1，7-二氨基庚烷和利用iTRAQTM品牌试剂进行标记的1，7-二氨基庚烷的结构，图18B描绘了在PDITM之后同量异位标记的1，7-二氨基庚烷的O-MALDI质谱。
图19A图示说明了未标记的亚精胺和利用iTRAQTM品牌试剂进行标记的亚精胺的结构，图19B描绘了在PDITM之后同量异位标记的亚精胺的O-MALDI质谱。
图20A图示说明了未标记的精胺和利用iTRAQTM品牌试剂进行标记的精胺的结构，图20B描绘了在PDITM之后同量异位标记的亚精胺的O-MALDI质谱。
图21A图示说明了未标记的精胺和利用iTRAQTM品牌试剂进行标记的精胺的结构，图21B和21C描绘了在PDITM之后的O-MALDI质谱。
图22A图示说明了未标记的精胺和利用iTRAQTM品牌试剂进行标记的精胺的结构，图22B描绘了在PDITM之后同量异位标记的亚精胺的O-MALDI质谱。
图23图示说明了被标记氨基酸的混合物的色谱图。
图24图示说明了实施例5的被标记氨基酸之混合物的样品的总离子电流(TIC)色谱图。
图25A-25U图示说明了实施例5中所测的多种氨基酸的PDITM图谱。
图26A-26B提供了实施例5所测氨基酸浓度与理论和其它多种测量体系相比较的数据。
图27A和27B提供了关于本教导的多种实施方案用于氨基酸浓度测定的动态范围和响应的数据。

具体实施例方式 在多个方面，本教导提供了利用同量异位标记物(isobaric label)和母离子-子离子跃迁监测(PDITM)来分析一种或多种样品中的一种或多种含胺化合物的方法。在多个实施方案中，本教导提供了测定一种或多种含胺化合物的浓度的方法。例如，参照图1，在多个实施方案中，方法包括利用来自一组同量异位标签中的不同同量异位标签分别标记一种或多种含胺化合物的步骤(步骤110)，来自所述同量异位标签组中的每种同量异位标签都包含报告物离子部分；合并每种所述同量异位标记的含胺化合物的至少一部分以产生合并样品(步骤120)并对所述合并样品的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测(其中所传输母离子的m/z范围包括所述同量异位标记的含胺化合物的m/z值，所传输子离子的m/z范围包括与所述同量异位标记的含胺化合物中的同量异位标签相对应的报告物离子的m/z值)以及测量一种或多种所传输报告物离子的离子信号(步骤130)；然后至少基于所测定的相应报告物离子的离子信号与标准化合物的一种或多种所测离子信号的比较来测量一种或多种所述同量异位标记的含胺化合物的浓度(步骤140)。所述离子信号例如可以基于离子峰的强度(平均值、中值(mean)、最大值等)、离子峰的面积或者其组合。
在多个实施方案中，可在包含第一质量分离器、离子裂解器和第二质量分离器的质量分析器系统上进行PDITM。选择PDITM扫描的所传输母离子的m/z范围(通过所述第一质量分离器进行选择)以包括一种或多种所述同量异位标记的含胺化合物的m/z值，选择PDITM扫描的所传输子离子的m/z范围(通过所述第二质量分离器进行选择)以包括与所传输的含胺化合物相对应的一种或多种报告物离子的m/z值。
在多个实施方案中，利用选自一组同量异位标签中的一个或多个同量异位标签来标记所述一种或多种含胺样品，使得例如在一次实验测量中(i)来自不同样品(例如对照样品、处理样品)的多种含胺化合物可以进行比较；(ii)可以对来自同一样品的同一含胺化合物进行多重浓度测量；(iii)可以对照正常组织评价癌组织的不同分离物；(iv)可对照未污染的食物或饮料评价抗生素污染的食物或饮料；(v)可将不同食物或饮料样品间的风味趋势进行比较；(vi)可监测发酵的进程；等等。
再次参照图1，在多个实施方案中，所述对所述合并样品的至少一部分进行PDITM的步骤包括将所述合并样品直接引入质量分析器系统(流程路径121和步骤130)中，例如通过利用电喷雾电离(ESI)离子源直接将合并样品引入到合适的溶液中，将所述合并样品与合适的基质混合并利用合适的基质辅助激光解吸/电离(MALDI)离子源引入所述样品。
再次参照图1，在多个实施方案中，所述对所述合并样品的至少一部分进行PDITM的步骤包括将所述合并样品的所述部分加载到色谱柱(例如LC柱、气相色谱(GC)柱或其组合)上(流程路径122和步骤125)、对所述色谱柱洗脱物的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测以及测量一种或多种所传输报告物离子的离子信号(流程途径123和步骤130)。
在多个实施方案中，在利用所述合并样品测量报告物离子信号之前净化(clear up)所述合并样品(例如通过高效液相色谱法(HPLC)、反相(RP)-HPLC、交换分级(exchange fractionation)、阳离子交换、高分辨阳离子交换(high resolution cation exchange)等、以及它们的组合去除干扰样品、缓冲液假阳性物(buffer artifact)等)。
在多个实施方案中，通过将所述相应含胺化合物-报告物离子跃迁的所测离子信号(所述含胺化合物-报告物离子跃迁信号)与以下的一种或多种进行比较而测定含胺化合物的浓度 (i)针对标准化合物-报告物离子跃迁的浓度曲线；以及 (ii)针对在与所述含胺化合物合并的样品中标准化合物的标准化合物-报告物离子跃迁信号。
再次参照图1，可以以多种方式提供在所述测定一种或多种所述同量异位标记的含胺化合物的浓度之步骤(步骤140)中使用的标准化合物的一种或多种所测离子信号。在多种实施方案中，利用来自所述同量异位标签组中的同量异位标签标记一种或多种标准化合物，并且将所述一种或多种同量异位标记的标准化合物中一种或多种的至少一部分与每种所述同量异位标记的含胺化合物的至少一部分相合并以产生合并样品(步骤150)；然后对此合并样品的至少一部分进行PDITM并测量一种或多种所传输报告物离子的离子信号(步骤130)。
然后可以将与所述合并样品中所述一种或多种同量异位标记的标准化合物的一种或多种相对应的一种或多种报告物离子的所测离子信号用于测定一种或多种所述同量异位标记的含胺化合物的浓度。因此，在多个实施方案中，测定同量异位标记的含胺化合物的浓度至少是基于所述相应报告物离子与合并样品中和所述一种或多种同量异位标记的标准化合物中的一种或多种相对应的一种或多种报告物离子的所测离子信号进行比较(步骤140)。所述对此合并样品的至少一部分进行PDITM的步骤可包括例如直接引入到质量分析器系统中(流程路径152和步骤130)；首先将此合并样品的至少一部分加载到色谱柱上(流程路径153和步骤125)，然后对色谱柱洗脱物的至少一部分进行PDITM并测量一种或多种所传输报告物离子的离子信号(流程路径123和步骤130)；或者它们的组合。
在多个实施方案中，测定一种或多种所述同量异位标记的含胺化合物的浓度(步骤140)至少是基于所述相应报告物离子的所测离子信号与和一种或多种标准化合物的一个或多个浓度曲线相对应的一种或多种报告物离子的所测离子信号进行比较。在多个实施方案中，提供具有第一浓度(步骤160)并用来自一组同量异位标签中的同量异位标签标记(步骤170)的标准化合物。对所述同量异位标记的标准化合物的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测(其中所传输母离子的m/z范围包括所述同量异位标记的标准化合物的m/z值，所传输子离子的m/z范围包括与所述同量异位标记的标准化合物的同量异位标签相对应的报告物离子的m/z值)并测量所述报告物离子的离子信号(步骤180)。针对不同于所述第一浓度的至少一个或多个标准化合物浓度重复所述标记步骤(步骤170)和PDITM以及测量所传输报告物离子的离子信号的步骤(步骤180)，以产生标准化合物的浓度曲线(步骤190)。
所述对同量异位标记的标准化合物的至少一部分进行PDITM的步骤可包括例如直接引入质量分析器系统中(流程途径171和步骤180)(例如通过利用ESI离子源将所述合并样品引入到合适的溶液中，将所述合并样品与合适的基质相混合并用合适MALDI离子源引入所述样品)；首先将此合并样品的至少一部分加载到色谱柱上(流程路径172和步骤175)，然后对色谱柱洗脱物的至少一部分进行PDITM并测量一种或多种所传输报告物离子的离子信号(流程路径173和步骤180)；或者它们的组合。
在多个实施方案中，针对标准化合物的PDITM可在包括第一质量分离器、离子裂解器和第二质量分离器的质量分析器系统上进行。选择PDITM扫描的所传输母离子m/z范围(通过所述第一质量分离器进行选择)以包含一种或多种所述同量异位标记的标准化合物的m/z值，选择PDITM扫描的所传输子离子m/z范围(通过所述第二质量分离器进行选择)以包含与所传输标准化合物相对应的报告物离子中一种或多种的m/z值。
在多个实施方案中，浓度曲线的产生可利用包括在所述标准化合物的至少一部分之中的一种或多种内标物，以便例如简化浓度测定、解释注射体积的差别等。
在多个实施方案中，可如下产生浓度曲线利用PDITM测量与相应标准化合物相关的报告物离子的离子信号并通过所测浓度的线性外推产生浓度曲线，使得零浓度对应于零报告物离子信号。在多个实施方案中，可如下产生浓度曲线利用PDITM测量与在两个或更多个已知浓度下的相应标准化合物相关的报告物离子的离子信号并通过对所测报告物离子信号进行函数拟合而产生浓度曲线。合适的拟合函数可取决于例如检测器的响应(例如检测器饱和、非线性等)。在多个实施方案中，所述拟合函数是线性函数。
在多个实施方案中，至少基于以下两者来测定一种或多种所述同量异位标记的含胺化合物的浓度(步骤140)(i)相应报告物离子的所测离子信号与和一种或多种标准化合物中一个或多个浓度曲线相对应的一种或多种报告物离子的所测离子信号的比较，以及(ii)相应报告物离子的所测离子信号与和一种或多种同量异位标记的标准化合物(其与同量异位标记的含胺化合物合并)相对应的一种或多种报告物离子的所测离子信号的比较。在多个实施方案中，提供具有第一浓度(步骤160)并用来自所述同量异位标签组中的同量异位标签(用于标记一种或多种含胺化合物(例如步骤120))标记(步骤170)的标准化合物。将同量异位标记的标准化合物的一部分与每种同量异位标记的含胺化合物的至少一部分合并以产生合并样品(流程途径176和步骤150)，然后可如本文中所述进一步分析此合并样品。在多个实施方案中，还将与用来产生合并样品相同的同量异位标记的标准化合物的一部分用于产生如本文中所述的浓度曲线。
用于测量报告物离子信号的同一标准化合物部分或其它部分可用来测定质量分析器的母离子-子离子跃迁监测条件。例如，在所述质量分析器系统包含液相色谱(LC)组件的情况下，所述标准化合物可用来测定色谱保留时间。在多个实施方案中，所述标准化合物可用来测定在不同条件下含胺化合物在离子源中的电离效率以及在离子裂解器中的断裂效率。
含胺化合物 可将本教导的方法用于多种多样的含伯胺和含仲胺的化合物，这些化合物包括但不限于氨基酸、儿茶酚胺、硝基呋喃代谢物、多胺、肽、蛋白质、多肽及其组合。
在多个实施方案中，目的含胺化合物包含氨基酸。氨基酸的实例包括但不限于亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸及其异构体，以及它们的翻译后修饰氨基酸。例如，在多个实施方案中，含胺化合物包括氨基酸衍生物，例如甲状腺素。甲状腺素是酪氨酸的衍生物并包括可用来监测疾病的一类重要化合物。甲状腺素的实例包括但不限于甲状腺素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)和“反T3”。

在多个实施方案中，目标含胺化合物包含一种或多种儿茶酚胺。儿茶酚胺的实例包括但不限于肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺及其组合。在多个实施方案中，目标含胺化合物包含多胺。多胺的实例包括但不限于精胺、N-乙酰基精胺、亚精胺、N-乙酰基亚精胺、腐胺(1，4-二氨基丁烷)、2-羟基腐胺、尸胺(1，5-二氨基戊烷)、1，6-二氨基己烷、1，7-二氨基庚烷、1，10-二氨基癸烷及其组合。在多个实施方案中，目标含胺化合物包含蛋白质或多肽。蛋白质或多肽的实例包括但不限于细胞色素P450同工型(isoforms)、血管紧张素、以及乳清蛋白和乳蛋白如β-乳球蛋白。细胞色素P450同工型的实例包括但不限于Cyp1a2、Cyp1b1、Cyp2a4、Cyp2a12、Cyp2b10、Cyp2c29、Cyp2c37、Cyp2c39、Cyp2c40、Cyp2d9、Cyp2d22、Cyp2d26、Cyp2j5、Cyp2e1、Cyp3a11、Cyp4a10、Cyp4a14及其组合。在多个实施方案中，目标含胺化合物包含硝基呋喃代谢物。硝基呋喃代谢物的实例包括但不限于3-氨基-2-噁唑烷酮(AOZ)、5-吗啉基甲基-3-氨基-噁唑烷酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、1-氨基乙内酰脲(AHD)及其组合。

可用于本发明多个实施方案中的所述含胺化合物可具有多种来源类型，例如生理流体样品、细胞或组织裂解物样品、合成肽样品、多肽样品、蛋白质样品、细胞培养物样品、发酵液培养基样品、农产品样品、动物产品样品、动物饲料样品、供人消费的食物或饮料样品、以及它们的组合。所述样品可以来自不同的来源、状况或者二者皆有；例如，对照样品与实验样品、来自不同时间点的样品(例如以形成序列)、疾病样品与正常样品、实验样品与疾病样品、污染样品与未污染样品等。生理流体的实例包括但不限于血液、血清、血浆、汗液、泪液、尿、腹膜液、淋巴、阴道分泌物、精液、脊髓液、腹水、唾液、痰、乳房渗出物、以及它们的组合。供人消费的食物或饮料样品的实例包括但不限于酒、蜂蜜、酱油、家禽、猪肉、牛肉、鱼、贝类、以及它们的组合。在多个实施方案中，目的含胺化合物是氨基酸，氨基酸的来源包括例如可被水解、消化而产生氨基酸的蛋白质。在多个实施方案中，目的含胺化合物是合成肽。
标准化合物 多种多样的化合物可以用作标准化合物。在多个实施方案中，标准化合物包含目标含胺化合物中的一种。在多个实施方案中，所述标准化合物来自一种或多种对照样品、已知浓度的样品或其组合。在多个实施方案中，针对分析中的每种目标含胺化合物提供标准化合物。
在多个实施方案中，可利用PDITM测量与在两个或更多个已知浓度下的所述标准化合物相关的报告物离子的离子信号，以产生标准化合物的浓度曲线。
同量异位标签 在多个实施方案中，同量异位标签可由通式(I)表示 R-L-ARG(I)， 其中R表示与胺反应活性基团(ARG)通过可断裂连接物(linker)基团(L)共价连接的报告物基团(R)，所述连接物基团包括平衡基团，其具有使得R+L的质量基本上与同量异位标签组中每个同量异位标签相同的质量。例如，在多个实施方案中，所述连接物基团L可由通式(II)表示 X-B-Y(II)， 其中X表示所述平衡基团与所述报告物基团之间的键，其中所述键X在所述被标记分析物与中性气体(例如通过碰撞诱导解离(collisioninduced dissociation))碰撞时断裂，Y代表当所述分析物反应活性基团已与分析物反应以标记该分析物时所述平衡基团与所述分析物之间的键，并且其中B表示平衡基团。可通过使分析物与式(I)试剂、其盐和/或其水合物反应而标记分析物。
胺反应活性基团 胺反应活性基团的实例包括但不限于与胺官能团选择性反应以与所述含胺化合物在特定位点上形成共价键或非共价键的那些基团。所述胺反应活性基团可预先存在，或者其可在原位制备。可在不存在分析物或存在分析物的情况下进行所述胺反应活性基团的原位制备。例如，可利用水溶性的碳二亚胺(例如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；EDC)在原位修饰羧酸基团，从而制备可与亲核物(nucleophile)(如烷基或芳基胺基)反应的亲电基团。在多个实施方案中，利用EDC活化所述标记试剂的羧酸基团可在含胺(亲核性)分析物的存在下进行。在多个实施方案中，也可在与EDC的初始反应进行之后添加所述含胺(亲核性)分析物。在多个实施方案中，可通过原位除去保护基团而原位产生所述反应活性基团。因此，可以预见到通过亲核和/或亲电反应而实现分析物衍生化的任何现有或新产生的试剂。
在多个实施方案中，合适的胺反应活性基团包括活性酯。活性酯在肽合成中是众所周知的，指在肽合成通常使用的条件下可容易地与氨基酸的N-α胺反应的某些酯。胺反应活性活性酯可以是例如N-羟基琥珀酰亚胺基酯(NHS)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基酯、五氟苯基酯(Pfp)、2-硝基苯基酯、4-硝基苯基酯、2，4-二硝基苯基酯或2，4-二卤代苯基酯。在多个实施方案中，所述胺反应活性基团可以是混合酸酐，因为混合酸酐可有效地与胺基反应从而形成酰胺键。
报告物基团 用于本教导的多个实施方案中的所述同量异位标签可以是具有可被测定的独特质量(或质量电荷比)的基团。例如，组中的每个报告物可具有独特的粗略质量(gross mass)。不同的报告物可包含一个或多个重原子同位素，以实现其独特质量。例如，存在碳(12C、13C和14C)、氮(14N和15N)、氧(16O和18O)或氢(氢、氘和氚)的同位素并且可用于制备多种多样的报告物部分的组。稳定的重原子同位素的实例包括但不限于13C、15N、18O和氘。
独特的报告物部分可以与目的样品相关联，从而用所述报告物标记该样品中的一种或多种分析物。这样，例如可将有关报告物的信息与有关样品中一种或全部分析物的信息相关联。然而，在测定所述报告物时，并不必将报告物与分析物进行物理性连接。相反，报告物的独特粗略质量可例如在被标记分析物的离子被断裂从而产生子片段离子和可检测报告物之后在串联质量分析器的第二质量分析中测定。所测定的报告物可用于鉴定所测定分析物所来源的样品。此外，所述独特报告物相对于其它报告物或相对于校准标准品的量(例如用具体报告物标记的分析物)可用于测定样品中分析物的相对量和/或绝对量(经常表达为浓度和/或量)。因此，可将信息(例如特定样品中一种或多种分析物的量)与用于标记每种特定样品的报告物部分相关联。在还测定所述分析物的身份的情况下，可将该信息与和不同报告物相关的信息相关联，从而协助一种或多种样品中每种被标记分析物的身份和量的测定。
报告物可以包含固定的电荷，或者能够被离子化。由于报告物可以包含固定电荷或者可被离子化，因此所述标记试剂可以是分离的或者用于标记盐(或盐的混合物)或两性离子形式的反应活性分析物。报告物的离子化有利于在质谱仪中对其进行测定。因此报告物可以作为离子(有时称为特征离子)进行测定。当被离子化时，报告物可包含一个或多个正或负的净电荷。因此，报告物可包含一个或多个酸性基团或碱性基团，因为这些基团很容易在质谱仪中被离子化。例如，报告物可以包含一个或多个碱性氮原子(正电荷)或者一个或多个可离子化的酸性基团比如羧酸基、磺酸基、或磷酸基(负电荷)。包含碱性氮的报告物的非限制性实例包括取代或未取代的吗啉、哌啶或哌嗪。
所述报告物可以是5元、6元或7元杂环，其包含用取代或未取代的乙酸结构部分进行了N-烷基化的环氮原子，所述分析物通过所述N-烷基化乙酸结构部分的羰基碳与所述乙酸结构部分相连，其中每种不同的标记物包含一个或多个重原子同位素。所述杂环可以是取代或未取代的。所述杂环可以是脂肪族的或芳香性的。所述杂环结构部分的可能取代基包括烷基、烷氧基和芳基。所述取代基可包含适于将分析物与载体(support)连接的保护或未保护的基团，例如胺、羟基或巯基。所述杂环还可包含额外的杂原子，例如一个或多个氮、氧或硫原子。
可对报告物进行选择，以使其在对分析物进行分析的典型条件下基本上不发生亚断裂(sub-fragment)。可对报告物进行选择，以使其在质谱仪中在施加解离能以引起被标记分析物的至少一部分所选离子的X键和Y键均断裂的条件下基本上不发生亚断裂。我们用“基本上不发生亚断裂”来表示当对目的分析物进行成功分析时，难于或不可能检测到高于背景噪声的报告物片段。可有意选择报告物的粗略质量，使其不同于意图测定的分析物或该分析物的任何预计片段的质量。例如，当分析物为蛋白质或肽时，可选择报告物的粗略质量使其不同于任何天然存在的氨基酸或肽或其预计片段。这可有利于分析物测定，因为取决于分析物，样品中不存在具有相同一致质量(coincident mass)的任何可能成分能够增加分析结果的置信度。
连接物基团 根据是否已发生与分析物的反应，用于本教导多个实施方案的标记试剂的连接物将报告物与分析物相连接或者将报告物与分析物反应活性基团(ARG)相连接。可选择连接物以在X键和Y键都断裂时产生中性物质(例如当X键和Y键都断裂时经受中性丢失(neutral loss))。所述连接物可以是非常小的结构部分，比如羰基或硫代羰基基团。所述连接物可以是较大的结构部分。所述连接物可以是聚合物或生物聚合物。可以将所述连接物设计成当经受解离能水平时发生亚断裂；包括亚断裂从而仅产生连接物的中性片段。
所述连接物基团可包含一个或多个重原子同位素，使得其质量补偿混合物的每种被标记分析物或所述同量异位试剂组的报告物之间的粗略质量差异。此外，报告物/连接物组合的总粗略质量(aggregate grossmass)(即作为总体的粗略质量)对于混合物中每种被标记分析物来说都是基本上相同的，或者对于成组和/或成套的所述试剂来说都是基本上相同的。因为所述连接物可用作针对标记试剂中报告物的质量平衡物，使得所述报告物/连接物组合的总粗略质量与成组或成套的所有试剂都相同，所以所述连接物基团也意在包含平衡基团(B)。连接物的平衡基团(B)的原子数目越大，组和/或试剂盒中不同的同分异构/同量异位标记试剂的可能数目就越大。
X键和Y键 X是报告物的原子和连接物的原子之间的键。Y是连接物的原子与胺反应活性基团的原子之间的键，或者是连接物的原子与分析物的原子之间的键(如果所述标记试剂已与分析物反应的话)。选择X键使得在被标记分析物(例如R-X-B-Y-分析物)的至少一部分选定离子中当经受足够的解离能水平时X键断裂。在多个实施方案中，还选择Y键使得在所述被标记分析物(例如R-X-B-Y-分析物)的至少一部分选定离子中当经受足够的解离能水平时Y键断裂。可在质谱仪中调节解离能水平，使得在被标记分析物的至少一部分选定离子中X键、Y键或者X键和Y键断裂。X键的断裂从分析物中释放出报告物，使得可独立于分析物来测定报告物。取决于X键是否已经断裂，Y键的断裂从分析物释放出报告物/连接物组合，或者从分析物释放出连接物。在多个实施方案中，Y键可比X键更不稳定，X键可比Y键更不稳定，或者X键和Y键具有基本相同的相对不稳定性。
当例如目的分析物是蛋白质或肽时，可根据酰胺(肽)键来调整X键和Y键的相对不稳定性。X键、Y键或其二者可以比典型酰胺(肽)键的不稳定性更高、相同或更低。例如，与Z-pro二聚体或Z-asp二聚体中的肽键相比，在解离能条件下，X键和/或Y键可更不易于断裂，其中Z是任何天然氨基酸，pro是脯氨酸，asp是天冬氨酸。在多个实施方案中，X键和Y键将在与典型酰胺键大致相同的解离能水平下断裂。
还可存在这样的X键和Y键，使得Y键的断裂引起X键的断裂，并且反之亦然。在多个实施方案中，X键和Y键可基本上同时断裂，使得在第二质量分析中没有显著量的分析物(或其子片段)包含部分标记。我们用“显著量的分析物”来表示在MS/MS谱中可检测到的小于约25％、优选小于约10％的部分标记的分析物。
参照图2A，举例说明了一种示例性的同量异位标签200。每种标签包含报告物基团212、胺反应活性基团214和平衡基团218(例如平衡所述报告物基团之间的质量差异)，使得每种标签的名义质量基本上相等。
在多个实施方案中，一组同量异位标签包含胺衍生化的含胺化合物，其在不存在断裂的情况下基本上不可通过色谱方法进行区分并且基本上不可通过质谱方法进行区分，但其在CID后产生强的低质量MS/MS信号离子。
在多个实施方案中，一组同量异位标签包含分别由通式(IIIa)-(IIId)所代表的标签Q114、Q115、Q116和Q117

适用于本教导的多个实施方案中的报告物基团、连接物基团、平衡基团、胺反应活性基团、同量异位标签以及同量异位标签组的其它实例可见于美国专利公开序号No.2004/0219686、2004/0220412、20050147982、2005/0147985、2005/0148087、2005/0148771、2005/0148773、2005/0148774和2005/0208550，所有这些文献的全部内容均通过引用并入本文。
合并样品 可将一种或多种被同量异位标记的标准化合物、一种或多种被同量异位标记的含胺化合物、或者其组合的任何合适的组合用在本教导的方法中。例如，合并样品中不同的被同量异位标记的化合物的数目N通常小于或等于同量异位标签组中同量异位标签的数目T。在任何一种合并样品中，被同量异位标记的标准化合物、一种或多种被同量异位标记的含胺化合物的可能组合可表示为 (S+C)≤T(1)， 其中T表示所述同量异位标签组中同量异位标签的数目；S表示用不同的同量异位标记物进行同量异位标记的标准化合物的数目，其范围为0到T(包括T本身)；C表示用不同的同量异位标记物进行同量异位标记的含胺化合物的数目，其范围为0至T(包含T本身)。
例如，在多个实施方案中，将一种或多种被同量异位标记的标准化合物(例如来自对照样品、来自已知浓度的样品等)与一种或多种被同量异位标记的目标含胺化合物合并，所述一种或多种被同量异位标记的标准化合物提供可用作例如内部浓度标准的一种或多种报告物离子信号。在多个实施方案中，加入被同量异位标记的标准化合物可用作合并样品中一种或多种目的含胺化合物的内标物。在多个实施方案中，针对合并样品(例如S＝C)中每种不同的目的含胺化合物添加不同的被同量异位标记的标准化合物，每种所述被同量异位标记的标准化合物例如用作不同的目的含胺化合物的内标物。
在多个实施方案中，合并样品中的两种或更多种待分析含胺化合物包含同样的目的含胺化合物。例如，含胺化合物#1到#X(其中X＞1)可包含同样的目的含胺化合物(但是例如来自不同样品)，其中不同的同量异位标签被用于来自不同样品的含胺化合物。例如，所述不同样品可来自同一体系(例如患者、位置等)的不同时间点并且可用来例如监测某些过程(例如疾病、发酵等)的进程。
在多个实施方案中，利用用于同一含胺化合物的不同的同量异位标签处理样品。例如，利用不同的同量异位标签一式三份地处理样品，其中不同的同量异位标签用于处理这三份中的每一份，然后将其合并，以提供至少部分地所述合并样品(其还可包含一种或多种标准化合物)；以提供例如在合并样品的单次实验分析中对所述含胺化合物浓度的三次测量。经常需要三重测量、更一般地多重测量来提供统计学上显著和/或准确的结果。例如，由于在传统技术中经常遇到的批次间偏差和背景干扰，利用传统方法的氨基酸分析结果通常基于对同一样品的三重分析。本教导的多个实施方案提供在单次实验运行中对含胺化合物浓度进行多重测量的能力可有助于降低由于这些批次间偏差而导致的不准确性。
在多个实施方案中，不向合并样品中加入被同量异位标记的标准化合物，例如在多个实施方案中，一种或多种目标含胺化合物的浓度可至少基于含胺化合物的相应报告物离子信号与标准化合物浓度曲线的比较来测定。
在多个实施方案中，在利用合并样品测量报告物离子信号之前对合并样品进行净化(例如以除去例如干扰样品、缓冲液假阳性物等；采用高效液相色谱(HPLC)、反相(RP)-HPLC、交换分级分离、阳离子交换、高分辨阳离子交换等，以及它们的组合等方法)。
质量分析器 多种质量分析器系统可用于本教导中以进行PDITM。合适的质量分析器系统包括带有离子裂解器的两个质量分离器，所述离子裂解器被布置在两个质量分离器之间的离子飞行路径中。合适的质量分离器的实例包括但不限于四极杆、RF多极杆、离子阱、飞行时间(TOF)、以及与定时离子选择器(timed ion selector)联合的TOF。合适的离子裂解器包括但不限于按以下原理运行的那些碰撞诱导解离(CID，也称为碰撞辅助解离(CAD))、光诱导解离(PID)、表面诱导解离(SID)、源后衰变、或者它们的组合。
用于质量分析器的合适质谱系统的实例包括但不限于含有以下一个或多个的那些系统三重四极杆、四极杆-线性离子阱(例如4000 Q

LC/MS/MS系统、Q

LC/MS/MS系统)、四极杆TOF(例如

LC/MS/MS系统)、以及TOF-TOF。
用于质谱系统的合适离子源包括但不限于电喷雾电离(ESI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、大气压化学电离(APCI)、大气压光电离(APPI)源。例如，ESI离子源可用作将来自LC柱的离子化样品引入到质量分离器设备中的手段。ESI的几个理想特性之一在于来自色谱柱的级分可直接从柱进入ESI离子源中。
在多个实施方案中，所述质量分析器系统包含MALDI离子源。在多个实施方案中，将所述合并样品的至少一部分与MALDI基质材料相混合并且利用带有MALDI电离源的质量分析器进行母离子-子离子跃迁监测。在多个实施方案中，将合并样品的至少一部分加载到色谱柱上，将洗脱物的至少一部分与MALDI基质材料相混合并利用带有MALDI电离源的质量分析器进行母离子-子离子跃迁监测。MALDI基质材料的实例包括但不限于表1中所列出的那些。
表1 在多个实施方案中，所述质谱仪系统包含用于选择母离子和检测其片段子离子的三重四极杆质谱仪。在多个实施方案中，第一个四极杆选择母离子。第二个四极杆被维持在足够高的压力和电压下，使得发生多次低能量碰撞引起一些母离子断裂。选择第三个四极杆以将所选的子离子传输到检测器。在多个实施方案中，三重四极杆质谱仪可包括布置在离子源和三重四极杆之间的离子阱。所述离子阱可被设置为收集离子(例如所有离子、具有特定m/z范围的离子等)并在填充时间(fill time)后，通过给末端电极施加脉冲而将所选的离子传输到第一个四极杆以允许所选的离子离开所述离子阱。可以例如基于离子数、离子阱内的电荷密度、不同特征肽((signature peptide)洗脱之间的时间、负载周期(dutycycle)、激发态物质或多电荷离子的衰变速率、或其组合来确定所期望的填充时间。
在多个实施方案中，三重四极杆质谱仪中的一个或多个四极杆可被配置为线性离子阱(例如通过加入末端电极以在所述四极杆内提供基本上长圆柱形的捕获体积)。在多个实施方案中，第一个四极杆选择母离子。第二个四极杆被维持在足够高的碰撞气压和电压下使得发生多次低能量碰撞而引起一些母离子断裂。选择第三个四极杆捕获片段离子并且经过填充时间后，通过给末端电极施加脉冲而将所选的离子传输到检测器以允许所选的离子离开离子阱。可例如基于离子数、离子阱内的电荷密度、不同特征肽洗脱之间的时间、负载周期、激发态物质或多电荷离子的衰变速率或其组合来确定所期望的填充时间。
在多个实施方案中，所述质谱仪系统包含两个四极杆质量分离器和TOF质谱仪用于选择母离子和检测其片段子离子。在多个实施方案中，第一个四极杆选择母离子。第二个四极杆被维持在足够高的压力和电压下使得发生多次低能量碰撞而引起一些母离子断裂，TOF质谱仪选择用于检测的子离子，例如通过监测含有目标子离子的质量范围内的离子以及所产生的提取离子色谱、通过使在所选子离子的时间窗之外出现的离子偏转离开检测器、以及通过对检测器设置时间门控为所选子离子的到达时间窗、或者通过它们的组合来进行选择。
在多个实施方案中，所述质谱仪系统包含两个TOF质量分析器和离子裂解器(例如CID或SID)。在多个实施方案中，第一个TOF选择母离子(例如通过使在所选母离子的时间窗之外出现的离子偏转离开裂解器)以将其引入到离子裂解器中，第二个TOF质谱仪选择用于检测的子离子，例如通过监测含有目标子离子的质量范围内的离子以及所产生的提取离子色谱、通过使在所选子离子的时间窗之外出现的离子偏转离开检测器、通过对所选子离子的到达时间窗的检测器设置时间门控或者通过它们的组合来进行选择。所述TOF分析器可以是线性分析器或反射分析器。
在多个实施方案中，所述质谱仪系统包含飞行时间质谱仪和离子反射器。所述离子反射器置于所述TOF的无场漂移区(field-free driftregion)的末端并用于通过改变离子飞行路径来补偿初始动能分布的作用。在多个实施方案中，离子反射器由一系列具有偏置电压的环组成，所述电压增加到比加速电压稍高的水平。在操作中，当离子进入反射器时其被减速直到其在电场方向上的速度变为零为止。在零速度点时，离子掉转方向并通过反射器被加速返回。离子离开反射器时的能量与它们进入时的能量相同，只是速度在方向上相反。具有较大能量的离子更深地进入反射器，并且随后将在反射器中停留较长时间。选择反射器中使用的电压以改变离子的飞行路径，使得同样质量和电荷的离子以基本上相同的时间到达检测器。
在多个实施方案中，所述质谱仪系统包含串联MS-MS仪器，其包含具有定时离子选择器的第一无场漂移区以选择目标母离子、裂解室(或离子裂解器)以产生子离子、以及质量分离器以传输所选的子离子用于检测。在多个实施方案中，所述定时离子选择器包含脉冲式离子偏转器。在多个实施方案中，所述离子偏转器可用作脉冲式离子偏转器。所述质量分离器可包括离子反射器。在多个实施方案中，所述裂解室是被设计成引起离子断裂和延迟引出的碰撞室。在多个实施方案中，所述裂解室还可用作延迟引出离子源，其用于通过飞行时间质谱分析所述片段离子。
在多个实施方案中，所述质谱仪系统包含串联TOF-MS，其具有沿由脉冲离子源产生的多数离子的路径放置的第一、第二和第三TOF质量分离器。放置所述第一质量分离器以接收由脉冲离子源产生的多数离子。所述第一质量分离器加速由脉冲离子源产生的多数离子，根据其质量电荷比分离多数离子，并基于其质量电荷比从所述多数离子中选择第一组离子。所述第一质量分离器还断裂所述第一组离子的至少一部分。放置所述第二质量分离器以接收所述第一组离子及其通过所述第一质量分离器产生的片段。所述第二质量分离器加速所述第一组离子及其片段，根据其质量电荷比分离所述第一组离子及其片段，并基于其质量电荷比从所述第一组离子及其片段中选择第二组离子。所述第二质量分离器还断裂所述第二组离子的至少一部分。所述第一和/或第二质量分离器还可包括离子导向器(ion guide)、离子聚焦元件和/或离子操纵元件(ion-steering element)。在多个实施方案中，所述第二TOF质量分离器使所述第一组离子及其片段减速。在多个实施方案中，所述第二TOF质量分离器包括无场区和离子选择器，所述离子选择器选择具有基本上在第二预定范围内的质量电荷比的离子。在多个实施方案中，所述第一和第二TOF质量分离器中的至少一种包括选择断裂后离子的定时离子选择器。在多个实施方案中，所述第一和第二质量分离器中的至少一种包括离子裂解器。放置所述第三质量分离器以接收所述第二组离子及其由所述第二质量分离器产生的片段。所述第三质量分离器加速所述第二组离子及其片段并根据其质量电荷比分离所述第二组离子及其片段。在多个实施方案中，所述第三质量分离器利用脉冲加速来加速所述第二组离子及其片段。在多个实施方案中，放置离子检测器以接收所述第二组离子及其片段。在多个实施方案中，将离子反射器放置在无场区中以在所述第一或第二组离子及其片段到达所述离子检测器之前校正其中至少一种的能量。
在多个实施方案中，所述质谱仪系统包含具有可在时间上同时进行的多飞行路径、多运行模式或者两者都包括的TOF质量分析器。此TOF质量分析器包括路径选择离子偏转器，其引导从一组样品离子中选出的离子沿第一离子路径、第二离子路径或第三离子路径进入所述质量分析器中。在一些实施方案中，甚至可使用更多的离子路径。在多个实施方案中，所述第二离子偏转器可用作路径选择离子偏转器。向所述路径选择离子偏转器施加时间依赖性电压以在可用的离子路径中选择并允许具有预定质量电荷比范围内的质量电荷比的离子沿所选的离子路径传播。
例如，在运行具有多飞行路径的TOF质量分析器的多个实施方案中，以与第一预定质量电荷比范围相对应的第一预定时间间隔向所述路径选择离子偏转器施加第一预定电压，从而导致在第一质量电荷比范围内的离子沿所述第一离子路径传播。在多个实施方案中，所述第一预定电压是零，使得离子继续沿原路径传播。以与第二预定质量电荷比范围相对应的第二预定时间范围向所述路径选择离子偏转器施加第二预定电压，从而导致在第二质量电荷比范围内的离子沿所述第二离子路径传播。还可以使用包括第三、第四等其它时间范围和电压来容纳与特定测量所需的离子路径一样多的离子路径。选择所述第一预定电压的振幅和极性以使离子偏转进入所述第一离子路径中，选择所述第二预定电压的振幅和极性以使离子偏转进入所述第二离子路径中。选择所述第一时间间隔使之与以下时间相对应在此期间内在所述第一预定质量电荷比范围内的离子沿所述路径选择离子偏转器传播；选择所述第二时间间隔使之与以下时间相对应在此期间内在所述第二预定质量电荷比范围内的离子沿所述路径选择离子偏转器传播。放置第一TOF质量分离器以接收沿所述第一离子路径传播的在所述第一质量电荷比范围内的所述离子组。所述第一TOF质量分离器根据质量分离所述第一质量电荷比范围内的离子。放置第一检测器以接收沿所述第一离子路径传播的第一组离子。放置第二TOF检测器以接收所述离子组沿所述第二离子路径传播的部分。所述第二TOF质量分离器根据质量分离所述第二质量电荷比范围内的离子。放置第二检测器以接收沿所述第二离子路径传播的第二组离子。在一些实施方案中，还可放置第三、第四等额外的质量分离器和检测器以接收沿相应路径定向的离子。在一个实施方案中，使用第三路径丢弃在所述第三预定质量范围内的离子。所述第一和第二质量分离器可以是任何类型的质量分离器。例如，所述第一和第二质量分离器中的至少一种可以包含无场漂移区、离子加速器、离子裂解器或定时离子选择器。所述第一和第二质量分离器还可包含多个质量分离装置。在一些实施方案中，包括离子反射器并将其放置为接收所述第一组离子，由此提高TOF质量分离器对所述第一组离子的分辨能力。在多个实施方案中，包括离子反射器并将其放置为接收所述第二组离子，由此提高TOF质量分离器对所述第二组离子的分辨能力。
在本教导的另一方面，可作为通用计算机上计算机可读指令来执行本文中所述方法的功能。所述计算机可以是与质谱系统分开的、可拆分的、或者可被整合进质谱系统。所述计算机可读指令可以以多种高级语言中的任一种来写，所述高级语言例如FORTRAN、PASCAL、C、C++或BASIC。此外，所述计算机可读指令可以以脚本(script)、宏(macro)或嵌入商业软件(如EXCEL或VISUAL BASIC)中的函数来写。另外，所述计算机可读指令可以以汇编语言来执行，所述汇编语言指向位于计算机上的微处理器。例如，如果配置所述汇编语言以在IBM PC或PC兼容机上运行，则可以以Intel 80x86汇编语言执行所述计算机可读指令。在一个实施方案中，所述计算机可读指令可以嵌入制造品中，所述制造品包括但不限于计算机可读程序介质，例如软盘、硬盘、光盘、磁带、PROM、EPROM、CD-ROM、DVD-ROM。
实施例 根据以下实施例可进一步理解本教导的各方面，所述实施例不是穷举性的并且也不应被视为以任何方式限制本教导的范围。
实施例1来自不同样品类型的化合物 以下实施例举例说明各种样品类型的应用。本实施例的教导并非穷举性的，并非旨在限制这些实验或本教导的范围。
举例说明了利用本教导的方法对来自各种样品类型的一种或多种含胺化合物进行分析的多个实施方案。在多个实施方案中，所述一种或多种目的含胺化合物可以源自一种或多种不同的样品类型，例如本实施例中的血浆、酒、蛋白质、肽和氨基酸。通常，可处理样品，使得样品中的目的化合物包含适于利用同量异位标签进行标记的一个或多个氨基，例如伯胺和仲胺。
参考图3，在多个实施方案中，对包含在血浆样品中的一种或多种含胺化合物进行标记的方案(方框305)包括沉淀所述目的含胺化合物中的一种或多种(步骤325)，然后离心并收集上清液的至少一部分(步骤340)。可利用很多方法沉淀出目的含胺化合物，所述方法包括但不限于7-10％的磺基水杨酸(SSA)溶液、乙醇、异丙醇及其组合。然后将所述上清液的至少一部分与来自一组同量异位标签(例如iTRAQTM品牌试剂)中的一种或多种同量异位标签组合(步骤350)以从所述血浆样品制备被同量异位标记的目的含胺化合物。
在多个实施方案中，对包含在酒样品中的一种或多种含胺化合物进行标记的方案(方框310)包括利用7-10％ SSA溶液沉淀所述目的含胺化合物中的一种或多种(步骤330)，然后离心并收集上清液的至少一部分(步骤345)。然后使所述上清液的至少一部分与来自一组同量异位标签(例如iTRAQTM品牌试剂)中的一种或多种同量异位标签相组合(步骤350)以从所述酒样品制备被同量异位标记的目的含胺化合物。
在多个实施方案中，对包含在蛋白质、肽或多肽样品中的一种或多种含胺化合物进行标记的方案(方框315)包括水解(例如用6摩尔每升(M)的盐酸(HCl))、消化(例如用胰蛋白酶)或水解并消化样品的至少一部分(步骤325)(例如以产生肽和/或氨基酸片段)并将所处理的样品与来自一组同量异位标签(例如iTRAQTM品牌试剂)中的一种或多种同量异位标签相组合(步骤350)以从蛋白质、肽或多肽样品制备被同量异位标记的目的含胺化合物。
在多个实施方案中，所述样品包含氨基酸或氨基酸混合物(方框320)，所述氨基酸混合物中的一种或多种氨基酸包含目的含胺化合物。在多个实施方案中，可将氨基酸样品与来自一组同量异位标签(例如iTRAQTM品牌试剂)中的一种或多种同量异位标签相组合(步骤350)以从氨基酸样品制备被同量异位标记的目的含胺化合物。在多个实施方案中，利用iTRAQTM品牌试剂，可制备所述被同量异位标记的目的含胺化合物，而基本上不改变一种或多种翻译后修饰。
实施例2样品制备和利用iTRAQTM品牌试剂的标记 以下实施例举例说明了制备并利用一种或多种同量异位标签(利用iTRAQTM品牌试剂)标记含一种或多种蛋白质或肽的一种或多种样品的多个实施方案的实施例。本实施例的教导不是穷举的，并且不意图限制这些实验或本教导的范围。
蛋白质或肽样品的还原以及半胱氨酸阻断 参照图4A，在多个实施方案中，向至少一个至至多4个样品管(每管含有5～100μg蛋白质)的每一管中加入20μL溶解缓冲液和1μL变性剂，然后涡旋混合(步骤405)。向每个样品管中加入2μL还原剂，然后涡旋混合并在60℃孵育1小时(步骤410)。离心每个样品管，然后向每个样品管中加入1μL半胱氨酸阻断剂，然后涡旋混合、离心并在室温下孵育10分钟(步骤415)。
利用胰蛋白酶消化蛋白质或肽样品 参考图4A，在多个实施方案中，在多个实施方案中，其中有至少一个但至多2个的样品管(每管含有5～100μg还原且半胱氨酸阻断的待标记蛋白质)，利用25μL

水或其等价物重构一管胰蛋白酶。在另一些实施方案中，例如，其中有至少一个但至多4个的样品管(每管含有5～100μg还原且半胱氨酸阻断的待标记蛋白质)，利用25μL

水或其等价物重构两管胰蛋白酶。通过涡旋和离心混合每管稀释后的蛋白酶(步骤420)。
向至少一个但至多4个的样品管(每管含有5～100μg还原且半胱氨酸阻断的待标记蛋白质)中的每一管中加入10μL胰蛋白酶溶液。通过涡旋混合每一样品管，然后离心并在37℃下孵育至少12小时但至多16小时。然后离心每一个样品管中的样品消化液(步骤425)。
蛋白质或肽样品的水解 在多个实施方案中，准备蛋白质或肽样品供水解分析。因此，在多个实施方案中，不使用还原步骤(例如步骤410)和消化步骤(例如步骤420)。参照图4B，在多个实施方案中，例如利用酸将含有蛋白质和/或肽的样品水解(步骤427)。在现有技术中有多种多样的技术可供用于水解适用于本教导的蛋白质和肽。例如可利用强酸水解(例如利用6N盐酸在100℃下于真空下处理)进行水解以产生游离氨基酸。应当理解，某些水解条件可以将某些酰胺(例如Asn、Gln)转变为它们的酸并使另一些氨基酸分解。因此，在多个实施方案中，可使用强酸水解以外的水解方法。
利用iTRAQTM品牌试剂标记氨基酸 参照图4A和4B，在多个实施方案中，将至少一管iTRAQTM品牌的同量异位试剂但至多4管的不同iTRAQTM品牌同量异位试剂温热至室温，并向每管iTRAQTM品牌同量异位试剂中加入70μL乙醇，然后涡旋混合并离心(步骤430)。每个氨基酸(例如来自消化的蛋白质、水解蛋白等)样品管使用一管iTRAQTM品牌的同量异位试剂。
向一个氨基酸样品管中加入一管含有在乙醇中的一种iTRAQTM品牌同量异位试剂的内容物，然后涡旋混合、离心并在室温下孵育1小时(步骤435)。在多个实施方案中，在用于测量报告物离子信号之前，将所述每种被标记氨基酸的至少一部分进行净化(步骤440)(例如以除去干扰样品、缓冲液假阳性物等；通过高效液相色谱法(HPLC)、反相(RP)-HPLC、交换分级分离、阳离子交换、高分辨阳离子交换等，以及它们的组合等方法)。将所净化的已标记氨基酸的至少一部分加载到色谱柱上(步骤445)(例如LC柱、气相色谱(GC)柱或其组合)。然后将所述色谱柱洗脱物的至少一部分导引至质谱仪系统中(步骤450)并测量一种或多种含胺化合物的含胺化合物-报告物离子跃迁信号。在多个实施方案中，未观察到含胺化合物-报告物离子跃迁信号(步骤455)。在多个实施方案中，在未观察到含胺化合物-报告物离子跃迁信号的情况下，对于被标记氨基酸的样品而言，重复所述标记氨基酸的步骤(步骤460)。
合并所述被iTRAQTM品牌的同量异位试剂标记的氨基酸用于分析 参照图4A和4B，在多个实施方案中，将每种被标记氨基酸样品管的全部内容物转移到一个新样品管中以提供合并样品，将所述合并样品涡旋混合，然后离心(步骤465)。在用于测量报告物离子信号(步骤475)之前，将所述每种被标记、已消化的蛋白质的至少一部分进行净化(步骤470)(例如以除去干扰样品、缓冲液假阳性物等；通过高效液相色谱法(HPLC)、反相(RP)-HPLC、交换分级分离、阳离子交换、高分辨阳离子交换等，以及它们的组合等方法)。将所净化、已标记氨基酸样品的至少一部分加载到色谱柱上(例如LC柱、气相色谱(GC)柱或其组合)。然后将所述色谱柱洗脱物的至少一部分导引至质谱仪系统中(步骤480)并利用PDITM(例如MRM)测量一种或多种含胺化合物的含胺化合物-报告物离子跃迁信号。然后测定合并样品中一种或多种目的含胺化合物的浓度(例如相对浓度、绝对浓度或二者皆有)(步骤485)。
实施例3与标准化合物合并 参照图5，在多个实施方案中，可通过提供一种或多种含胺化合物(包括但不限于肽、多肽、蛋白质、氨基酸、硝基呋喃代谢物、多胺和儿茶酚胺)来进行一种或多种样品中的一种或多种含胺化合物的浓度的测定。在多个实施方案中，将被同量异位标记的标准化合物(步骤505)(例如来自对照样品的目的含胺化合物、来自已知浓度样品的目的含胺化合物等)用作内标物，并例如与两种或多种被同量异位标记的待分析含胺试验化合物合并，所述待分析的含胺试验化合物例如试验化合物#1(步骤510)、试验化合物#2(步骤520)和试验化合物#3(步骤525)。
在多个实施方案中，所述待分析含胺化合物中的两种或更多种包含同样的目的含胺化合物。例如，试验化合物#1、试验化合物#2和试验化合物#3可包含同样的目的含胺化合物(例如赖氨酸)，但是这些试验化合物可来自三种不同的样品(例如时间点1、时间点2、时间点3等，以监测某些过程如疾病、发酵等的进程)、同一种样品(例如以在样品的一次实验运行中提供三重分析)、或者它们的组合。
测定一种或多种所述含胺化合物的浓度可通过利用来自一组同量异位标签(例如iTRAQTM品牌试剂)中的不同同量异位标签来标记标准化合物和每种含胺试验化合物来进行。例如，可利用所述同量异位标签组中的第一同量异位标签来标记标准化合物(步骤530)，利用所述同量异位标签组中的第二同量异位标签来标记试验化合物#1(步骤535)，利用所述同量异位标签组中的第三同量异位标签来标记试验化合物#2(步骤540)，利用所述同量异位标签组中的第四同量异位标签来标记试验化合物#3(步骤545)。
在多个实施方案中，将被同量异位标记的标准化合物的至少一部分以及被同量异位标记的试验化合物的一部分合并(步骤550)以产生合并样品，并对所述合并样品的至少一部分进行PDITM。
在多个实施方案中，加入被同量异位标记的标准化合物可用作所述合并样品中一种或多种目的含胺化合物的内标物。在多个实施方案中，针对合并样品中每种不同的目的含胺化合物加入不同的被同量异位标记的标准化合物，每种不同的同量异位标记的标准化合物例如用作不同目的含胺化合物的内标物。
实施例4含胺化合物浓度的多重测定 以下实施例举例说明了利用一组iTRAQTM品牌试剂中的同量异位标签对四种多胺的浓度进行了多重测定。本实施例的教导不是穷举性的，并非旨在限制这些实验或本教导的范围。
材料和方法 在本实施例的谱图中，利用API 2000三重四极杆LC/MS/MS系统获得图6B至10D的谱图，利用与配有HILC柱的HPLC系统偶联的API 2000三重四极杆仪器获得图11至13的谱图。所述色谱系统包含配有自动进样器、150x2.1mm C18反相柱和柱加热器的二元梯度HPLC系统。通过将含胺化合物溶于甲醇中然后利用标准标记方案使其与iTRAQ试剂反应而制备含胺化合物。标准胺得自Fluka。
谱图 实施例4举例说明了利用合并样品测定多种含胺化合物的浓度。图6A～10D描绘了各含胺化合物的质谱图，既有未标记的也有用一组同量异位标签中的同量异位标签标记的。在本实施例中，所述同量异位标签是iTRAQTM品牌试剂。图11和图13描绘了合并样品的色谱图。在本实施例中合并样品中的目的含胺化合物是1，4-二氨基丁烷(腐胺)、1，5-二氨基戊烷(尸胺)、N1-(3-氨基丙基)-丁烷-1，4-二胺(亚精胺)和1，7-二氨基庚烷。图12A～12C分别描绘了1，4-二氨基丁烷(腐胺)、1，5-二氨基戊烷(尸胺)和1，7-二氨基庚烷的色谱图。
参照图6A～6C，获得了未标记的(602)以及利用同量异位标签在伯胺处标记(604)的腐胺的质谱。在本实施例中，利用一组iTRAQTM品牌试剂同量异位标签中的114同量异位标签Q114来标记腐胺的伯胺。图6B描绘了利用所述iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的标签Q114标记的腐胺的ESI-TOF质谱。所观察到的主峰635对应于被标记的腐胺(m/z约377)，虽然还观察到了与被标记腐胺-钠加合物相对应的次要峰640(m/z约399)、对应于溶剂中所存在低质量杂质的次要峰630(m/z约375)、610(m/z约245)以及一簇峰615、620、625(在m/z约319至321之间)。
图6C描绘了被标记腐胺进行CID的ESI TOF-TOF质谱。所观察到的主峰650对应于114同量异位标签的报告物离子，虽然还观察到了与被标记腐胺相对应的峰670(m/z约377)以及与腐胺结构特异性片段相对应的峰660(m/z约233)。
参照图7A～7C，获得了未标记的(702)以及用同量异位标签在伯胺处标记的(704)尸胺的质谱。在本实施例中，利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的115同量异位标签Q115来标记尸胺的伯胺。图7B描绘了利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的同量异位标签Q115标记的尸胺的ESI-TOF质谱。所观察到的峰730对应于被标记的尸胺(m/z约391)，虽然还观察到了与溶剂背景相对应的峰710(m/z约102)和725(m/z约248)、以及与iTRAQTM反应副产物相对应的峰715(m/z约163)和720(m/z约191)。
图7C描绘了被标记尸胺进行CID的ESI TOF-TOF质谱。所观察到的主峰740对应于115同量异位标签的报告物离子，虽然还观察到了与被标记尸胺相对应的峰760(m/z约391)以及与尸胺结构特异性片段相对应的峰750(m/z约247)。
参照图8A～8C，获得了未标记802以及用同量异位标签在伯胺处标记804的1，7-二氨基庚烷的质谱。在本实施例中，利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的116同量异位标签Q116来标记1，7-二氨基庚烷的伯胺。图8B描绘了利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的同量异位标签Q116标记的1，2-二氨基庚烷的ESI-TOF质谱。所观察到的峰825对应于被标记的1，7-二氨基庚烷(m/z约419)，虽然还观察到了与溶剂背景相对应的峰810(m/z约102)、以及与iTRAQTM反应副产物相对应的峰815(m/z约163)和820(m/z约191)。
图8C描绘了被标记1，7-二氨基庚烷进行CID的ESI TOF-TOF质谱。所观察到的主峰830对应于116同量异位标签的报告物离子，虽然还观察到了与被标记1，7-二氨基庚烷相对应的峰850(m/z约419)以及与结构特异性片段相对应的峰840(m/z约275)。
参照图9A～9D，获得了未标记的亚精胺902以及用同量异位标签在伯胺处标记的亚精胺904的质谱。在本实施例中，利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的114同量异位标签Q114来标记亚精胺的伯胺。图9B描绘了利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的同量异位标签Q114标记的亚精胺的ESI-TOF质谱。所观察到的峰925对应于被标记的亚精胺(m/z约434)，虽然还观察到了与iTRAQTM反应副产物相对应的峰908(m/z约163)、916(m/z约217)、918(m/z约245)、930(m/z约458)以及与部分标记的仲胺相对应的峰935(m/z约578)。
图9C描绘了被标记亚精胺进行CID的ESI TOF-TOF质谱。所观察到的主峰945对应于114同量异位标签的报告物离子，虽然还观察到了与被标记亚精胺相对应的峰980(m/z约434)，与结构特异性片段相对应的峰940(m/z约97)、955(m/z约202)和970(m/z约290)，与iTRAQTM标签相对应的峰950(m/z约145)以及与溶剂结构片段相对应的峰960(m/z约216)。
图9D描绘了被标记亚精胺进行CID的ESI TOF-TOF质谱。所观察到的峰985对应于114同量异位标签的报告物离子，虽然还观察到了与被标记亚精胺相对应的峰995(m/z约434)以及与被标记仲胺相对应的峰990(m/z约578)。
参照图10A～10D，获得了未标记的精胺1002以及用同量异位标签在伯胺处标记的精胺1004的质谱。在本实施例中，利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的117同量异位标签Q117来标记精胺的伯胺。图10B描绘了利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的同量异位标签Q117标记的精胺的ESI-TOF质谱。所观察到的峰1035对应于被标记的精胺(m/z约491)，虽然还观察到了与溶剂背景相对应的峰1008(m/z约177)、1020(m/z约248)和1022(m/z约248)，与iTRAQTM反应副产物相对应的峰1010(m/z约185)和1012(m/z约191)，以及与利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的同量异位标签Q114标记的亚精胺相对应的峰1030(m/z约434)，与标准亚精胺中杂质相对应的峰1040(m/z约535)、1045(m/z约738)和1050(m/z约754)。
图10C描绘了被标记精胺进行CID的ESI TOF-TOF质谱。所观察到的峰1060对应于117同量异位标签的报告物离子，虽然还观察到了与被标记精胺相对应的峰1075(m/z约491)，与结构特异性片段相对应的峰1055(m/z约100)、1058(m/z约202)和1070(m/z约273)。
图10D描绘了被标记精胺进行CID的ESI TOF-TOF质谱。所观察到的峰1080对应于117同量异位标签的报告物离子，虽然还观察到了与被标记精胺相对应的峰1090(m/z约491)，与伯胺上带有标签的结构特异性片段相对应的峰1082(m/z约202)，与结构特异性片段相对应的峰1085(m/z约273)，以及与完整胺(所有胺均被标记)相对应的峰1095(m/z约635)。
图11描绘了合并样品的色谱图，描绘了在MRM模式下，在与配有HILC柱的HPLC系统偶联的API 2000三重四极杆仪器上分析的1，4-二氨基丁烷(腐胺)的色谱图1120、1，5-二氨基戊烷(尸胺)的色谱图1110以及1，7-二氨基庚烷的色谱图1105。
参照图12A～C，获得了在伯胺处利用同量异位标签标记的腐胺、尸胺和1，7-二氨基庚烷的色谱图。图12A描绘了由图11中所示LC/MS/MS运行中获得的利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的114同量异位标签Q114标记的腐胺的提取离子色谱图。所观察到的峰1205对应于被标记的腐胺(保留时间约8.9分钟)。图12B描绘了由图11中所示LC/MS/MS运行中获得的利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的115同量异位标签Q115标记的尸胺的提取离子色谱图。所观察到的峰1215对应于被标记的尸胺(保留时间约8.8分钟)。图12C描绘了由图11中所示LC/MS/MS运行中获得的利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的116同量异位标签Q116标记的1，7-二氨基庚烷的提取离子色谱图。所观察到的峰1225对应于被标记的1，7-二氨基庚烷(保留时间约8.4分钟)。
图13描绘了合并样品的色谱图，描绘了1，7-二氨基庚烷1305、尸胺1310和腐胺1320的色谱图。
参照图14A～C，获得了95％乙腈和基质氰基-4-羟基肉桂酸的背景O-MALDI质谱图。在同一质谱图中3个质量范围内可见的大多数离子均由溶剂的化学背景和4-羟基肉桂酸的基质离子所产生。
图15描绘了在95％乙腈(ACN)和氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)中的在伯胺处用同量异位标签标记的尸胺、腐胺和1，7-二氨基庚烷的混合物的O-MALDI-TOF质谱。所观察到的峰对应于被标记腐胺1512(m/z约379)、被标记尸胺1520(m/z约391)、被标记1，7-二氨基庚烷1525(m/z约419)和被标记亚精胺1530(m/z约434)，虽然也观察到了与标准物中化学杂质相对应的峰1502(m/z约359)、1504(m/z约361)、1508(m/z约377)和1515(m/z约380)。
参照图16A和16B，获得了未标记腐胺1602和用同量异位标签在伯胺处标记的腐胺1604的质谱图。在本实施例中，利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的114同量异位标签Q114来标记腐胺的伯胺。图16B描绘了对基质4-羟基肉桂酸中被标记腐胺进行CID的O-MALDI-TOF质谱图。所观察到的主峰1608对应于114同量异位标签的报告物离子，虽然还观察到了与被标记腐胺相对应的峰1640(m/z约377)，与完整标签相对应的峰1610(m/z约145)，与结构特异性片段相对应的峰1615(m/z约172)、1620(m/z约233)、1630(m/z约331)和1635(m/z约359)。
参照图17A和17B，获得了未标记尸胺1702和用同量异位标签在伯胺处标记的尸胺1704的质谱图。在本实施例中，利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的115同量异位标签Q115来标记尸胺的伯胺。图17B描绘了在基质4-羟基肉桂酸中将利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的同量异位标签Q115标记的尸胺的O-MALDI-TOF质谱图。所观察到的主峰1708对应于115同量异位标签的报告物离子，虽然还观察到了与被标记尸胺相对应的峰1730(m/z约391)，与完整标签相对应的峰1712(m/z约145)，与结构特异性片段相对应的峰1720(m/z约247)。
参照图18A和18B，获得了未标记1，7-二氨基庚烷1802和用同量异位标签在伯胺处标记的1，7-二氨基庚烷1804的质谱图。在本实施例中，利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的116同量异位标签Q116来标记尸胺的伯胺。图18B描绘了在基质4-羟基肉桂酸中将利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的同量异位标签Q116标记的1，7-二氨基庚烷胺的O-MALDI-TOF质谱图。所观察到的主峰1815对应于116同量异位标签的报告物离子，虽然还观察到了与被标记1，7-二氨基庚烷相对应的峰1845(m/z约419)、与iTRAQTM标签片段相对应的峰1810(m/z约101)、与结构特异性片段相对应的峰1825(m/z约275)和1835(m/z约381)。
参照图19A和19B，获得了未标记亚精胺1902和用同量异位标签在伯胺处标记的亚精胺1904的质谱图。在本实施例中，利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的114同量异位标签Q114来标记亚精胺的伯胺。图19B描绘了在基质4-羟基肉桂酸中将利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的同量异位标签Q114标记的亚精胺的O-MALDI-TOF质谱图。所观察到的主峰1908对应于114同量异位标签的报告物离子，虽然还观察到了与被标记亚精胺相对应的峰1965(m/z约434)，与完整的iTRAQTM标签相对应的峰1912(m/z约145)，以及与结构特异性片段相对应的峰1915(m/z约156)、1918(m/z约175)、1925(m/z约184)，1930(m/z约202)、1935(m/z约220)、1940(m/z约273)、1945(m/z约290)和1960(m/z约414)。
参照图20A和20B，获得了未标记精胺2002和用同量异位标签在伯胺处标记的精胺2004的质谱图。在本实施例中，利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的117同量异位标签Q117来标记精胺的伯胺。图20B描绘了在95％乙腈和CHCA中将利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的同量异位标签Q117标记的精胺的O-MALDI-TOF质谱图。所观察到的主峰2015对应于被标记精胺(m/z约491)，虽然还观察到了与结构特异性片段相对应的峰2008(m/z约379)和2030(m/z约535)。
参照图21A～C，获得了未标记精胺2102和用同量异位标签在伯胺处标记的精胺2104的质谱图。在本实施例中，利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的117同量异位标签Q117来标记精胺的伯胺。图21B描绘了在4-羟基肉桂酸基质中将利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的同量异位标签Q117标记的精胺的O-MALDI-TOF质谱图。所观察到的峰2110对应于117同量异位标签的报告物离子，虽然还观察到了与被标记精胺相对应的峰2140(m/z约491)以及与结构特异性片段相对应的峰2120(m/z约202)、2130(m/z约275)和2135(m/z约473)。
图21C描绘了在4-羟基肉桂酸基质中利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的同量异位标签Q117标记的精胺的O-MALDI-TOF质谱图。所观察到的峰2150对应于117同量异位标签的报告物离子，虽然还观察到了与被标记精胺相对应的峰2180(m/z约491)以及与结构特异性片段相对应的峰2160(m/z约202)和2170(m/z约275)。
参照图22A和22B，获得了未标记精胺2202和用同量异位标签在伯胺处标记的精胺2204的质谱图。在本实施例中，利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的117同量异位标签Q117来标记精胺的伯胺。图22B描绘了在4-羟基肉桂酸基质中将利用iTRAQTM品牌试剂同量异位标签组中的同量异位标签Q117标记的精胺的O-MALDI-TOF质谱图。所观察到的主峰2210对应于117同量异位标签的报告物离子，虽然还观察到了与被标记精胺相对应的峰2250(m/z约491)，与结构特异性片段相对应的峰2220(m/z约202)、2230(m/z约271)和2235(m/z约273)，以及与选用于裂解的母离子相关的峰2260(m/z约635)。
图23描绘了iTRAQTM 115标记的氨基酸标准品的MRM分析的色谱图，其包含在蛋白水解物中可见的不同氨基酸2310、2320、2330、2340、2350和2360。
实施例5牛血清蛋白(BSA)样品 以下实施例举例说明蛋白质样品中氨基酸浓度的测定，所述蛋白质样品进行水解而产生游离氨基酸。本实施例的教导不是穷举性的，也并非旨在限定这些实验或本教导的范围。
材料和方法 通过标准水解方法制备蛋白质或肽水解物。具体而言，利用6NHCl将含有1μg的牛血清样品在110℃水解17小时。然后将水解后的样品与缓冲液、异丙醇和iTRAQ品牌试剂混合并使之在室温下反应。然后将样品干燥并再溶解或直接稀释到所期望的供分析用浓度(通常每次分析需要0.2μg肽或蛋白质)。可在水解和/或标记之前将标准品(即正亮氨酸、正缬氨酸)加入到样品中以跟踪实验过程中样品的回收率。还在表2中以操作方案的格式提供了有关样品标记的细节。
对于多种样品而言(至多4种或者如果包括内标物在内则至多3种)，如上制备每一种样品并利用不同的iTRAQ试剂(114、115、116或117)标记。标记反应后将被标记样品与不同的试剂混合在一起。对于胺或氨基酸标准品混合物而言在分开的瓶中进行同样的过程，但标记试剂不同。可利用被标记标准品产生外部校正曲线。也可将被标记标准品与样品混合，提供每种胺或氨基酸的内标物(参见图1)。利用加热至50℃的C18柱(利用15％碳负载进行全末端封端)进行HPLC分离，流速为1ml/分钟，200μL/分钟分流进入检测器。梯度、清洗和平衡总共需要20分钟。
利用HPLC分离随后在以MRM模式运行的三重四极杆或QTRAP MS/MS系统上进行ESI MRM分析而进行氨基酸浓度的定量。对于MRM分析而言，MRM跃迁由氨基酸的被标记质量和针对MS/MS中所用特定试剂而产生的报告物离子片段组成，例如对117试剂来说，利用220.1＞117.1的跃迁监测甘氨酸。在本方法中输入了对所有需监测氨基酸而言的MRM跃迁。跃迁之一通常是针对样品中所添加的内标物。每种氨基酸的内标物校正了检测响应和色谱分离方面的任何偏差。利用AnalystTM软件和专门设计以支持氨基酸分析的工具进行定量。
表2 有关用于产生本实施例数据的样品处理和LC/MS/MS设定的进一步详情如下。在加载到LC柱上之前，利用25μL 3％甲酸(含有6皮摩尔/μL用iTRAQ试剂114标记的氨基酸标准品)。然后用制造商推荐的方法将5μL的体积注入Applied Biosystems/MDS Sciex API 2000LC/MS/MS仪器中。有关仪器操作条件的详情显示在表3～11中。表3和表4提供了与所述仪器的LC部分相关的条件，表5～11提供了与所述仪器的MS/MS部分相关的条件。
表3 LC条件
表4 LC梯度 在本实施例中，在MS/MS数据采集中使用了多个时段(时段1-3)，使得并非所有的跃迁都在运行期间被连续扫描。仅该时段内的跃迁才在该时段中被扫描。这能使每个峰有更多的数据点，导致了更好的定量。
表5 表6 时段1所传输质量的参数表 表7 时段1参数 表8 时段2所传输质量的参数表 表9 时段2参数 表10 时段3所传输质量的参数表 表10 表11 时段3参数 谱图和结果 在本实施例中，测定了20种氨基酸的浓度。表12归纳了针对每种氨基酸(列于第2列中)所得到的数据。第3列列出了氨基酸在LC柱上的保留时间，第4列列出了与未知浓度的样品中氨基酸相关的峰面积，第5列列出了与氨基酸标准样品相关的峰面积，第6列列出了标准样品中氨基酸的浓度，第7列列出了利用本教导在本实施例中所测的氨基酸的浓度。未知样品中氨基酸的浓度是通过以下方法测定的与所述未知样品中氨基酸相关的峰面积除以与标准样品相关的峰面积，并将此比值乘以已知样品的浓度。
实例图谱显示在图24和25A-25U中。
图24描绘了iTRAQTM 114标记的氨基酸标准品和117标记的样品的MRM分析的色谱图。与图24中所示不同保留时间相对应的氨基酸列于表12中。图25A-25U示意性地描绘了所测多种氨基酸的MRM数据。图25A-25U中每一幅图的右侧都描绘了内标物(IS)114标记的氨基酸的离子信号，左侧都描绘了117标记的样品的离子信号。所得出面积的峰被涂了阴影。应当指出，对于Cya而言，没有检测到样品信号，因此在图25A的左图中没有出现涂阴影的峰。
图26A-B将所测氨基酸浓度与在Beckman上柱前和柱后衍生的标准氨基酸分析方法/仪器设置进行了比较。结果表明这些方法的一致性很好。
图26A和26B将代表性蛋白质水解物样品与理论值和BeckmanGold系统的结果进行了比较。图26A比较了每种氨基酸的理论摩尔百分数(最左边的条柱，针对给定氨基酸)与在Beckman Gold系统上测定的摩尔百分数(中间条柱，针对给定氨基酸)、以及在本实施例中利用LC/MS/MS测定的摩尔百分数(最右边的条柱，针对给定氨基酸)。图26B比较了在Beckman Gold系统上运行的蛋白质水解物样品(左边条柱，针对给定氨基酸)以及在本实施例中利用LC/MS/MS测定(右边条柱，针对给定氨基酸)的测量值与理论值的偏差。本实施例(LC/MS/MS系统)中酪氨酸值较低，是因为未用羟胺对样品进行处理(羟胺可从酪氨酸中除去不想要的第二iTRAQ试剂标签)。
表12 实施例6生物流体样品 以下实施例举例说明了生物样品中游离氨基酸浓度的测定。虽然本实施例的数据是基于血浆样品，但可将本实施例的教导用于其它生物流体，包括但不限于尿。本实施例的教导不是穷举性的，并非旨在限定这些实验或本教导的范围。在本实施例中，监测了血浆样品中的48种游离氨基酸。所监测的氨基酸列于表13中。
表13 监测血浆中的一种或多种游离氨基酸具有几种实际用途，包括例如新生儿疾病的检测和/或监测、生物标志的检测等。例如，新生儿中的某些游离氨基酸可以是新生儿代谢性疾病的指征，所述疾病例如甲基丙二酸血症和丙酸血症。还在表14中列出了与某些常见氨基酸代谢病相关的氨基酸升高的实例。
表14 虽然这些代谢性病症是少见的遗传病类型，但它们可以对受影响的婴儿造成严重的后果。如果不加治疗，这些病症可引起不可逆的智力发育迟缓(从轻度到重度)、身体残疾、神经损伤甚至死亡。对于实现快速有利的治疗而言，早期检测(出生后不久)和准确诊断非常重要。
材料和方法 对于生物流体(例如血浆、血清、尿)而言，将1份样品与4份异丙醇或乙醇混合以沉淀样品中大部分蛋白质。向上清液中加入缓冲液以保持标记反应的碱性pH。然后加入iTRAQ品牌试剂并使之在室温下反应。然后使样品干燥并再溶解或直接稀释到所期望的供分析浓度(通常每次分析需要100nL生物流体)。还在表15中以操作方案的形式提供了关于样品标记的细节。
表15 有关用于产生本实施例数据的样品处理和LC/MS/MS设置的更多细节如下。在加载到LC柱上之前，利用40μL 3％甲酸(含有用iTRAQ试剂117标记的10皮摩尔/μL的氨基酸标准品)重构每种样品。然后利用制造商推荐的方法，将2μL的体积注入到Applied Biosystems/MDSSciex API 3200 LC/MS/MS仪器中。有关仪器操作条件的细节列于表16-26中。表16和17提供了与仪器的LC部分有关的条件，表18-26提供了与仪器的MS/MS部分有关的条件。
表16 LC条件

表17 LC梯度 在本实施例中，在MS/MS数据采集中使用了多个时段(时段1-4)，使得并非所有的跃迁都在运行期间被连续扫描。仅那些在该时段内的跃迁才在该阶段中被扫描。这使得每个峰可获得更多数据点，从而导致更好的定量。
表18 表19 时段1所传输质量的参数表 表20 时段1参数 表21 时段2所传输质量的参数表 表22 时段2参数 表23 时段3所传输质量的参数表 表24 时段3参数 表25 时段4所传输质量的参数表 表26 时段4参数 谱图和结果 在本实施例中，监测了48种氨基酸。表27归纳了针对每种所检测氨基酸所获得的数据。第二列列出了内标物中氨基酸的量，第三列中列出了添加外标物(external standard spike)的量，第四列中列出了样品中所测氨基酸的水平，第五列中列出了血浆对照范围。
表27 外标物 血浆对照 氨基酸 μM IS μM 样品(μM)范围μM VAL 62.1 52.3 59.0 49-69 TYR 22.3 18.7 17.0 13-22 TRP 21.0 0.0 THR 48.5 41.5 42.0 38-48 TAU 19.5 9.1 14.0 SER 31.9 30.7 26.0 23-30 SAR 0.70.6 PSER 0.00.1 PRO 118.9 98.4 44.0 34-52 PHE 19.3 18.1 15.0 12-25 PETN 0.50.6 ORN 33.3 17.8 27.0 MET 7.77.0 6.0 4-7 LYS 262.7 56.0 46.0 39-52 LEU 46.0 35.7 30.0 26-35 ILE 21.3 19.6 14.0 13-18 HYP 2.52.7 1.8 HYL 0.80.6 HIS 22.8 18.9 16.0 0-22 GLY 83.3 70.6 67.0 59-74 GLU 25.3 23.8 20.0 17-25 GLN 150.3 254.8 155.0 GABA 0.60.6 ETN 6.66.3 CYSTA0.50.4 CIT 9.07.1 5.0 CAR 1.21.0 BALA 11.7 15.4 BAIBA1.91.7 ASP 1.92.2 2.4 2-4 ASN 24.2 0.0 13.0 ARG 24.0 12.4 14.0 11-17 ANS 0.80.6 ALA 137.3 136.8 115.098-130 AANB 4.44.0 3.0 AAD 0.50.4 3-MHS2.42.4 1.0 1-MHS1.81.4 3.0 (HCY)2 0.70.7 (CYS)2 13.5 6.2 实施例7儿茶酚胺 本实施例讨论了iTRAQ标记的儿茶酚胺(CAT)的色谱分离。CAT常常是尿、血浆和CSF(脑脊液)样品的临床分析中所感兴趣的。进行血浆和尿的常规临床分析例如以诊断肿瘤(神经母细胞瘤、pheacytochroma等)及其龄期和位置。CAT还常常是神经递质并在CSF中被监测，例如在制药工业中在降压药(hypretension drug)的药物开发中。
儿茶酚胺及相关化合物是重要的心血管和代谢效应器。测定这些化合物在各种生物流体中的浓度具有临床和药物开发研究上的意义。目前，标准分析方法易于受到各种化学和色谱干扰。在本发明中，我们提供了一种使用iTRAQ化学用于在单次分析中高灵敏度定量儿茶酚胺、其相关化合物和氨基酸的方法，所述iTRAQ化学为一组四种胺反应活性的、同量异位的多重标记试剂。利用LC-MS/MS以MRM(多重反应监测)模式分析并定量衍生物，这提供了极高的灵敏度和特异性。
在本实施例中，监测了CAT组胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、间甲肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺。此外，还监测了氨基酸glu和tyr。
材料和方法 制备了儿茶酚胺、其相关化合物和几种氨基酸的标准混合物并采用标准方案利用iTRAQ试剂将其标记。在1mL/分钟的流速下，在C18反相柱上利用含有挥发性离子对试剂的水-乙腈梯度分离衍生物。注入所述衍生化标准品的一系列稀释液以测定LOD(检测限)以及各成分的标准曲线。根据公开方案，加入和不加入标准品，制备生物流体样品(尿、CSF、血浆)、将其标记和分析以测定基质对方法的灵敏度和准确度的影响。利用Applied Biosystems/MDS SCIEX API-4000三重四极杆质谱在ESI+、MRM模式下分析样品。
结果 结果证明了标记和定量以下儿茶酚胺、相关化合物和氨基酸的可行性多巴(3，4-二羟基-DL-苯丙氨酸)、多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、间甲肾上腺素、去甲变肾上腺素、甲基多巴、3-甲氧基酪胺、5-羟色胺、组胺、ABA(氨基丁酸)、酪氨酸和谷氨酸。提交摘要时的LOD为0.004皮摩尔/uL。各种样品的线性度范围为R＝0.9000至0.9998。满足了准确性和精密度。针对以下儿茶酚胺异构体实现了基线分离多巴(342/117)和间甲肾上腺素(342/117)、以及肾上腺素(328/117)和去甲变肾上腺素(328/117)。
实施例8动态范围 图27A和27B显示了有关本教导各实施方案中氨基酸浓度测定的动态范围和响应的数据。图27A显示了有关正缬氨酸的浓度响应的数据(从约10至约990皮摩尔(pmole))。每次实验(数据点)使用30皮摩尔的内标物，并重复注射三次。增加注入LC/MS/MS系统的氨基酸的量，并根据其响应作图。图27A表明，响应在约3个数量级的浓度范围内是线性的。
图27B显示了有关亮氨酸的浓度响应的数据(从约10至约990皮摩尔)。每次实验(数据点)使用30皮摩尔的内标物，并重复注射三次。增加注入LC/MS/MS系统的氨基酸的量，并根据其响应作图。图29B表明，响应在约3个数量级的浓度范围内是线性的。
实施例9生理流体中甲状腺素和结构相关甲状腺激素的多重绝对和相对定量 以下实施例举例说明了利用iTRAQ品牌试剂组中的同量异位标签进行的甲状腺素定量的方法。在本实施例的方法中，甲状腺素可由通式IV表示
其中R1各自独立地为碘或氢；以及 R2是羧基、羟基或甲基。
甲状腺素化合物可以是甲状腺激素，其在血液中的水平例如可以用作疾病诊断和预后的指征。例如，以下三种甲状腺素化合物(式(IVa)-(IVc))常用于监测疾病状态
本实施例举例说明了利用本教导的各种实施方案分析样品中甲状腺素的方法。例如，可提供的所述分析方法包括但不限于 1.利用外标校正曲线进行样品中甲状腺素的绝对定量。例如，可利用iTRAQ品牌试剂组中的114、115或116同量异位标签分别标记甲状腺素，并利用iTRAQ品牌试剂组中的117同量异位标签标记的氨基酸标准品产生外部定标。
2.利用如上面(1)中所述的外标曲线和内标物进行样品中甲状腺素的绝对定量，所述内标物由利用iTRAQ品牌试剂组中的117同量异位标签标记的甲状腺素以及向所述待分析样品中直接加入的被标记标准品组成。
3.利用外标曲线进行两种不同样品中甲状腺素的绝对定量。每种甲状腺素样品例如可以分别被iTRAQ品牌试剂组中的114、115或116同量异位标签所标记。可利用由iTRAQ品牌试剂组中的117同量异位标签标记的甲状腺素标准品产生所述外标曲线。这两种样品例如可以相同并进行一式两份处理或者是不同的样品。
4.利用外标曲线和内标物进行两种不同样品中甲状腺素的绝对定量。甲状腺素标准品可以用iTRAQ品牌试剂组中的117同量异位标签进行标记并作为内标物添加到样品中。所述两种样品例如可以相同并进行一式两份处理或者是不同的样品。
5.利用外部标定进行三种样品中甲状腺素的绝对定量。可利用iTRAQ品牌试剂组中的114、115或116同量异位标签分别标记每种甲状腺素样品，并利用iTRAQ品牌试剂组中的117同量异位标签标记甲状腺素标准品。这三种样品例如可以相同并一式三份进行处理，这三种样品中的两种可以相同并且一式两份进行处理，这三种样品还可以是两种或更多种不同的样品、或是以上的组合。
6.利用外部标定和内标物进行三种样品中甲状腺素的绝对定量。可利用iTRAQ品牌试剂组中的117同量异位标签标记甲状腺素标准品并将其直接加入至样品中。这三种样品例如可以相同并一式三份进行处理，这三种样品中的两种可以相同并且一式两份进行处理，这三种样品还可以是两种或更多种不同的样品、或其组合。
7.利用外标曲线进行四种样品中甲状腺素的绝对定量。可利用iTRAQ品牌试剂组中的114、115、116或117同量异位标签分别标记每种甲状腺素样品。这四种样品例如可以相同并一式四份进行处理，这四种样品中的三种可以相同并且一式三份进行处理，这三种样品中的两种可以相同并且一式两份进行处理，这四种样品还可以是两种或更多种不同的样品、或其组合。
8.利用iTRAQ品牌试剂组中的114、115、116或117同量异位标签标记的至多四种样品中甲状腺素的相对定量。这四种样品例如可以相同并一式四份进行处理，这四种样品中的三种可以相同并且一式三份进行处理，这三种样品中的两种可以相同并且一式两份进行处理，这四种样品还可以是两种或更多种不同的样品、或其组合。
材料和方法 可使用以下材料测定生理流体中甲状腺素(IVa)的绝对定量甲状腺素标准品、iTRAQ品牌试剂组中的1～4种同量异位标签、配有自动进样器和柱加热器的二元HPLC系统、150 x 2.1mm C18反相柱、基于三重四极杆或Q Trap技术的LC/MS/MS系统。
将甲状腺素标准品样品溶解在碱性缓冲液(0.5M碳酸氢三乙基铵或硼酸钠，pH 8.5)中，向其中加入溶解在乙醇中的iTRAQ品牌试剂组中的同量异位标签中的一种(例如117同量异位标签)。将目的样品加入到所述碱性缓冲液中并向样品中加入iTRAQ品牌试剂组中的不同的同量异位标签(例如114、115或116同量异位标签)。根据样品中总胺含量使用过量约3～5倍的iTRAQ品牌试剂。使两种样品均在室温下与各自的iTRAQ试剂反应30分钟，然后稀释到合适的溶剂(例如0.1％甲酸+10mM甲磺酸或10mM磺酸氢钠)中并进行PDITM(例如MRM分析)。
可提供样品的绝对定量，例如通过利用外标物产生校正曲线，例如使用117同量异位标签标记过的标准品，用117同量异位标签标记过的标准样品加入到目的样品中以产生内标物，或者二者同时使用。
LC-MRM分析 如本文中所述，可使用各种各样的仪器。例如，在多个实施方案中，实验装备包括二元HPLC泵、自动进样器、柱加热器和C18柱。在200ul/ml的流速下于梯度条件下操作HPLC以实现甲状腺素及其衍生物的基线分离。使HPLC与MRM模式下的三重四极杆或线性离子阱质谱仪连接，以提供样品中甲状腺素的PDTIM和定量。
本申请中所引用的全部文献和类似材料(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、文集和网页)，不论这些文献和类似材料的格式如何，均明确通过引用全文并入本文中。在所并入的文献和类似材料中的一篇或多篇与本申请(包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等)不同或矛盾的情况下，以本申请为准。
本文中使用的各部分标题仅出于语言组织的目的，而不应看作是以任何方式限制本申请的主题。
虽然已结合多个实施方案和实施例对本教导进行了描述，但并不意味着将本教导限制在这些实施方案或实施例中。相反，本领域技术人员会理解，本教导包含了各种替代方案、修改和等同方案。
虽然已参考具体的示例性实施方案对本教导进行了具体展示和描述，但应当理解，可做出形式和细节上的各种变化而不背离本教导的精神和范围。例如，根据本发明的多个实施方案，可将任何所公开步骤与任何其它所公开步骤组合而提供一种分析含胺化合物的方法。因此，要求保护在本教导范围和精神内的所有实施方案及其等同方案。除非具体指出，本教导的方法、系统和测试的描述和图表不应视为是对所述要素次序的限定。
权利要求
1.一种用于分析一种或多种样品中的一种或多种甲状腺素化合物的方法，其中所述甲状腺素化合物可由通式(IV)表示
其中每个R1独立地为碘或氢；并且
R2是羧基、羟基或甲基；
所述方法包括以下步骤
提供包含甲状腺素的标准化合物；
利用一组同量异位标签中的同量异位标签标记所述标准化合物；
利用所述同量异位标签组中的不同同量异位标签各自标记一种或多种甲状腺素化合物；
合并所述被同量异位标记的标准化合物的至少一部分与每种所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的至少一部分以产生合并样品；
将所述合并样品的至少一部分加载到色谱柱上；
对所述色谱柱洗脱物的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测，其中，
第一所传输母离子的m/z范围包括一种或多种所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的m/z值，第一所传输子离子的m/z范围包括与所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的至少一种同量异位标签相对应的至少一种报告物离子的m/z值；以及
第二所传输母离子的m/z范围包括一种或被同量异位标记的标准化合物的m/z值，第二所传输子离子的m/z范围包括与所述被同量异位标记的标准化合物的同量异位标签相对应的报告物离子的m/z值；
测量一种或多种所述所传输报告物离子的离子信号；以及
至少基于所述相应的报告物离子的所测离子信号与和所述被同量异位标记的标准化合物相对应的报告物离子的所测离子信号的比较，测定一种或多种所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的浓度。
2.权利要求1的方法，其中所述甲状腺素化合物中的一种或多种由通式(IVa)表示
3.权利要求1的方法，其中所述甲状腺素化合物中的一种或多种由通式(IVb)表示
4.权利要求1的方法，其中所述甲状腺素化合物中的一种或多种由通式(IVc)表示
5.权利要求1的方法，其中所述样品中的一种或多种包含生理流体。
6.权利要求1的方法，其中所述一种或多种甲状腺素化合物包含来自两种或更多种样品中的基本上相同的甲状腺素化合物。
7.权利要求1的方法，其中所述对所述色谱柱洗脱物的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测的步骤包括使用三重四极杆、四极杆/飞行时间质谱仪、线性离子阱质谱仪或串联飞行时间质谱仪中的一种或多种。
8.权利要求1的方法，其中所述对所述色谱柱洗脱物的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测的步骤包括在基质中混合所述合并样品并利用基质辅助激光解吸电离来产生用于所述母离子-子离子跃迁监测的离子。
9.权利要求1的方法，其中所述测定一种或多种所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的浓度之步骤包括测定一种或多种所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的绝对浓度。
10.一种用于分析一种或多种样品中的一种或多种甲状腺素化合物的方法，其中所述甲状腺素化合物可由通式(IV)表示
其中每个R1独立地为碘或氢；并且
R2是羧基、羟基或甲基；
所述方法包括以下步骤
利用一组同量异位标签中的不同同量异位标签各自标记一种或多种甲状腺素化合物；
合并每种所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的至少一部分以产生合并样品；
将所述合并样品的至少一部分加载到色谱柱上；
对所述色谱柱洗脱物的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测，其中，所传输母离子的m/z范围包括一种或多种所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的m/z值，所传输子离子的m/z范围包括与所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的同量异位标签中的至少一种相对应的至少一种报告物离子的m/z值；以及
测量一种或多种所述所传输报告物离子的离子信号；以及
至少基于所述相应的报告物离子的所测离子信号与标准化合物的浓度曲线的比较，测定一种或多种所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的浓度。
11.权利要求10的方法，其中所述标准化合物的浓度曲线通过以下步骤产生
(a)提供包含甲状腺素化合物并具有第一浓度的标准化合物；
(b)利用来自一组同量异位标签中的同量异位标签来标记所述标准化合物；
(c)将所述被同量异位标记的标准化合物的至少一部分加载到色谱柱上；
(d)对所述色谱柱洗脱物的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测，其中所传输母离子的m/z范围包括所述被同量异位标记的标准化合物的m/z值，所传输子离子的m/z范围包括与所述被同量异位标记的标准化合物的同量异位标签相对应的报告物离子的m/z值；
(e)测量所传输报告物离子的离子信号；
(f)针对一个或多个不同的标准化合物浓度，重复步骤(a)～(e)；以及
(g)至少基于在两个或更多个标准化合物浓度下所传输报告物离子的所测离子信号来产生所述标准化合物的浓度曲线。
12.权利要求10的方法，其中所述测定一种或多种所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的浓度之步骤包括测定一种或多种所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的绝对浓度。
13.权利要求10的方法，其中所述甲状腺素化合物中的一种或多种由通式(IVa)表示
14.权利要求10的方法，其中所述甲状腺素化合物中的一种或多种由通式(IVb)表示
15.权利要求10的方法，其中所述甲状腺素化合物中的一种或多种由通式(IVc)表示
16.一种用于分析一种或多种样品中的一种或多种甲状腺素化合物的方法，其中所述甲状腺素化合物可由通式(IV)表示
其中每个R1独立地为碘或氢；并且
R2是羧基、羟基或甲基；
所述方法包括以下步骤
利用一组同量异位标签中的不同同量异位标签各自标记一种或多种甲状腺素化合物；
合并每种所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的至少一部分以产生合并样品；
利用基质辅助激光解吸电离对所述合并样品的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测，其中，第一所传输母离子的m/z范围包括一种或多种所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的m/z值，第一所传输子离子的m/z范围包括与所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的同量异位标签中的至少一种相对应的至少一种报告物离子的m/z值；以及
测量一种或多种所述所传输报告物离子的离子信号；以及
至少基于所述相应报告物离子的所测离子信号与包含甲状腺素化合物的标准化合物的所测离子信号的比较，测定一种或多种所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的浓度。
17.权利要求16的方法，其中所述甲状腺素化合物中的一种或多种由通式(IVa)表示
18.权利要求16的方法，其中所述甲状腺素化合物中的一种或多种由通式(IVb)表示
19.权利要求16的方法，其中所述甲状腺素化合物中的一种或多种由通式(IVc)表示
全文摘要
本教导提供了利用同量异位标签和母离子-子离子跃迁监测(PDITM)来分析一种或多种样品中的一种或多种甲状腺素化合物的方法。在多种实施方案中，所述方法包括以下步骤(a)利用来自一组同量异位标签的不同同量异位标签来标记一种或多种甲状腺素化合物，每种同量异位标签包含报告物离子部分；(b)合并每种所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的至少一部分以产生合并样品；(c)使所述合并样品的至少一部分经受PDITM；(d)测量一种或多种所传输报告物离子的离子信号；以及(e)至少基于相应的报告物离子的所测离子信号与标准化合物的一个或多个所测离子信号的比较，测定一种或多种所述被同量异位标记的甲状腺素化合物的浓度。
文档编号G01N33/74GK101611321SQ200780037607
公开日2009年12月23日 申请日期2007年8月15日 优先权日2006年8月8日
发明者苏巴西什·普尔卡亚斯塔 申请人:阿普里拉股份有限公司