短串联重复基因座的多重扩增的利记博彩app

专利名称：：短串联重复基因座的多重扩增的利记博彩app短串联重复基因座的多重扩增本申请是申请日为1999年11月24日、申请号为99813729.4、发明名称为"短串联重复基因座的多重扩增"的发明专利申请的分案申请。相关申请的交叉参考本申请是美国专利申请系列号08/632,575(申请日1996年4月15日)、现美国专利5,843,660(授权日1998年12月1日)的部分继续申请，而08/632,575又是1994年9月30日申请的美国专利申请系列号08/316,544的部分继续申请。这些申请的全文引入本文作参考。联邦政府资助的研究或开发的声明无发明领域本发明涉及检测基因组系统中的遗传标记。本发明特别涉及用聚合酶链反应或其它扩增系统同时扩增多个不同的多种形态的遗传基因座，以在一个反应中测定包含于多重系统中每个基因座的等位基因。发明背景DNA分型通常用于亲子鉴定，并用于确定马、狗及其它动物农作物的谱系。DNA分型还通常用于鉴别血液、唾液、精液及在犯罪场所或需要鉴定人类遗迹的其它地方发现的其它组织。DNA分型还用于临床测定骨髓移植的成功或失败及特殊癌组织的存在与否。DNA分型涉及分析具有感兴趣的特征、通常称为"标记"的基因组DNA的等位基因。目前所用的分型法被特异设计为检测和分析已知在群体中以至少两种不同形式显现的DNA标记的一或多个区域的长度和/或序列中的差异。此种长度和/或序列变异称为"多态性"。其中发生这种变异的DNA的任何区域(即"基因座")称为"多态基因座"。本发明的方法和物质均设计为用于检测DNA的多个基因座，其中一些或全部是多态基因座。就长度或序列而言充分多态的遗传标记，很久以来被试图用于鉴定身份应用中，如亲权认定及鉴别收集的用于法医分析的组织样品。这种标记及分析该标记的方法的揭示与开发，在以往许多年已进行了几个阶段的开发。第一个鉴别的DNA变体标记是简单碱基取代，即简单序列多态性，其通常由Southern杂交分析检测。例如，描述设计用于用放射活性探针分析限制性内切酶消化的DNA的这种标记的鉴别的参考文献，参见Southern,E.M.(1975)，J.Mol.Biol.98(3):503—507;Schumm，etal(1988)，AmericanJournalofHumanGeneties42:143—159;及Wyman，A.andWhite，R.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:6754一6758。第二代标记是大小变体，即长度多态性，尤其"串联重复可变数"(VNTR)标记(NakamuraY.etal.(1987).Science235:1616—1622;及美国专利4,963,663，授予White等(1990);美国专利5,411,859，4，963，663的继续，授予White等(1995))和"小卫星"标记(Jeffreysetal.(1985a)，Nature314:67—73;Jeffreysetal，(1985b)Nature316:76—79;美国专利5，175，082，发明人Feffieys)。VNTR和小卫星标记均含有以串联方式重复的几个相同序列的区域。核心重复序列长度为10一70个碱基，较短的核心重复序列称为"小卫星"重复，较长重复称为YNTRs。人群中不同个体含有不同数量的这些重复。VNTR标记通常比碱基取代多态性具有更高的多态性，有时在单一遗传基因座上呈现接近40或更多个等位基因。但是，仍需要限制酶消化及随后的Southern杂交分析等繁琐方法检测及分析大多数这种标记。接下来的进展包括聚合酶链反应(PCR)(美国专利4,683,203，Mullis,K.B.)技术与分析VNTR基因座(Kasai，K.etal.(1990)JournalForensicScience35(5):1196—1200)的联合。可扩增的VNTR基因座被发现，其可不需Southern转移而被检测。扩增产物通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶分离，并通过在扩增期间掺入放射活性或通过用银或溴化乙锭后染色而检测。但PCR只能用于可靠扩增相对小的DNA区段，即仅可靠扩增长度在3000个碱基之下的DNA区段。(Ponce，M.&Micol，L,(1992)NAR20(3):623;DecorteR"etal.(1990)DNACellBiol,9(6):461—469)。结果，仅开发了非常少的可扩增VNTRs。近年来，作为遗传标记的多态短串联重复(STRs)的揭示和开发己激发连锁图谱开发，致病基因的鉴别与鉴定及DNA分型的简化性和精确性的进程。具体地，含有多态二核苷酸重复(Litt和Luty(1989)AmJ.HumGenet3(4):599605;Tautz,D.(1989)NAR17:6463—6471;Weber和May(1989)AmJHumGenet44:388—396;德国专利DE3834636C2,发明人Tautz,D;美国专利5，582，979,申请人Weber,L.)，具有3—4个核苷酸重复单位的STR(Edwards，A.等，(1991)Am.J.Hum-Genet,49:746—756;Hammond,H.A,等，(1994)Am.J.Hum.Genet.55:175-189;FregeauC.J.和Fourney，R.M.(1993)BioTechniques15(1):100_119;Schumm,J.W.等，(1994)，第四届人类鉴定国际研讨会，1993，PP.177—178;美国专利5,364,759，Caskey等；德国专利DE3834636C2,Tautz,D.)和具有5—7个核苷酸重复单位的STR(参见例如Edwards,A.等(1991)核酸研究19:4971;Chen等(1993)基因组15(3):621-5;Harada等，(1994)Am.J,Hum.Genet.55:175—189;Commings等(1995)基因组29(2):390-6;和Utah标记开发小组(1995)Am.J.Genet57:619-628;和Jurka和Pethiyagoda(1995)分子进化杂志40.*120-126)的多态标记的发现与开发，已克服了许多以前方法的缺陷。STR标记一般比VNTRs标记短，它们比在多数VNTR标记更适于扩增。STR基因座类似于可扩增的VNTR基因座，其中在每个这种基因座的扩增的等位基因基于长度变化而可有所不同。通常认为STR基因座在每个个体基因座的多态性比VNTR基因座低。因此，希望在单一扩增反应与分离中扩增及检测多个STR系统，以同时提供多个基因座的信息。含有多个基因座的系统称为多重系统，且已阐述了许多含有最多11个不同STR基因座的这种系统。例如参见美国法医学会学报(1998年2月9—14日)，Schumm，JamesW.等，p53，B88，文献同上；Gibson,SandraD，等，p53，B89，文献同上；Lazaruk，Katherine等，p51B83，文献同上；Sparkes.R等，IntJLegalMed(1996)109:186-194;AmpFlSTRProfilerPCR扩增试剂盒使用手册(1997)，由Perkin-ElmerCorp，i-viii和1-1至1—10公布；AmpFlSTRProfilerPCR扩增试剂盒使用手册(1997)，由Perkin-ElmerCorp.，i-viii和l一l至l一IO公布；AmpFlSTRCOfilerPCR扩增试剂盒使用手册(1998)，由Perkin-ElmerCorp，i-iii和1—1至1一10公布;第9次国际人类鉴定研讨会论文集(1998年10月7_10日)，由PromegaCorp公布，Staub，RickW等，PosterAbstract15;同上，Willard，JeanneM.等，PosterAbstract73;及同上，Walsh,P.Sean等，SpeakerAbstractfor8:50am-9:20am，1998年10月8日星期四。扩增STR基因座的方案可设计为产生小产物，一般长度为60—500碱基对(bp)，且每个基因座的等位基因间隔通常少于100bp。这使得可在相同凝胶上同时进行多个系统的电泳分析，或者通过精心设计PCR引物进行毛细管电泳分析，这样各个系统的所有潜在扩增产物不重叠其它系统等位基因的范围。这些系统的设计受到单一凝胶或毛细管分离多个基因座难度的部分限制。这是因为在本领域技术人员常用的分离DNA片段的装置即凝胶或毛细管中不同大小的片段特别是较长片段的空间压縮所致。美国联邦调査局(FBI)己建立并保存了一种组合式DNA指数系统("CODIS"),这是一个DNA分型信息的数据库。当地，州及国家司法机构使用CODIS，用数据库中的DNA信息可以比较在犯罪现场收集到的法医学DNA证据，其它国立数据库系统已经证明是这些机构用来解决暴力犯罪的一种有效工具(例如参见Nigzgoda，Stephen,CambridgeHealthtechInstitoute，sSecondAnnualConferenceonDNAForensics:Science,Evidence,andFutureProspects(Nov.17-18，1998)，pi-21;Niezgoda，Stephen,ProceedingFromTheEighthInternationalSymposiumorHumanIdentification1997，PromegaCorporation公布(1998)，p48-49;Frazier，RachelR.E,等，出处同上，p56-60;Niezgoda,S.J.ProfilesinDNA1(3):12-13;Werrett，D.J.andSparkes，R.SpeakerAbstracts:9thInternationalSymposiumonHumanIdentification(Oct.7-10，1998)p5國6)。直至最近，仅仅是得自特殊VNTR基因座分析的限制性片段长度多态性("RFLP")数据被认为是数据库中的核心成分。FBI最近已鉴别了CODIS数据库中包含的13个多态性STR基因座。此13个CODISSTR基因座是HUMCSF1P0，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317，D16S539，D18S51，D21S11，HUMFIBRA，HUMTHOl，HUMTPOX，禾口HUMvWFA31(Budowle，BruceandMoretti，Tamyra，SpeakerAbstracts:9也InternationalSymposiumonHumanIdentification(Oct.7-10，1998)p7-8)。VNTR和STR标记数据目前均保存在CODIS数据库中。(例如参见Niezgoda，Stephen，SencondAnnualConterenceonDNAForensics,出处同上)。直至本发明，可以在单一反应及其后的分析中共扩增的基因座数目仍是有限的。特别地，尚未开发出用于多重扩增13个或更多个STR基因座及用于鉴别CODIS数据库中13个多态性STR基因座的材料或方法。本发明的材料及方法设计用于多重分析各种类型DNA包括各种15不同来源的单链及双链的DNA的特定多态性基因座。本发明是对现有技术的明显改进，提高了DNA分布型用于连锁分析，犯罪司法审判，血缘测试及其它法医学，医学及遗传鉴别应用的辨别力，精确性及通量。发明概述本发明一个目的是提供在单一多重反应中同时扩增一系列基因座包括多个不同的多态性短串联重复(STR)基因座的方法及材料，其组合使用PCR或其它扩增系统与凝胶电泳，毛细管电泳或其它分离及检测方法，以分析及对比在该多重反应中扩增的每个基因座等位基因的相对长度。本发明揭示的多重分析一系列基因座的方法在现有技术中未阐述过。现有技术中也未关于有在下文所揭示的许多引物序列的阐述，所有这些引物在所揭示的一系列基因座的多重扩增中都表明是有用的。本发明另一目是提供特异于多重扩增的方法，试剂盒及引物。本发明的这些及其它目的由本发明同时分析或测定每个多重反应中每个基因座存在的等位基因的方法和物质而实现。一般地，本发明的方法包括如下步骤(a)获取至少一个待分析的DNA样品，其中此DNA样品有至少13个可被共扩增的基因座；(b)共扩增此DNA样品的至少13个基因座；及(c)以揭示所用系统的多态性的方式检测扩增的物质。在一个实施方案中，本发明提供了同时测定来自一或多个DNA样品的一系列基因座中存在的等位基因的方法，包括(a)获取至少一个待分析的DNA样品；(b)选择DNA样品的一系列基因座，其包括至少13个能共扩增的短串联重复基因座；(c)在一多重扩增反应中共扩增此一系列基因座，其中反应产物是从该系列每个共扩增基因座中扩增的等位基因的混合物；(d)评价混合物中扩增的等位基因，以确定DNA样品中该系列每个分析的基因座存在的等位基因。该至少13个短串联重复基因座中的至少4个优选选自以下一组基因座D3S1539，D4S2368，D5S818,D7S820,D9S930，D10S1239,D13S317，D14S118，D14S548，D14S562,D16S490,D16S539,D16S753，D17S1298，D17S1299，D19S253，D20S481，D22S683，HUMCSFIPO，HUMTPOX，HUMTHOl，HUMF13A01，HUMBFXIII，HUMLIPOL，HUMvWFA31。在本发明另一实施方案中，在所述方法步骤(b)中选择的一系列基因座包含13个CODISSTR基因座(即D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317，D16S539，D18S51，D21S11，HUMCSFIPO，HUMFIBRA，HUMTHOl，HUMTPOX和HUMvWFA31),它们用本发明的方法可通过自身或与其它基因座共扩增及分析。本发明另一方面提供了一种同时分析基因组DNA的一系列基因座的试剂盒，其包括共扩增待分析的基因组DNA的一系列基因座的寡核苷酸引物，其中此系列基因座包括至少13个能在相同多重反应中共扩增的短串联重复基因座，且其中引物位于一或多个容器中。更优选地，此试剂盒包括共扩增人基因组DNA的一系列至少13个基因座的寡核苷酸引物对，此系列基因座包括D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317，D16S539，D18S51，D21S11，HUMCSFIPO，HUMFIBRA，HUMTHOl，HUMTPOX，和HUMvWFA31。本发明另一方面提供了扩增人DNA特异基因座的引物序列和引物对。使用本发明的引物和引物对进行DNA多重分析见于下述。本发明的引物适用于本发明的方法，其中它们熊以标记的形式使用以助于此方法的评价步骤，如下所述。本发明方案节省了多重分析所含的基因座所花费的时间，财力和物力。本发明的方法可以在一个试管中用单一扩增反应共扩增13或更多个，甚至多如16个或更多个基因座，而不用在各个试管中独立扩增每个基因座或较少的基因座。本发明特别用于法医学分析，血缘测定，监测骨髓移植，连锁作图及检测遗传疾病和癌症等领域。本发明的方法明显提高精确性，从而人们可用其比较制备自相同个体不同样品的DNA。准确对比或辨别含有极少量DNA的样品在法医学应用方面尤为需要，在那里许多定罪证据(和无罪证据)取决于DNA分型分析。科学家尤其法医学家长期以来已意识到需要分析DNA的多个多态基因座以确定两个DNA样品间的匹配在统计学上是有意义的。(Presley,L.A.等，第三次人类鉴定国际研讨会论文集1992，p245-269(由PromegaCoip，1993年发表)；Bever，R.A.等，第二次人类鉴定国际研讨会论文集1991，pl03-128(由PromegaCorp,，1992年发表))。然而，直至本发明，人们还不能在一个反应中同时分析13或更多个STR基因座。为了解这种多重能力的重要性，有必要理解DNA分型分析的一些数学。举例说明，假定每个STR基因座有1/10几率的基因型(即两个等位基因的带型)。换而言之，假定两个随机选择的个体具有单一STR匹配型的机会是1/10。然而，如果分析两个不同的STR基因座，这二个系统的随机匹配的机会是1/100。如果分析3个STR基因座，这三个系统的每一个的随机匹配机会是1/1000，依次类推。所以，很易于了解所分析的STR基因座数目的增加将如何降低一般人群中随机匹配可能性，从而提高通过对比犯罪嫌疑犯的类型与犯罪现场证据，准确鉴别犯罪嫌疑犯在现场的机率。同样的原因，本发明的方法还能提高准确鉴别父亲身份，正确匹配骨髓组织，开发连锁作图研究的显著结果，及检测遗传性疾病和癌症的可能性。本发明的其它方面，特点及优点在以下进行本发明的优选实施方案及附图中将得以呈现。附图简述图1A是对人基因组DNA样品的基因座D3S1358，D5S818，D7S820,D8S1179，D13S317，D16S539，D18S51，D21S11,HUMCSF1PO，HUMFIBRA，HUMTHO1，HUMTPOX和HUMvWFA31的同时扩增产物进行三色荧光检测的结果图，其是在实施例1中用ABIPRISM310遗传分析仪检测的。图IB是对如图1A的方式加工的对照样品进行三色荧光检测的结果图，扩增反应中没有基因组DNA。图2A是对人基因组DNA样品的基因座D3S1358，D5S818，D7S820,D8S1179，D13S317，D16S539,D18S51，D21S11，HUMCSFIPO，HUMFIBRA，HUMTH01,HUMTPOX，HUMvWFA31，G475，S159，和Amelogenin的同时扩增产物进行三色荧光检测的结果图，其是在实施例2中用ABIPRISM310遗传分析仪检测的。图2B是对如图2A方式加工的对照样品进行三色荧光检测的结果图，在扩增反应中没有基因组DNA底物。图3A是对人基因组DNA样品的基因座D3S1358，D5S818，D7S820,D8S1179,D13S317，D16S539，D18S51，D21S11，HUMCSFIPO，HUMFIBRA,HUMTH01，HUMTPOX，HUMvWFA31，G475，S159和Amelogenin的同时扩增产物，进行三色荧光检测的结果图，其是在实施例3中用ABIPRISM⑧377DNA测序仪检测的。图3B是对如图3A方式加工的对照样品进行三色荧光检测的结果图，在扩增反应中没有基因组DNA底物。图4A和4B是基因座D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317，D16S539，D18S51，D21S11，HUMCSF1P0，HUMFIBRA,HUMTHOl，HUMTPOX,HUMvWFA31，G475,S159和Amelogenin的同时扩增产物的荧光检测结果的激光打印图，是用HitachiFMBIOII荧光扫描仪的荧光素通道(图4A)和羧基四甲基罗丹明通道(图4B)检测的，如实施例4所示。图5A和5B是基因座D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317，D16S539，D18S51，D21S11，HUMCSFIPO，HUMFIBRA，HUMTHOl，HUMTPOX，HUMvWFA31，G475，S159和Amelogenin的同时扩增产物的荧光检测结果的激光打印图，是用HitachiFMBIOII荧光扫描仪的荧光素通道(图5A)和羧基四甲基罗丹明通道(图5B)检测的，如实施例5所述。图6A和6B是基因座D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317，D16S539，D18S51,D21S11，HUMCSFIPO，HUMFIBRA，HUMTHIO，HUMTPOX，HUMVWF31，C221，S159和Amelogenin的同时扩增产物的荧光检测结果的激光打印图，是用HitachiFMBIOII荧光扫描仪的荧光素通道(图6A)和羧基四甲基罗丹明通道(图6B)检测的，如实施例6所述。发明详述A、定义以下定义有助于清晰且一致地理解以下术语的范围及详细内容，以用于阐述及解释本发明"等位基因梯"由从基因座中扩增的等位基因组成的标准大小标记。"等位基因"与一DNA区段相关的遗传变异，即占据相同基因座的DNA序列的两或多种变化形式之一。"生物化学命名"本文所用的是标准生物化学命名，其中核苷酸碱基被称为腺嘌呤(A);胸腺嘧啶(T);鸟嘌呤(G);和胞嘧啶(C)。相应的核苷酸例如是脱氧鸟苷一5，一三磷酸(dGTP)。"DNA多态性"DNA序列中两或多个不同的核苷酸序列一起存在于相同杂交群内的情况。"基因座"或"遗传基因座"染色体上的一个特异位置。基因座的等位基因位于同源染色体的相同位点。"基因座特异性引物"在扩增方法所用条件下，与所述基因座的一部分或其互补链特异杂交的，而不与其它DNA序列有效杂交的至少针对基因座的一个等位基因的引物。"五核苷酸串联重复"以下所述STR多态性的一个亚类。除非特别指出，术语"五核苷酸串联重复"涵盖了完全STR，其中重复单位是5个碱基序列，和不完全STR，其中至少一个重复单位是5个碱基重复。"聚合酶链反应"或"PCR":—种技术，其中通过变性，与引物退火，且用DNA聚合酶延伸的循环扩增靶DNA序列的拷贝数至大约106倍或更多倍。聚合酶链反应扩增核酸的方法见于美国专利4683195和4683202所述，在此对其所述方法并入参考。"多态性短串联重复基因座"以下所述的STR基因座，其中基因组DNA特定区域中的重复序列元件数目(及净序列长度)在等位基因间及个体间变化。"多态性信息容量"或"PIC":基因座存在的多态性数量的测量值(Botstein等，1980)。PIC值在01.0之间，较高值表明较高的多态性。此测量值通常比其它常规使用的测量值即杂合现象测量值呈现的值小。如果标记是高信息化的(杂合现象超过大约70%)，则杂合现象与PIC之间的差异较小。"引物":与基因座的DNA链杂交的单链寡核苷酸或DNA片段，以此方式引物的3'末端可作为DNA聚合酶的聚合位点。"引物对"两个引物，包括与在待扩增的DNA序列一端的单链杂交的引物1，和与在待扩增的DNA序列互补链上另一端杂交的引物2。"引物位点"弓I物杂交的靶DNA区域。"短串联重复基因座"或"STR基因座"含有短的，长度为3_7个碱基对的重复序列元件的基因组DNA区域。术语STR还涵盖了基因组DNA的一个区域，其中多于一个的3—7个碱基的序列串联重复或具有间插碱基地重复，条件是至少一个序列串联重复至少2次。在STR中至少重复一次的每个序列在此称作"重复单位"。用本发明材料和方法分析的STR基因座的序列可分为两种一般类型完全型和不完全型。本文所用术语"完全型"STR指含有串联重复至少二次的单一3—7个碱基的重复单位的双链DNA区域，如(AAAAT)2。本文所用术语"不完全型"STR指含有完全重复单位的至少二个串联重复，和不完全重复单位的至少一个重复的DNA区域，其中组成不完全重复单位的DNA序列可得自在完全重复单位序列中缺失，插入或取代1，2，3或4个碱基，例如(AAAAT)!2(AAAAAT)5AAT(AAATT)4。每个不完全型STR序列含有至少一个完全型STR序列。特别地，不论完全型或不完全型，每个STR序列都包括串联重复至少2次的至少一个重复单位序列，重复单位序列可以下式(1)代表-(AwGxTyCz)n(1)其中A，G，T和C代表任何顺序的核苷酸；w，x，y和z代表序列中每个核苷酸的数目，范围在0—7之间且w+x+y+z之和在3—7之间；n代表序列的串联重复次数且至少为2。B、多重反应成分的选择本发明的方法涉及选择适当的一系列基因座，引物和扩增方案以从多个共扩增的基因座中产生扩增的等位基因，优选地此多个共扩增的基因座大小不重叠，更优选地是以使人们能从大小重叠的不同基因座中区分出等位基因的方式标记的。另外，本方法涉及选择与单一扩增方案兼容使用的短串联重复基因座。本文所述的基因座的特异组合是这一应用特有的。基因座的组合可由于以上两种原因之一而否决，或由于组合一或多个基因座不能产生合适的产物量，或在此反应中产生不代表真正等位基因的片段而否决。除了上述所揭示的组合之外，成功的组合还可通过"反复试验"基因座组合，通过选择引物对序列，及通过调节引物浓度以鉴别其中所有包括的基因座均可扩增的平衡而产生。一旦揭示了本发明材料及方法，本领域技术人员可恰当地推断用于本发明的方法和试剂盒中的选择基因座，引物对和扩增技术的各种方法。所有这些方法均应在本发明权利要求范围内。本发明的方法实施中特别重要之处是产生自在多重扩增反应步骤中共扩增的各个基因座的扩增的等位基因的大小范围。在目前的分析技术中，可通过扩增小于500碱基的片段而检测的系统是最优选的。本发明的方法开始是选择一系列包含至少13个STR基因座的基因座，此13个基因座可以在一个多重扩增反应中共扩增。本发明选择基因座和寡核苷酸引物用于在多重扩增反应中扩增基因座的方法见于下述，并在实施例中例证。C、利用三个基因座的多重体开发三个以上基因座的多重体许多不同技术中的任一种都可用于选择用于本发明的一系列基因座。一个优选的开发用于此分析方法的有用基因座系列的技术见于下述。一旦研究出含有3个STR基因座的多重体，其可用作产生含有3个以上基因座的多重体的核心。这样，可以产生包括开始的3个基因座的三个以上基因座的新组合。例如，含有基因座D7S820，D13S317和D5S818的核心多重体可用于产生以下基因座的衍生多重体D16S539，D7S820，D13S317和D5S818;HUMCSFIPO，HUMTPOX,D16S539，D7S820，D13S317和D5S818;HUMCSFIPO，HUMTPOX，HUMTHOl，D16S539,D7S820,D13S317，和D5S818;HUMCSF1PO，HUMTPOX，HUMTHO1，HUMvWFA31，D16S539，D7S820，D13S317和D5S818;D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317,D17S539,D18S51，D21S11，HUMCSFIPO,HUMFIBRA，HUMTHOl，HUMTPOX，和HUMVWA31;S159，HUMCSFIPO,D16S539，D7S820,D13S317和D5S818;D3S1358，D5S818，D7S820,D8S1179，D13S317,D16S539，D18S51，D21S11，HUMSFIPO，HUMFIBRA，HUMTHOl,HUMTPOX和HUMvWFA31;D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317，D16S539，D18S51，D21S11，HUMSFIPO,HUMFIBRA，HUMTHOl，HUMTPOX，HUMvWFA31，G475，S159和Amelogenin。用本发明的方法，核心系列的基因座可用于产生其它适当的衍生的STR基因座系列用于多重分析。不论用什么方法选择用本发明的方法分析的基因座，所有选择的用于多重分析的基因座都显示以下特征(l)它们产生足够的扩增产物以进行评价；(2)它们产生很少(如果有的话)由于在多重扩增步骤期间在扩增的等位基因中加入(或未加入)碱基所致的假象；(3)它们产生很少(如果有的话)由于聚合酶提前终止扩增反应所致的假象；及(4)它们很少或不产生在给定的真扩增的等位基因之下的连续缺失单个碱基而产生的分子量较小的"拖尾"带。例如参见Schumm等，第四次国际人类鉴别研讨会论文集1993，pl77-187(由PromegaCorP.1994年公布)。如上述的用于鉴别至少3个基因座的相同技术，根据本发明的分析方法的优选实施方案，可用于选择13或更多个人体基因组的基因座或多重分析。如上述鉴别的任何系列的基因座是适用于本发明的多重分析的，条件是基因座系列包含至少13个STR基因座。更优选地，根据本发明分析的至少13个STR基因座的至少4个基因座选自以下一组D3S1539，D4S2368，D5S818，D7S820，D9S930，D10S1239，D13S317，D14S118，D14S548，D14S562，D16S490，D16S539,D16S753，D17S1298，D17S1299,D19S253,D20S481，D22S683，HUMCSFIPO，HUMTPOX，HUMTH01,HUMF13A01，HUMBFXIII，HUMLIPOL，和HUMvWFA31。更优选地，根据本发明分析的基因座系列包括全部13个CODIS基因座，艮卩D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317，D16S539，D18S51，D21S11，HUMCSFIPO，HUMFIBRA，HUMTH01，HUMTPOX，和HUMvWFA31。选择用于在本多重反应中进行共扩增的基因座的至少一个基因座优选是具有长度为5—7个碱基或碱基对的重复单位的STR基因座，更优选的是有五个核苷酸重复的STR基因座。如并入参考的美国专利申请09/018584所述，扩增具有这种中度重复的基因座发生最小的假象，该假象例如由于重复滑动所致。以上所述基因座系列包括3个具有五核苷酸重复的这种基因座G475，C221和S159。在此所用的术语"G475"，"C221"，和"S159"指如并入参考的美国专利申请09/018584所述的五核苷酸重复基因座的名称。每个名称相当于从中鉴别的每个五核苷酸基因座的克隆。在该专利申请中描述为SEIDNO:34的G475克隆的序列在本文称为SEQIDNO:108。在该文中描述为SEQIDNO:2的C221克隆的序列在本文称为SEQIDNO:109。在该文中描述为SEQIDNO:26的S159克隆的序列在本文称为SEQIDNO:110。在该文中用于扩增G475，C221和S159的各个引物和引物对也可用于扩增根据本发明共扩增和分析的至少13个基因座中的相同基因座。选择的用于本发明共扩增和分析的基因座系列优选除该至少13个STR基因座之外还包含至少一个基因座。此额外的基因座优选包括序列多态性，或鉴别能从人群其它个体的DNA中分辨一个个体DNA的特殊特征的另一种特征。此额外的基因座更优选的是鉴别分析的DNA样品来源性别的基因座。当此DNA样品是人基因组DNA时，鉴别来源性别的基因座如Amdogenin基因座是进行本发明共扩增和分析所优选的。此Amdogenin基因座在GenBank中鉴别为HUMAMELY(当用于鉴别包含于雄性DNAY染色体上基因座时)，或鉴别为HUMAMELX(当用于鉴别雄性或雌性DNAX染色体上基因座时)。当Amdogenin基因座在相同多重扩增反应中与至少13个短串联重复基因座共扩增时，在多重扩增反应中用于扩增此特殊基因座的引物至少一个具有选自以下的序列SEQIDNO:86，SEQIDNO:105，和SEQIDNO:87。D.选择引物一旦鉴别了在一个多重反应中共扩增的基因座系列，人们能确定适于共扩增每个基因座的引物。应小心选择用于多重反应的引物序列。不恰当选择引物可产生一些不希望的效果如不能扩增，在多个位点扩增，引物二聚体形成，不同基因座的引物序列的不希望的相互作用，一个基因座的等位基因与另一个基因座产生的等位基因重叠，或需要在多重反应中不相容的不同基因座的扩增条件或方案。用于本发明方法的引物或包含在本发明试剂盒中的引物优选根据以下选择方法选择。用于本发明多重系统的引物优选是通过重复进行选择引物序列，混合用于共扩增所选择的基因座的引物，共扩增基因座，然后分离并检测扩增的产物这一过程而选择的。开始，此方法通常以不平衡方式产生扩增的等位基因(即一些基因座比其它基因座的产量高)，而且还可能产生不代表等位基因自身的扩增产物。这些额外片段可由上述任一原因所致。为在多重分析系统中消除这种额外的片段，各个引物与相同或其它基因座的引物一起使用，以鉴别哪个引物导致额外片段的扩增。一旦鉴别产生一或多个这种片段的两个引物，将其中一个或两个引物均作修改并在成对或在多重分析系统(或多重分析系统的一部分)中进行重测试。重复进行此方法直至在多重分析系统中扩增的等位基因产量中没有或仅有可接受量的额外片段。有吋额外片段可通过在引物对中标记相反的引物而除去。此变化显示检测步骤中相反引物的产物。此新标记的引物比先前标记的引物可以扩增较高保真性的真实等位基因，产生占总扩增产物较大部分的真实等位基因。弓I物浓度的确定可在选择最终引物序列之前或之后进行，优选在选择之后进行。一般地，提高任何特殊基因座的引物浓度增加此基因座产生的产物量。然而，这也是个重复试验过程，因为一个基因座产量增加可降低一或多个其它基因座的产量。另夕卜，引物可相互作用而直接影响其它基因座的产量。引物浓度的线性增加不一定产生相应基因座产量的线性提高。基因座之间的平衡还受许多扩增方案的参数影响，如所用模板数量，扩增循环次数，热循环方案的退火温度，及在循环过程结束时包含或不包含额外延伸步骤。所有等位基因和基因座间的完全平衡通常达不到。多重分析系统开发的过程还可以是上述其它原理的重复过程。即首先开发少量基因座的多重分析系统，此系统在扩增中没有或几乎没有额外的片段。此系统的引物可与一或多个其它基因座的引物组合。此扩充的引物组合在扩增中可能产生或不产生额外的片段，从而可导入和评价新引物。重复进行上述一或多个重复选择过程，直至鉴别出能用于共扩增如上述选择的进行共扩增的至少13个基因座的一整套引物。应知可开发许多不同系列的引物以扩增特定系列的基因座。合成用于本发明方法的引物可使用本领域技术人员己知的任何寡核苷酸合成标准步骤进行。每个基因座的至少一个引物优选是与染料标记共价附着的，如以下部分F所述。下表1提供了已确定是适用于扩增所列出的相应多态性STR基因座的引物序列表。表1中至少一个引物优选用于扩增如上述进行共扩增和分析而选择的至少一个基因座。应知可鉴别适于同时扩增下列基因座的其它引物。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>E.制备DNA样品用于本发明方法中的基因组DNA样品，可使用与扩增DNA相容的任何制备DNA的方法。本领域技术人员己知许多这种方法。例如包括但非限于经苯酚提取纯化DNA(Sambrook，J.等(1989)分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，p9.14—9.19)，经盐沉淀部分纯化(Miller,S.等(簡)核酸研究16:1215)，或螯合树脂部分纯化(Walsh等，(1991)生物技术10:506—513，Comey等，(1994)法医学39:1254)，和用未处理的血液释放未纯化的物质(Burckhardt，J.(1994)PCR方法和应用3:239-243,McCabe，EdwardR.B.，(1991)PCR方法和应用1:99—106，Nordvag，Bjorn-Yngvar(1992)生物技术12:4p490-492)。当用本发明的方法分析的至少一个DNA样品是人基因组DNA时，此DNA优选制备自选自以下的组织血液，精液，阴道细胞，毛发、唾液、尿液、骨、颊样品，含有胎盘细胞或胎儿细胞的羊水，绒毛膜绒毛，及以上所引任何组织的混合物。优选地，DNA浓度可在用于本发明方法之前，用本领域技术人员已知的标准DNA定量方法测定。在这种情况下，DNA浓度优选通过Sambrook，J.，等(1989)，如前，附录E.5所述的分光光度测定法测定，或通过BrunkC.F.，等(1979)，分析生物化学92:497—500所述荧光测定法测定。DNA浓度更优选通过对比用人特异性探针杂交DNA标准物的数量而测定，如Waye，J.S.，等(1991)"在法医学样品中灵敏且特异地定量人基因组脱氧核糖核酸(DNA)调査报告"，法医学杂志，36:1198—1203所述。在扩增反应中使用太多的模板DNA可产生呈现为不代表真实等位基因的额外条带的假象。F.扩增DNA一旦制备了基因组DNA样品，靶基因座可在本发明方法的多重扩增方法中的任一种均可用于扩增基因座，包括但非限于聚合酶链反应(PCR)(Saiki，R.K.，等(1985)，科学230:1350—1354)，基于转录的扩增(Kwoh，D.Y.和Kwoh，T.J.(1990)美国生物技术实验室，1990年10月)，和链置换扩增(SDA)(Waller,(iT.,等(1992),美国科学院院报89:392—396)。优选地，DNA样品用特异于每个基因座的引物对进行PCR扩增。在此说明书后面所附的序列表详细地列出了以下实施例所用的引物序列，其中一些序列是本发明其它实施方案。每个基因座的至少一个引物优选地与染料标记共价附着，更优选地与荧光染料标记共价附着。引物与所附着的染料优选地选择用于多重扩增反应，如此当等位基因优选通过凝胶或毛细管电泳分离的时候，用一种颜色标记的每个基因座的引物扩增的等位基因，不重叠用相同颜色标记的引物共扩增的其它基因座的等位基因。在本发明方法的一尤为优选的实施方案中，在多重反应中共扩增的每个基因座的至少一个引物，在用于反应之前是用荧光标记标记的。适于附着用于本发明的引物的荧光标记可商购。例如购自PE生物系统和分子探针公司的荧光素和羧基四甲基罗丹明标记及它们的衍生物。更优选地，至少3个不同的标记用于标记多重扩增反应中所用的不同引物。当用大小标记评价多重反应时，用于制备大小标记的引物优选用与用于扩增反应中相应基因座的引物的不同标记标记。关于用于本发明方法中每种最优选的基因座组合的最优选的扩增方案详见于以下实施例。实施例还另外详述了与每个多重体相关的特异步骤。用于实施例的基因座特异性引物的序列包括许多核苷酸，这些核苷酸在杂交所用的条件下，充分地与扩增的基因座的等位基因杂交，而基本不扩增其它基因座的等位基因。参见并入参考的Simons的美国专利5，192，668，其更详细阐述了基因座特异性引物。G.制备和检测DNA片段一旦经过本发明方法的多重扩增步骤产生了一系列扩增的等位基因，对扩增的等位基因进行评价。此方法的评价步骤可通过任一种不同方法进行，优选以下所述方法。优选用电泳分离多重扩增反应的产物，更优选毛细管电泳(例如参见Buel，Eric等，(1998)，法医学杂志43(1)pl64-170)，或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(例如参见SambrookJ.等，(1989)，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版，p13.45-13.57)。以下实施例例证了适用于本发明方法评价步骤的凝胶制备及电泳步骤和条件。在变性聚丙烯酰胺凝胶电脉和毛细管电泳中分离DNA片段主要基于片段大小。一旦分离了扩增的等位基因，即可对凝胶或毛细管中的等位基因及任何其它DNA(如DNA大小标记或等位基因梯)进行观测及分析。在凝胶中观测DNA可用任何一种现有技术进行，包括银染或报道物如放射性同位素，荧光团，化学发光物和酶与可检测底物组合。然而，检测含有13或更多个基因座的多重体的优选方法是荧光测定(参见Schumm，J.W.等，第8次国际人类鉴定研讨会论文集，(由PromegaCorporation公布)，p78-84;Buel，Eric等，(1998)，如前))，其中多重反应中每个基因座的引物是用荧光检测仪检测标记的产物而追踪的。上述阐述观测等位基因的现有方法在此并入参考。DNA样品中存在的等位基因优选通过与大小标准物如DNA标记或基因座特异性等位基因梯相对比，以确定样品中每个基因座存在的等位基因。评价含有两或更多个多态性STR基因座的多重扩增的最优选的大小标准物由每个被评价的基因座的等位基因梯组合组成。参见Puers，Christoph等，(1993)AmJ.HumGenet.53:953-958，Puers.Christoph等，(1994)Genomics23:260-264。另参见美国专利5599666，5674686，和5783406，这些专利阐述了适用于STR基因座检测中的等位基因梯，及揭示了等位基因梯的构建方法。在构建各个基因座的等位基因梯之后，将它们混合并在扩增样品的同时进行凝胶电泳。每个等位基因梯与样品中相应基因座的等位基因一起迁移。本发明多重反应的产物可用内部泳道标准物评价，此标准物是设计为在聚丙烯酰胺凝胶或相同毛细管的相同泳道中电泳的一种特异类型的大小标准物。此内部泳道标准物优选由一系列已知长度的片段组成。此内部泳道标准物更优选地是用可与扩增反应中其它染料区分开的荧光染料标记的。在构建内部泳道标准物之后，此标准物也可与扩增的样品或等位基因梯混合，并进行电泳以对比凝胶电泳的不同泳道或毛细管电泳的不同毛细管中的迁移。内部泳道标准物迁移的变化表明分离介质性能的变化。对这些差异定量并用等位基因梯校正，以校正未知样品中等位基因的大小测定。H、优选的检测技术荧光检测在本发明方法的一个最优选的实施方案中，荧光检测用于评价多重扩增反应产生的混合物中扩增的等位基因。以下简要阐述了怎样应用优选的检测方法。随着自动荧光显像的出现，可以快速检测并分析多重扩增产物。对于荧光分析，每个基因座的扩增中可以包括一个荧光标记的引物。优选适用于本发明的荧光标记的引物包括荧光素标记的(FL—)、羧基四甲基罗丹明标记的(TMR—)及5，6—羧基罗丹明6G标记的(R6G)引物，如以下实施例中所例证的。优选通过板凝胶电泳或毛细管电泳，分离用这种标记的引物产生的扩增的片段。所得分离的片段可用荧光检测设备如ABIPRISM310遗传分析仪，ABIPRISM377DNA测序仪(AppliedBiosystemsDivision,PerkinElmer，FosterCrty，CA)或HitachiFMBIOII荧光扫描仪HitachiSoftwareEngineeringAmerica,Ltd.SouthSanFrancisco,CA)分析。简而言之，本发明的方法最优选用荧光检测作为检测步骤。在此优选的检测方法中，用于多重扩增反应的每对引物之一或两个均有附着于其的荧光标记，从而产生自扩增反应的扩增的等位基因是荧光标记的。在本发明此最优选的实施方案中，扩增的等位基因随后通过毛细管电泳分离，并用荧光显像分析仪观测及分析分离的等位基因。荧光检测比放射性标记和检测方法优选，因为它不需要使用放射性物质，避免了使用这种物质所伴随的所有法律及安全问题。应用标记引物的荧光检测也比其它非放射性检测方法如银染优选，因为荧光检测法比银染检测法产生的假象少。假象较少部分是由于在荧光检测中检测的只是用标记附着的DNA扩增链，而用银染检测法检测，则产生自多重扩增反应的DNA的每个扩增等位基因的二条链均是染色的。I、试剂盒本发明还涉及利用上述方法的试剂盒。一个基本试剂盒包含一个具有一或多个基因座特异性引物的容器。任选地可包括使用说明。其它任选的试剂盒成分可包括针对每个特异性基因座的等位基因梯，足够量的用于扩增的酶，促进扩增的扩增缓冲液，制备进行电泳的扩增物的加样溶液，作为对照模板的基因组DNA，确定物质在分离基质中如预期迁移的大小标准物，及教导使用者及限制使用中误差的方案及手册。试剂盒中各种试剂的数量也可根据许多因素而变化，这些因素如方法的最佳敏感性。本发明还提供了人工操作所用的测试试剂盒或自动检测仪或分析仪所用的测试试剂盒。实施例以下实施例举例说明了本发明的优点，并有助于熟练技术人员生产及使用。该实施例只是举例说明而非以任何方式限制本发明权利要求范围或专利授与的保护。以下实施例中分析的人基因组DNA制备自血液或组织培养细胞，使用Miller和Dykes所述标准步骤制备(Miller,S。等(1988)，核酸研究16:1215)。在该文所述的分离及定量方法本领域技术人员通常己知，且是本发明应用中优选的，但不是必须的。以下每个实施例是本发明方法的一个使用实例，以同时确定人基因组DNA的一或多个DNA样品的至少13个基因座中存在的等位基因。每个以下共扩增的基因座系列包括鉴别的用于CODIS系统的13个短串联重复基因座(即D3S1358，HUMTHOl，D21S11，D18S51,HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX，HUMFIBRA，D5S818，D3S317，D7S820，D16S539和HUMCSFIPO。一些以下共扩增的基因座系列还包括一或多个额外的短串联重复基因座如有五核苷酸重复的基因座(例如G475，S159,或C221)，及非STR基因座如Amelogenin。表2概括了以下每个实施例中所述多重扩增反应中共扩增的基因座系列。该表还表明了在每个这种多重反应中用于扩增每个这种基因座的引物对。表2所列每个引物对的一个引物在用于多重扩增反应中之前用荧光标记。在一些情况下，不同的标记用于标记不同基因座的引物，如此用不同引物产生的等位基因，当用激光激活的荧光设备检测时，可互相区分。有三种不同的荧光标记用于以下实施例，下表中"FL"代表荧光素标记的，"TMR"代表在羧基四甲基罗丹明标记的，"R6G"代表5，6—羧基罗丹明6G标记的。表2还表明了用于多重扩增反应的每对引物的哪个引物在每个实施例中是如此标记的(例如"FL—69"意为具有SEQIDNO:69的引物是在用于多重扩增反应之前在其5，端用荧光素标记的)。然而，在每个实施例的正文中，标记縮写置于所述扩增反应所用的标记的引物的SEQIDNO之前(例如"FL—SEQIDNO:2"代替"FL-2")。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>实施例扩增的基因座所用引物对:SEQIDNO所用荧光标记5D3S135868,69FL-69HUMTH0166,67FL-66D21S1164,65FL-65D18S5162,63FL-62G47588,94FL-94AmeIogenin86,87TMR-86HUMvWFA3176,40TMR-.40D8S117974,75TMR-75HUMTPOX72,73TMR-73HUMF旧RA70,71TMR-70D5S81884,B5FL-85D13S31782,83FL-83D7S82080,81FL-80D16S53929,79FL-79HUMCSF1PO77,78FL-78S15995,96FL-966D3S135869,106FL-69HUMTH0138,103FL-38D21S"64,65FL-65D1BS51101,102FL-101S15992,93FL-93AmeIogenin105,87TMR-105HUMvWFA3176,40TMR40D8S1179104,75TMR-104HUMTPOX72,73TMR-72HU图BRA70,107TMR-70D5S81884,85FL-85D13S3173,4FL-4D7S82080,81FL-80D16S53929,97FL-29HUMCSF1PO77,98FL-98C22199,100FL-99实施例1用ABIPRISM310遗传分析仪荧光枪测基因座D3S1358，HUMTHOl，D21S11，D18S51，HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX，HUMFIBRA，D5S818，D7S820，D13S317，D16S539,和HUMCSFIPO的多重扩增在此实施例中，在一个反应试管中同时扩增一个DNA模板的各个基因座D3S1358，HUMTHOl，D21S11，D18S51，HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX，HUMFIBRA，D5S818，D7S820，D13S317，D16S539，和HUMCSF1P0。PCR扩增在25lU1XGoldST*R缓冲液(50rnMKC1，1OmMTris-HCl(pH8.3在25。C)，0.1%TritonX-100，1.5mMMgCl2，160yg/mlBSA和200yM每种dATP，dCTP，dGTP，和dTTP)中，用lng模板和3.25UAmpliTaqGoldTMDNA聚合酶进行。在GeneAmpPCR系统9600(PerkinElmer,PosterCity，CA)中使用以下扩增方案96°C12分钟；然后进行10个循环的94°C30秒，在68秒内渐至58。C，保持30秒，在50秒内渐至7(TC，保持45秒；随后进行20个循环的在90'C30秒，在60秒内渐至58。C，保持30秒，在50秒内渐至70'C，保持45秒；接着进行1次60'C30分钟。组合使用26个扩增引物，包括各0.12uMD3S1358引物1(SEQIDNO:68)和引物2(FL—SEQIDNO:69)，各0.08uMHUMTHOl引物l(FL—SEQIDNO:66)和引物2(SEQIDNO:67)，各0,8UMD21S11引物1(SEQIDNO:64)和引物2(FL—SEQIDNO:65)，各0,2uMD18S51引物1(FL—SEQIDNO:62)和引物2(SEQIDNO:63)，各UuMHUMvWFA31弓|物1(SEQIDNO:76)和引物2(TMR—SEQIDNO:40)，各1.8pMD8S1179引物1(SEQIDNO:74)和引物2(TMR—SEQIDNO:75)，各0.6uMHUMTPOX引物1(SEQIDNO:72)和引物2(TMR—SEQIDNO:73)，各2.4uMHUMFIBRA引物1(TMR—SEQIDNO:70)和引物2(SEQIDNO:71)，各0.2pMD5S818引物1(SEQIDNO:84)和引物2(R6G—SEQIDNO:85)，各0.1UMD13S317弓l物1(SEQIDNO:82)和引物2(R6G—SEQIDNO:83)，各0.2pMD7S820引物1(R6G—SEQIDNO:80)和引物2(SEQIDNO:81)，各0.15yMD16S539引物1(SEQIDNO:29)和引物2(R6G—SEQIDNO:79)，各0.2ixMHUMCSFlPO引物l(SEQIDNO:77)和引物2(R6G—SEQIDNO:78)。扩增的产物用ABIPRISM310遗传分析仪分离。将DNA样品与24ul加样溶液(去离子化甲酰胺)和l.Oul内部泳道大小标准物混合，在95。C变性3分钟，并在注射之前在冰上预冷。用PerformanceOptimizedPolymer4(POP-4)(PerkinElmerBiosystems，FosterCity,CA)在47cmX50um毛细管中分离。使用生产者的GeneScan⑧运行模块GSSTRPOP4(出处同上)(lml)A。电泳条件是5秒注射，注射kV是15.0，电泳kV是15.0，电泳温度是6(TC，电泳时间是28分钟，并使用有效滤膜A。图1A是如上述用ABIPRISM310遗传分析仪分离并检测的每个基因座的扩增的片段的扫描打印结果。图1A示出DNA样品的同时扩增的基因座D3S1358，HUMTH01，D21S11，D18S51，HUMvWFA31，D8S1179,HUMTPOX，HUMFIBRA，D5S818，D7S820，D13S317，D16S539，和HUMCSFIPO的扩增产物。A组所示峰是用荧光素标记的，B组所示峰是用羧基四甲基罗丹明标记的，C组所示峰是用5，6-羧基罗丹明6G标记的。图1B是如图1A中扫描的样品相同方式制备的样品的扫描打印结果，除了在扩增反应中不用DNA模板。此图中的峰是得自染料缀合和纯化步骤及未阐明的原因的背景产物。实施例2用ABIPRISM310遗传分析仪荧光检测基因座D3S1358，HUMTHOl，D21S11，D18S51，G475，Amelogenin，HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX，HUMFIBRA，D5S818，D7S820，D13S317，D16S539，HUMCSFlPO和S159的多重扩增在此实施例中，在一个反应试管中同时扩增一个DNA模板的各个基因座D3S1358，HUMTHOl，D21SU，D18S51，G475，Amelogenin，HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX,HUMFIBRA,D5S818，D7S820,D13S317，D16S539，HUMCSFIPO和S159。PCR扩增在25u11XGoldST*R缓冲液(50mMKCl，10mMTris-HCl(pH8.3在25。C)，0.1%TritonX國IOO，1.5mMMgCl2，160ug/mlBSA和200uM每种dATP，dCTP，dGTP，和dTTP)中，用lng模板和4UAmpliTaqGoldTMDNA聚合酶进行。在GeneAmpPCR系统9600(PerkinElmer，PosterCity，CA)中使用以下扩增方案96°C12分钟；然后进行10个循环的94'C30秒，在68秒内渐至58'C，保持30秒，在50秒内渐至70。C，保持45秒；随后进行20个循环的在90'C30秒，在60秒内渐至58'C，保持30秒，在50秒内渐至70°C,保持45秒；接着进行1次60'C30分钟。组合使用32个扩增引物，包括各0.12UMD3S1358引物1(SEQIDNO:68)和引物2(FL—SEQIDNO:69)，各0.08PMHUMTH01引物l(FL—SEQIDNO:66)和引物2(SEQIDNO:67)，各0.8PMD21S11引物1(SEQIDNO:64)和引物2(FL—SEQIDNO:65)，各0.2uMD18S51引物1(FL—SEQIDNO:62)和引物2(SEQIDNO:63)，各0.24uMG475引物1(FL—SEQIDNO:88)和引物2(SEQIDNO:89)，各0.6uMAmelogenin引物1(TMR—SEQIDNO:86)和引物2(SEQIDNO:87)，各1.1ixMHUMvWFA31引物l(SEQIDNO:76)和引物2(TMR—SEQIDNO:40),各1.8uMD8S1179引物1(SEQIDNO:74)和引物2(TMR—SEQIDNO:75)，各0.6yMHUMTPOX引物1(SEQIDNO:72)和引物2(TMR—SEQIDNO:73)，各2.4PMHUMFIBRA引物1(TMR—SEQIDNO:70)和引物2(SEQIDNO:71)，各0.2nMD5S818引物l(SEQIDNO:84)和引物2(R6G—SEQIDNO:85)，各0.1UMD13S317引物1(SEQIDNO:82)和引物2(R6G—SEQIDNO:83)，各0,2uMD7S820引物1(R6G—SEQIDNO:80)和引物2(SEQIDNO:81)，各0.15uMD16S539引物l(SEQIDNO:29)和引物2(R6G—SEQIDNO:79)，各0.2uMHUMCSF1P0引物1(SEQIDNO:77)和引物2(R6G—SEQIDNO:78)，各0.1PMS159引物l(SEQIDNO:卯)和引物2(R6G—SEQIDNO:91)。扩增的产物用ABIPRISM310遗传分析仪分离。将DNA样品与24ul加样溶液(去离子化甲酰胺)和l.Oul内部泳道大小标准物混合，在95。C变性3分钟，并在注射之前在冰上预冷。用PerformanceOptimizedPolymer4(POP誦4)(PerkinElmerBiosystems，FosterCity,CA)在47cmX50um毛细管中分离。使用生产者的GeneScan⑧运行模块GSSTRPOP4(出处同上)(lml)A。电泳条件是5秒注射，注射kV是15.0，电泳kV是15.0，电泳温度是6(TC，电泳时间是28分钟，并使用有效滤膜A。图2A是如上述用ABIPRISM310遗传分析仪分离并检测的每个基因座的扩增的片段的扫描打印结果。图2A示出DNA样品的同时扩增的基因座D3S1358，HUMTH01，D21S11，D18S51，G475，Amelogenin，HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX，HUMFIBRA，D5S818，D7S820，D13S317,D16S539，HUMCSF1PO和S159的扩增产物。A组所示峰是用荧光素标记的，B组所示峰是用羧基四甲基罗丹明标记的，C组所示峰是用5,6-羧基罗丹明6G标记的。图2B是如图2A中扫描的样品相同方式制备的样品的扫描打印结果，除了在扩增反应中不用DNA模板。此图中的峰是得自染料缀合和纯化步骤及未阐明的原因的背景产物。实施例3用ABIPRISM377DNA测序仪荧光检测基因座D3S1358,HUMTHOl，D21S11，G475，Amdogenin，HUMvWFA31，D8S1179,HUMTPOX，HUMFIBRA，D5S818，D7S820，D13S317，D16S539，HUMCSF1P0和S159的多重扩增在此实施例中，DNA样品如实施例2扩增。扩增的产物用ABIPRISM377DNA测序仪分离。这是用0.2mm厚的5%LongRanger丙烯酰胺(FMCBioProducts,Rockland,ME)，7M尿素凝胶进行。DNA样品与1.5^1上样缓冲液(88.25%甲酰胺，4.1mMEDTA，15mg/ml蓝色葡聚糖)和0.5ul内部泳道大小标准物混合，在9(TC变性2分钟，并在加样前在冰上预冷。用生产者的GeneScan预电泳模块(PRGS36A—2400)和电泳模块(GS36A—2400)进行电泳。电泳时间3小时并使用有效滤膜A。图3A是如上述用ABIPRISM377DNA测序仪分离并检测的每个基因座的扩增的片段的扫描打印结果。图3A示出DNA样品的同时扩增的基因座D3S1358，HUMTHOl，D21S11，D18S51，G475，Amelogenin，HUMvWFA31，D8S1179,HUMTPOX，HUMFIBRA,D5S818,D7S820,D13S317,D16S539，HUMCSF1PO和S159的扩增产物。A组所示峰是用荧光素标记的，B组所示峰是用羧基四甲基罗丹明标记的，C组所示峰是用5，6-羧基罗丹明6G标记的。图3B是如图3A中扫描的样品相同方式制备的样品的扫描打印结果，除了在扩增反应中不用DNA模板。此图中的峰是得自染料缀合和纯化步骤及未阐明的原因的背景产物。实施例4用HitachiFMBIOII荧光扫描仪荧光检测基因座D3S1358,HUMTHOl，D21S11，D18S51，G475，Amdogenin，HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX，HUMFIBRA，D5S818，D7S820,D13S317，D16S539，HUMCSF1PO和S159的多重扩增在此实施例中，两个DNA模板均在选自基因座D3S1358，HUMTHOl，D21S11，D18S51，G475，Amelogenin,HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX，HUMFIBRA，D5S818，D7S820，D13S317，D16S539,HUMCSFIPO和S159的三个不同基因座组合的每一个基因座组合同时被扩增。每个基因座组合的扩增包括用5ng模板，在含有25u11XGoldST*R缓冲液(50mMKC1，10mMTris-HCl(pH8.3在25。C)，0.1%TritonX-100,1.5mMMgCl2，160ug/mlBSA和200uM每种dATP，dCTP，dGTP，和dTTP)的一个反应试管中进行。GeneAmpPCR系统9600(PerkinElmer,FosterCity,CA)用于以下扩增方案96°C12分钟；然后进行10个循环的94-C30秒，在68秒内渐至58。C，保持30秒，在50秒内渐至70。C，保持45秒；随后进行22个循环的在90。C30秒，在60秒内渐至58。C，保持30秒，在50秒内渐至7(TC，保持45秒；接着进行1次60。C30分钟。使用以下浓度的32个扩增引物包括0.225PMD3S1358引物1(SEQIDNO:68)和引物2(FL—SEQIDNO:69)，各0.2uMHUMTH01弓I物1(FL—SEQIDNO:66)和引物2(SEQIDNO:67)，各l,OuMD21S11引物1(SEQIDNO:64)和引物2(FL—SEQIDNO:65)，各1.0uMD18S51引物1(FL—SEQIDNO:62)和引物2(SEQIDNO:63)，各2.8uMG475引物1(FL—SEQIDNO:88)和引物2(SEQIDNO:89)，各0.2uMAmelogenin引物1(TMR—SEQIDNO:86)和引物2(SEQIDNO:87)，各0.3uMHUMvWFA31引物l(SEQIDNO:76)和引物2(TMR—SEQIDNO:40)，各1.5nMD8S1179引物1(SEQIDNO:74)和引物2(TMR—SEQIDNO:75)，各0.2uMHUMTPOX引物1(SEQIDNO:72)和引物2(TMR—SEQIDNO:73)，各2.0PMHUMFIBRA引物1(TMR—SEQIDNO:70)和引物2(SEQIDNO:71)，各0.55uMD5S818引物1(SEQIDNO:84)和引物2(FL—SEQIDNO:85)，各1.1yMD13S317引物1(SEQIDNO:82)和引物2(FL—SEQIDNO:83)，各1.7uMD7S820引物1(FL—SEQIDNO:80)和引物2(SEQIDNO:81)，各3.3PMD16S539引物1(SEQIDNO:29)和引物2(FL—SEQIDNO:79)，各0.5uMHUMCSF1PO引物l(SEQIDNO:77)和引物2(FL—SEQIDNO:78)，各2.0uMS159引物1(SEQIDNO:90)和引物2(FL—SEQIDNO:91)。在第一个基因座组合中，每个模板用2.5U的AmpliTaqGoldDNA聚合酶和上述浓度的针对每个基因座D3S1358，HUMTH01,D21S11,D18S51,G475，Amelogenin，HUMvWFA31，D8S1179,HUMTPOX和HUMFIBRA的弓|物进行扩增。在第二个基因座组合中，上述浓度的所有32个弓I物和4U的AmpliTaqGoldDNA聚合酶用于在一个反应试管中扩增所有16个基因座D3S1358，HUMTHOl，D21S11，D18S51，G475，Amelogenin，HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX，HUMFIBRA，D5S818，D7S820，D13S317，D16S539，HUMCSF1P0和S159。在第三个基因座组合中，每个模板用1.5U的AmpliTaqGoldTMDNA聚合酶和上述浓度的针对每一基因座D5S818，D7S820，D13S317,D16S539，HUMCSF1P0和S159的引物进行扩增。扩增产物通过含有7M尿素的0.4mm厚4%变性聚丙烯酰胺凝胶(19:1比例的丙烯酰胺与双丙烯酰胺)电泳分离(Sambrook等，(1989))，该凝胶与2个玻璃平板化学交联(Kobayashi，Y.(簡)，BRLFocus10:73-74)。将DNA样品与3.5U1加样溶液(10mMNaOH，95%甲酰胺，0.05。/。溴酚兰)和0.5ul内部泳道大小标准物混合，在95。C变性2分钟，并在加样前在冰上预冷。分离的产物通过用HitachiFMIBOII荧光扫描仪(HitachiSoftwareEngineeringAmerica,Ltd.,SouthSanFrancisco,CA)检测荧光信号而进行观测。505織和585nm带通滤波器分别用于检测荧光素标记的基因座和羧基四甲基罗丹明标记的基因座。650nm条通滤波器用于检测内部泳道大小标准物(大小标准物数据未示出)。图4A和4B显示了得自每个扩增反应的片段。图4A示出得自505nm扫描结果(荧光素通道)，图4B示出得自相同聚丙烯酰胺泳道的585nm扫描结果(羧基四甲基罗丹明通道)。对每个DNA模板而言，泳道1示出同时扩增基因座D3S1358，HUMTHOl，D21S11，D18S51，G475,Amelogenin，HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX，和HUMFIBRA的DNA样品的结果。泳道2示出同时扩增基因座D3S1358，HUMTHOl，D21S11，D18S51，G475，Amelogenin，HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX，HUMFIBRA，D5S818，D13S317，D7S820，D16S539，HUMCSFIPO，和S159的DNA样品的结果。泳道3示出同时扩增基因座D5S818，D13S317，D7S820，D16S539，HUMCSFIPO,和S159的DNA样品的结果。实施例5用HitachiFMBIOII荧光扫描仪荧光检测基因座D3S1358，HUMTHOl，D21S11，D18S51，G475，Amelogenin,HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX，HUMFIBRA，D5S818，D7S820，D13S317，D16S539，HUMCSFIPO和S159的多重扩增在此实施例中，两个DNA模板均在选自基因座D3S1358，HUMTHOl，D21S11，D18S51，G475，Amelogenin,HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX,HUMFIBRA，D5S818，D7S820,D13S317，D16S539，HUMCSFIPO和S159的两个不同基因座组合的每一个基因座组合同时被扩增。每个基因座组合的扩增包括用5ng模板，在含有25ullXGoldST承R缓冲液(50mMKC1，lOmMTris-HCl(pH8.3在25。C)，0.1%TritonX國100，1.5mMMgCl2，160Ug/mlBSA和200uM每种dATP，dCTP，dGTP，禾QdTTP)的一个反应试管中进行。GeneAmpPCR系统9600(PerkinElmer，FosterCity，CA)用于以下扩增方案96°C12分钟；然后进行10个循环的94'C30秒，在68秒内渐至58'C，保持30秒，在50秒内渐至70'C，保持45秒；随后进行22个循环的在90°C30秒，在60秒内渐至58。C，保持30秒，在50秒内渐至7(TC，保持45秒；接着进行1次6(TC30分钟。使用以下浓度的32个扩增引物包括0.225"MD3S1358引物1(SEQIDNO:68)和引物2(FL—SEQIDNO:69)，各0.2uMHUMTH01引物1(FL—SEQIDNO:66)和引物2(SEQIDNO:67)，各1.0UMD21S11引物1(SEQIDNO:64)和引物2(FL—SEQIDNO:65)，各1.0uMD18S51引物1(FL—SEQIDNO:62)和引物2(SEQIDNO:63)，各2.8uMG475引物1(SEQIDNO:88)和引物2(FL—SEQIDNO:94)，各0.2uMAmelogenin引物1(TMR—SEQIDNO:86)和引物2(SEQIDNO:87)，各0.3UMHUMvWFA31引物1(SEQIDNO:76)和引物2(TMR—SEQIDNO:40)，各1.5uMD8S1179引物l(SEQIDNO:74)和引物2(TMR—SEQIDNO:75)，各0.2PMHUMTPOX引物1(SEQIDNO:72)和引物2(TMR—SEQIDNO:73)，各2.0uMHUMFIBRA引物l(TMR—SEQIDNO:70)和引物2(SEQIDNO:71)，各0.55UMD5S818引物l(SEQIDNO:84)和引物2(FL—SEQIDNO:85)，各l,luMD13S317引物1(SEQIDNO:82)和引物2(FL—SEQIDNO:83)，各1.7yMD7S820引物1(FL—SEQIDNO:80)和引物2(SEQIDNO:81)，各3.3UMD16S539引物1(SEQIDNO:29)和引物2(FL—SEQIDNO:79)，各0.5uMHUMCSF1PO引物l(SEQIDNO:77)和引物2(FL—SEQIDNO:78)，各2.0PMS159引物1(SEQIDNO:95)和引物2(FL—SEQIDNO:96)。在第一个基因座组合中，每个模板用2.5U的AmpliTaqGoldDNA聚合酶和上述浓度的针对每个基因座D3S1358，HUMTHOl，D21S11，D18S51,G475，Amelogenin，HUMvWFA31，D8S1179,HUMTPOX和HUMFIBRA的弓I物进行扩增。在第二个基因座组合中，上述浓度的所有32个引物和4U的AmpliTaqGoldDNA聚合酶用于在一个反应试管中扩增所有16个基因座D3S1358,HUMTHOl，D21S11，D18S51，G475，Amelogenin,HUMvWFA31,D8S1179,HUMTPOX,HUMFIBRA,D5S818，D7S820，D13S317，D16S539,HUMCSF1PO和S159。扩增产物如实施例4所述分离和观测。图5A和5B显示了得自每个扩增反应的片段。图5A示出得自505nm扫描结果(荧光素通道)，图5B示出得自相同聚丙烯酰胺泳道的585nm扫描结果(羧基四甲基罗丹明通道)。对每个DNA模板而言，泳道1示出同时扩增基因座D3S1358，HUMTH01，D21S11，D18S51，G475，Amelogenin，HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX,和HUMFIBRA的DNA样品的结果。泳道2示出同时扩增基因座D3S1358,HUMTHOl，D21S11，D18S51，G475，Amelogenin,HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX,HUMFIBRA,D5S818，D13S317，D7S820，D16S539，HUMCSFIPO，和S159的DNA样品的结果。实施例6用HitachiFMBIOII荧光扫描仪荧光检测基因座D3S1358，HUMTHOl，D21S11，D18S51，S159，Amdogenin，HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX，HUMFIBRA，D5S818，D7S820，D13S317，D16S539，HUMCSFIPO和C221的多重扩增在此实施例中，两个DNA模板均在选自基因座D3S1358,HUMTHOl，D21S11，D18S51，S159，Amelogenin，HUMvWFA31，D8S1179,HUMTPOX,HUMFIBRA，D5S818，D7S820,D13S317，D16S539，HUMCSFIPO和C221的三个不同基因座组合的每一个基因座组合同时被扩增。每个基因座组合的扩增包括用10ng模板，在含有25lU1XGoldSPR缓冲液(50mMKCl，10mMTris-HCl(pH8，3在25。C)，O.io/oTritonX國100，1.5mMMgCl2，160ug/mlBSA和200uM每种dATP，dCTP，dGTP，禾QdTTP)的一个反应试管中进行。GeneAmpPCR系统9600(PerkinElmer,FosterCity，CA)用于以下扩增方案96°C12分钟；然后进行10个循环的94'C30秒，在68秒内渐至60。C,保持30秒，在50秒内渐至70。C，保持45秒；随后进行20个循环的在90°C30秒，在60秒内渐至60°C，保持30秒，在50秒内渐至70'C，保持45秒；接着进行1次60'C30分钟。使用以下浓度的32个扩增引物包括0.75uMD3S1358引物1(SEQIDNO:106)和引物2(FL—SEQIDNO:69)，各0.3uMHUMTH01引物1(FL—SEQIDNO:38)和引物2(SEQIDNO:103)，各2.0uMD21S11引物1(SEQIDNO:64)和引物2(FL—SEQIDNO:65)，各0.3UMD18S51引物1(FL—SEQIDNO:101)和引物2(SEQIDNO:102)，各2.0uMS159引物1(SEQIDNO:92)和引物2(FL—SEQIDNO:93)，各0.15uMAmelogenin引物1(TMR—SEQIDNO:105)和引物2(SEQIDNO:87)，各l.OuMHUMvWFA31引物1(SEQIDNO:76)和引物2(TMR—SEQIDNO:40)，各1.25UMD8S1179引物1(TMR—SEQIDNO:104)和引物2(SEQIDNO:75)，各0.75HMHUMTPOX引物1(TMR—SEQIDNO:72)和引物2(SEQIDNO:73)，各1.5uMHUMFIBRA引物l(TMR—SEQIDNO:70)和引物2(SEQIDNO:107)，各0.55uMD5S818引物1(SEQIDNO:84)和引物2(FL—SEQIDNO:85)，各l.luMD13S317引物l(SEQIDNO:3)和引物2(FL—SEQIDNO:4)，各1,7uMD7S820引物1(FL—SEQIDNO:80)和引物2(SEQIDNO:81)，各3.3uMD16S539引物1(FL—SEQIDNO:29)和引物2(SEQIDNO:97)，各0.25PMHUMCSFIPO引物l(SEQIDNO:77)和引物2(FL—SEQIDNO:98)，各l.OuMC221引物1(FL—SEQIDNO:99)和引物2(SEQIDNO:100)。在第一个基因座组合中，每个模板用2.5U的AmpliTaqGoldDNA聚合酶和上述浓度的针对每个基因座D3S1358，HUMTHOl，D21S11，D18S51，S159，Amelogenin，HUMvWFA31，D8S1179，HUMTPOX和HUMFIBRA的引物进行扩增。在第二个基因座组合中，上述浓度的所有32个引物和4U的AmpliTaqGoldTMDNA聚合酶用于在一个反应试管中扩增所有16个基因座D3S1358，HUMTHOl，D21S11，D18S51，S159，Amelogenin，HUMvWFA31，D8S1179,HUMTPOX，HUMFIBRA，D5S818，D7S820，D13S317,D16S539，HUMCSF1PO和C221。在第三个基因座组合中，每个模板用1.5U的AmpliTaqGoldTMDNA聚合酶和上述浓度的针对每一基因座D5S818，D7S820，D13S317,D16S539，HUMCSF1P0和C221的引物进行扩增。扩增产物如实施例4所述分离与检测，除了将扩增产物的每个样品用1XSTR缓冲液(50mMKC1，10mMTris-HCl(pH8.3在25°C)，0.1%TritonX曙IOO，1.5mMMgCl2和200PM每种dATP，dCTP，dGTP和dTTP)以1:4稀释。将稀释的扩增产物(2.5ul)与2.5lU不含内部泳道标准物的加样溶液(10mMNaOH，95%甲酰胺，0.05%溴酚兰)混合，在95%变性2分钟，并在加样之前在冰上预冷。图6A和6B显示了得自每个扩增反应的片段。图6A示出得自505nm扫描结果(荧光素通道)，图6B示出得自相同聚丙烯酰胺泳道的585nm扫描结果(羧基四甲基罗丹明通道)。对每个DNA模板而言，泳道1示出同时扩增基因座D3S1358，HUMTHOl，D21S11,D18S51，S159，Amelogenin，HUMvWFA31，D8S1179,HUMTPOX，和HUMFIBRA的DNA样品的结果。泳道2示出同时扩增基因座D3S1358,HUMTHOl，D21S11，D18S51，S159，Amelogenin,HUMvWFA31，D8S1179,HUMTPOX，HUMFIBRA,D5S818，，D16S539，HUMCSFIPO，和C221的DNA样品的结果。泳道3示出同时扩增基因座D5S818,D13S317,D7S820，D16S539，HUMCSFIPO,和C221的DNA样品的结果。些或全部是多态基因座。就长度或序列而言充分多态的遗传标记，很久以来被试图用于鉴定身份应用中，如亲权认定及鉴别收集的用于法医分析的组织样品。这种标记及分析该标记的方法的揭示与开发，在以往许多年已进行了几个阶段的开发。第一个鉴别的DNA变体标记是简单碱基取代，即简单序列多态性，其通常由Southern杂交分析检测。例如，描述设计用于用放射活性探针分析限制性内切酶消化的DNA的这种标记的鉴别的参考文献，参见Southern,E.M.(1975)，J.Mol.Biol.98(3):503—507;Schumm，etal(1988)，AmericanJournalofHumanGeneties42:143—159;及Wyman，A.andWhite，R.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:6754一6758。第二代标记是大小变体，即长度多态性，尤其"串联重复可变数"(VNTR)标记(NakamuraY.etal.(1987).Science235:1616—1622;及美国专利4,963,663，授予White等(1990);美国专利5,411,859，4，963，663的继续，授予White等(1995))和"小卫星"标记(Jeffreysetal.(1985a)，Nature314:67—73;Jeffreysetal，(1985b)Nature316:76—79;美国专利5，175，082，发明人Feffieys)。VNTR和小卫星标记均含有以串联方式重复的几个相同序列的区域。核心重复序列长度为10一70个碱基，较短的核心重复序列称为"小卫星"重复，较长重复称为YNTRs。人群中不同个体含有不同数量的这些重复。VNTR标记通常比碱基取代多态性具有更高的多态性，有时在单一遗传基因座上呈现接近40或更多个等位基因。但是，仍需要限制酶消化及随后的Southern杂交分析等繁琐方法检测及分析大多数这种标记。接下来的进展包括聚合酶链反应(PCR)(美国专利4,683,203，Mullis,K.B.)技术与分析VNTR基因座(Kasai，K.etal.(1990)Journal<image>imageseeoriginaldocumentpage56</image><223>D9S930<崇>13tggacaacagagtgagatgc20<210>14<211>23<212〉DNA<213>Homosapien<220><223>D9S930<400>14gctatgggaattacaagcaggaa23<210>15<211>26<212>DMA<213>Homosapien<220><223>D10S1239<400>15ctttgaaatggacccctagctaatgt26<210>16<211>21<212>DMA<213>Homosapien<:220><223〉D10S1239<400>16caccctgtccccagctatctg21<210〉17<211>19<212>DNA<213>Homosapien<220><223>D14S118<400>17cagcttgggcaacatsggg19<210>18<211>24<212>DMA<213>Homosapien<220><223>D14S118'<400>18caaactcctgaggtcaaacaatcc24<210>19<211>21<212>DNA<213>Homosapien<220><223>D14S562<400>19cttggagggtggggtggctsa21<210>20<211>24<212>DNA<213>Homosapien<220><223>D14S562<鋼>20cgaaattttgttgccttgctctgg24<210>21<211>21<212>DNA<213>Homosapien<220><223>D14S548<秦》21cctgggcaacagagtgagact21<210>22<211>23<212>DNA<213>Homosapien<220:><223>DHS548<则>22scccagctttaacagtttgtgctt24<210;>23<211>23<212>DNA<213>Komosapien<223>D16S490"00>23gggcggacscagastgtaaaatc23<210>24<211>24<212>DNA<213>Homosapien<220〉<223>D16S490"00>24aaacccaaataga仁gacaggcaca24<210>25<211>24<212>DNA<213>Homosapien<220><223><400>25gcsctccaggctgsatgacagaac24<210:>26<211>24<212>DNA<213>Homosapien<220;><223>D16S753<湖:>26gcagtgccgcctatttttgtgaat24<210>27<211>24<212>DNA<213>Homosapien<220><223>D17S1299<秦>27accctgatgagatagcacttgage24<210>28<211>24<212>DNA<213>Homosapien<220><223〉D17S1299<400>28cactgtgtggaggtgtagcagaga24<210>29<211>24<212>DNA<213>Homosapien<220><223〉D16S539<400>29gggggtctaagagcttgtaaaaag24<210>30<211>26<212>DNA<213>Homosapien<220><223>D16S539<400>30tgtgcatctgtaagcatgtatctatc26<210>31<211>23<212>DNA<213>Homosapien<220><223>D22S683"00>31cgaaggttgcattgagccaagat23<210>32<211>23<212>DNA<213>Homosapien<220><223>D22S683<備>32ggtggaaatgcctcatgtagaaa23<210>33<211>24<212>DNA<213>Homosapien<220><223>H(JMCSF1P0"00>33aacctgagtctgccssggactagc24<210>34<211>24<212>DMA<213>Homosapien<220><223>HUMCSF1PO<400>34ttccacacaccactggccatcttc24<210>35<211>24<212>DNA<213>Homosapien<220><223>H瞎POX<400>35actggcacagaacaggcacttagg24<210〉36<211>24<212〉DNA<213〉Homosapien<220><223>HUMTPOX"00〉36ggaggaactgggaaccacacaggt24<210>37<211>24<212〉DNA<213〉Homosapien<220><223>H隨HOl<400>37attcaaagggtatctgggctctgg24<210>38<211>24<212>DNA<213>Homosapien<220><223>HUM丁HOl<400>38gtgggc仁gadaagctcccgattat24<210>39<211>29<212>DNA<213>Ho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13>Homosapien<220><223>D16S539<綱>97gtttgtgtgtgcatctgtaagcat24<210>98<211>24<212>DNA<213>Homosapien<220><223>,CSF1P0<400>98cctgtgtcagaccctgttctaagt24<210>99<formula>formulaseeoriginaldocumentpage69</formula><212>DNA<213>Homosapien<220><223>D3S1358<400>106actgcagtccsatctgggt<210>107<211>21<212>DNA<213>Homosapien<220><223〉HUMFIBRA<400>107ctatgactttgcgcttcagga<210>108<211>1000<212>DNA<213>Homosapien<:220>"23〉来自pGem3Zf(+)质粒文库的克隆S519<400〉108aaaccccgtctctactaaaaatacaaaagtggcctgtaatcccacctataatcccacctagaatcgcttgaacccaggatggggcgattgactgcactccagcctgggtgacagagcgagaaaaaaaacagaatcataggccaggcacagggctgagacgggaggatcgagaccatcctgtctctacaaaaaaaaaaaaaaattttttttgctgaagtaggatcacttgagcctggaagggatcacaccactacactccagcctaggtgaagsaagaasaaaaagasagaaaagaaaagaaaagaaaagaaaaaacgaaggggaaaaaaa匸aaaatttctcaaaaaaatcgttatgaccatagatatcacaaaatcatgacctattaaaacatcaaa^cttaaaagttctactcttcasaaaaaagacacgccacaggctaagagaaagt3aaaggactt:gtgtccagattaaagaattcccaattaaaaatcggcaaaagatttgaagaatataaatgtgtccgggcgcgatggtaatcggcaggcggatcacttgaggtcaggagtttggtgaaaccctgtctctaataaaaatacaa<210>109<211>411<212>DNA<213>Homosapien<220>"23^来自pGem3Zf(+)质粒文库的克隆C221<400>109gatcacttgccatccctgccacacagtttcctcctctggaaactgggggt50gatgacccctgccctacccacttgtcatggcattggggacatgaacacac100tttgcacctgtcaggcsaggcttaaacagggatatgcactggtaatagaa150aagagggactaagttttgttttgttttgttttgttttgttttgttttgtt200ttgttttgttttgttttgttttgtttttctgaagaagtccctagaagcgc250tcagtgttggaatgctctcttgtagcagtggcggctgctgctggttccgg300gtcagatgccggaattgggggtgcgcttgggtgcagctgcatttcatctg350gtcctgggcctcggtcctggcttggagaggtgcagctcacagccacttca400tggctgggatc411tagttgagcatggtggcacg50ctcgggaggctgaggcagga100cagtgagccgagatcgtgcc150actccatctc200tggctaattgtaccttggga250ggcaccatagtgagaccccs300aatatagccaggcatggtgag350tcgaagctgaagtgagccat循cagagcaagaC3CC3tCtC3450aaagaaaagaaaagaaaaga500gagaatcata550taggttaggcaaatstttct600aagtasgttt650agatacctta700acttctastcacatstctaa750ttacacatca800gststttsac850ccagcactttgagaggccga900aggaccagtctggccaacat950asattagctgggtgtggtgg1000<210>110<211>335<212>DNA<213〉Homosapien<220><223>来自pG抓3Zf(+)质粒文库的克隆G475<400>110gstcacgccattgcactccagcctgggcgactgagcaagactcagtctca50aagaaaagaaaagaaaagaaaagaaaagaaaagaaaagaaaagaaaagaa100aagaaaagaaaattgtaaggagttttctcaattaataacccaaataagag150aattctttccatgtatcaatcatgatactaagcactttacacacatgtat200gttatgtaatcattatatcatgcatgcaaggtaatgagtattattttcct250cattttataaaagaggaaactgatgtttgaggctactttgcttaagaccg300cagaactagcaaaggaaaagagaagtgaatgtatc33权利要求1、同时确定来自一或多个DNA样品的一系列基因座中存在的等位基因的方法，包括(a)在一个多重扩增反应中共扩增所述DNA样品中的该系列基因座以产生扩增的等位基因的混合物，其中所述基因座包含D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317，D16S539，D18S51，D21S11，HUMCSF1PO，HUMFIBRA和HUMvWFA31；和(b)评价混合物中的扩增的等位基因，以确定DNA样品中该系列每个分析的基因座存在的等位基因。2、权利要求1的方法，还包含至少1个选自以下一组的短串联重复基因座D3S1539，D4S2368，D9S930，D10S1239，D14S118，D14S548,D14S562,D16S490，D16S753，D17S1298，D17S1299，D19S253，D20S481，D22S683,HUMF13A01，HUMBFXIII，HUMLIPOL。3、权利要求1的方法，其中该系列基因座还包含五核苷酸串联重复基因座。4、权利要求3的方法，其中五核苷酸串联重复基因座选自G475，C221和S159。5、权利要求1的方法，其中该系列基因座还包含能用于鉴别DNA样品的至少一个来源的性别的基因座。6、权利要求5的方法，其中DNA样品的至少一个来源是人，且用于鉴别人性别的基因座是Amdogenin基因座。7、权利要求6的方法，其中Amelogenin基因座是用具有选自SEQIDNO:86，SEQIDNO:87和SEQIDNO:105的序列的寡核苷酸引物共扩增的。8、权利要求l、2、3或5中任一项的方法，其中多重扩增反应是用具有选自以下至少一组序列的寡核苷酸引物对进行的，所述的组为SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:80和SEQIDNO:81，当该系列基因座之一是D7S820时；SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:82和SEQIDNO:83，当该系列基因座之一是D13S317时；SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:84和SEQIDNO:85，当该系列基因座之一是D5S818时；SEQIDNO:7,SEQIDNO:8和SEQIDNO:49，当该系列基因座之一是D3S1539时；SEQIDNO:9，SEQIDNO:10，当该系列基因座之一是D17S1298时；SEQIDNO:11，SEQIDNO:12，SEQIDNO:52，SEQIDNO:53，当该系列基因座之一是D20S481时；SEQIDNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:55，SEQIDNO:61，当该系列基因座之一是D9S930时；SEQIDNO:15，SEQIDNO:16，SEQIDNO:54，当该系列基因座之一是D10S1239时；SEQIDNO:17，SEQIDNO:18，当该系列基因座之一是D14S118时；SEQIDNO:19，SEQIDNO:20，当该系列基因座之一是D14S562时；SEQIDNO:21，SEQIDNO:22，当该系列基因座之一是D14S548时；SEQIDNO:23，SEQIDNO:24，当该系列基因座之一是D16S490时；SEQIDNO:25，SEQIDNO:26，当该系列基因座之一是D16S753时；SEQIDNO:27，SEQIDNO:28，当该系列基因座之一是D17S1299时；SEQIDNO:29，SEQIDNO:30，SEQIDNO:58，SEQIDNO:79和SEQIDNO:97，当该系列基因座之一是D16S539时；SEQIDNO:31，SEQIDNO:32，当该系列基因座之一是D22S683时；SEQIDNO:33，SEQIDNO:34，SEQIDNO:77，SEQIDNO:78和SEQIDNO:98，当该系列基因座之一是HUMCSFIPO时；SEQIDNO:39，SEQIDNO:40，SEQIDNO:59，SEQIDNO:60和SEQIDNO:76，当该系列基因座之一是HUMvWFA31时；SEQIDNO:41,SEQIDNO:42，当该系列基因座之一是HUMF13A01时；SEQIDNO:45，SEQIDNO:46，当该系列基因座之一是HUMBFXIII时；SEQIDNO:47，SEQIDNO:48,当该系列基因座之一是HUMLIPOL时；SEQIDNO:50，SEQIDNO:51，当该系列基因座之一是D19S253时；SEQIDNO:56，SEQIDNO:57，当该系列基因座之一是D4S2368时；SEQIDNO:62，SEQIDNO:63，SEQIDNO:101和SEQIDNO:102,当该系列基因座之一是D18S51时；SEQIDNO:64和SEQIDNO:65，当该系列基因座之一是D21S11时；SEQIDNO:68，SEQIDNO:69和SEQIDNO:106，当该系列基因座之一是D3S1358时；SEQIDNO:70，SEQIDNO:71和SEQIDNO:107，当该系列基因座之一是HUMFIBRA时；SEQIDNO:74，SEQIDNO:75和SEQIDNO:104，当该系列基因座之一是D8S1179时；SEQIDNO:86，SEQIDNO:87和SEQIDNO:105，当该系列基因座之一是Amelogenin时；SEQIDNO:88，SEQIDNO:89和SEQIDNO:94，当该系列基因座之一是G475时；SEQIDNO:90，SEQIDNO:91，SEQIDNO:92，SEQIDNO:93，SEQIDNO:95和SEQIDNO:96，当该系列基因座之一是S159时；和SEQIDNO:99和SEQIDNO:100，当该系列基因座之一是C221时。9、权利要求1的方法，其中扩增的等位基因在步骤(c)的评价之前分离，使用的分离方式选自聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管凝胶电泳。10、权利要求1的方法，其中多重扩增反应是用位于分析的基因座两侧的寡核苷酸引物对进行的。11、权利要求10的方法，其中该系列基因座是用聚合酶链反应共扩增的。12、权利要求10的方法，其中每个在多重反应中的共扩增的基因座是用位于该基因座两侧的一对引物共扩增的，其中每对引物的至少一个引物具有共价附着的荧光标记。13、权利要求12的方法，其中标记的引物中的至少3个引物具有共价附着的不同荧光标记。14、权利要求l的方法，其中所述至少一个待分析的DNA样品制备自人组织，其中人组织选自血液、精液、阴道细胞、毛发、唾液、尿液、含有胎盘细胞或胎儿细胞的羊水、及上述组织的任何混合物。15、权利要求1的方法，其中扩增的等位基因是通过将其与大小标准物对比而评价的，其中大小标准物选自DNA标记和基因座特异性等位基因梯。16、权利要求1的方法，其中多重扩增反应是用针对该系列基因座中的每一个基因座的至少一个寡核苷酸引物对进行的，其中至少一个引物具有选自以下每一组引物序列的序列SEQIDNO:62，SEQIDNO:63，SEQIDNO:101和SEQIDNO:102，当该系列基因座之一是D18S51时；SEQIDNO:64和SEQIDNO:65，用于基因座D21S11;SEQIDNO:68，SEQIDNO:69和SEQIDNO:106，用于基因座D3S1358;SEQIDNO:70，SEQIDNO:71和SEQIDNO:107，用于基因座HUMFIBRA;SEQIDNO:74，SEQIDNO:75和SEQIDNO:104，用于基因座D8S1179;SEQIDNO:39，SEQIDNO:40，SEQIDNO:59，SEQIDNO:60和SEQIDNO:76，用于基因座HUMvWFA31;SEQIDNO:33，SEQIDNO:34，SEQIDNO:77，SEQIDNO:78和SEQIDNO:98，用于基因座HUMCSF1PO;SEQIDNO:29，SEQIDNO:30，SEQIDNO:58，SEQIDNO:79和SEQIDNO:97，用于基因座D16S539;SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:80和SEQIDNO:81，用于基因座D7S820;SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:82和SEQIDNO:83，用于基因座D13S317;和SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:84和SEQIDNO:85，用于基因座D5S818。17、权利要求1的方法，其中该系列基因座还包括选自G475，S159，C221和Amelogenin的至少一个额外的基因座。18、权利要求17的方法，其中多重扩增反应是用具有选自至少以下一组序列的至少一个引物序列的至少一个寡核苷酸引物对进行的SEQIDNO:88，SEQIDNO:89和SEQIDNO:94，当该系列基因座之一是G475时；SEQIDNO:卯，SEQIDNO:91，SEQIDNO:92，SEQIDNO:93，SEQIDNO:95和SEQIDNO:96，当该系列基因座之一是S159时；SEQIDNO:99和SEQIDNO:100，当该系列基因座之一是C221时；和SEQIDNO:86，SEQIDNO:87和SEQIDNO:105，当该系列基因座之一是Amelogenin基因座时。19、权利要求l的方法，其中多重扩增反应是聚合酶链反应。20、权利要求l的方法，其中待分析的至少一个DNA样品制备自人组织，其中人组织选自血液、精液、阴道细胞、毛发、唾液、尿液、骨、颊样品、含有胎盘细胞或胎儿细胞的羊水、及上述组织的任何混合物。21、一种同时分析基因组DNA的一系列基因座的试剂盒，包括用于共扩增待分析的基因组DNA的一系列基因座的寡核苷酸引物，其中该系列基因座包含以下能被共扩增的短串联重复基因座D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、HUMCSF1P0、HUMFIBRA和HUMvWFA31，且其中引物包含在一或多个容器内。22、权利要求21的试剂盒，其中试剂盒中所有的寡核苷酸引物均包含在一个容器内。23、权利要求21的试剂盒，其中基因组DNA是人基因组DNA。24、权利要求21的试剂盒，其中用于共扩增该系列基因座中的一个基因座的引物对的至少一个引物具有选自以下一组的序列SEQIDNO:62，SEQIDNO:63，SEQIDNO:IOI和SEQIDNO:102,用于基因座D18S51;SEQIDNO:64和SEQIDNO:65，用于基因座D21S11;SEQIDNO:68，SEQIDNO:69和SEQIDNO:106，用于基因座D3S1358;SEQIDNO:70，SEQIDNO:71和SEQIDNO:107，用于基因座HUMFIBRA;SEQIDNO:74，SEQIDNO:75和SEQIDNO:104，用于基因座D8S1179;SEQIDNO:76和SEQIDNO:40，用于基因座HUMvWFA31;SEQIDNO:77，SEQIDNO:78和SEQIDNO:98，用于基因座HUMCSF1PO;SEQIDNO:29,SEQIDNO:79和SEQIDNO:97，用于基因座D16S539;SEQIDNO:80和SEQIDNO:81，用于基因座D7S820;SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:82和SEQIDNO:83，用于基因座D13S317;和SEQIDNO:84和SEQIDNO:85，用于基因座D5S818。25、权利要求21的试剂盒，还包括用于至少一个多重扩增反应的试剂。26、权利要求21的试剂盒，还包括具有等位基因梯的容器。27、权利要求26的试剂盒，其中等位基因梯每一横栏和用于该系列每个基因座的至少一个寡核苷酸引物具有共价附着的荧光标记，且这些寡核苷酸引物的至少2个具有与容器中的其它引物不同的共价附着的荧光标记。全文摘要本发明公开了用于在一个单一多重反应中同时扩增基因组DNA的至少11个基因座的方法和材料，还公开了用于分析这种反应的产物的方法和材料。本发明包括用于同时扩增至少11个短串联重复基因座的材料和方法，包括用于分析11个这种基因座的特异材料和方法，这11个被美国联邦调查局特殊选定为组合式DNA指数系统(CODIS)数据库所用的核心基因座的基因座形成了基因座的亚群。文档编号G01N33/53GK101230394SQ20071019952公开日2008年7月30日申请日期1999年11月24日优先权日1998年11月25日发明者詹姆斯·W·舒姆,辛西娅·J·斯普雷彻申请人:普罗梅加公司