专利名称：钾(离子)诊断/测定试剂盒及钾(离子)的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种钾(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾(离 子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
肾小球疾病、肾功能衰弱、糖尿病酮症中毒、肾上腺皮质功能减退等。当血
钾高达7.5皿ol/L或以上时病人将出现心律失常，应考虑确定适当的治疗方案。 血清钾超过10 mmol/L时，即可发生心室纤颤，心脏停搏而死亡。高钾使心脏 停跳于舒张期。
目前钾测定常用的方法有同位素稀释质谱法、中子活化法、火焰光度计法、 化学测定法、离子选择电极法、原子分光光度法、酶动力学法。
火焰光度法1950年开始使用并一直沿用至今的火焰光度法检测血清、尿 液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+，是一种发射光谱分析法。测定方法分为内标准 法和外标准法两种。外标准法操作误差较大， 一般不采用。现在主要使用内部 标准法，即标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素锂或铯进行测定。 操作时，将含锂的溶液作为稀释液，同时测定K、 Na和Li的浓度，以标本与标 准液的Na/Li与K/Li比值，计算Na、 K浓度。由于血清稀释倍数大，血清蛋白 质粘性的影响几乎可忽略不计。
化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为冠醚，均 为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有未共用电子 对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离子，从 而可达到测出离子浓度的目的。测定血清K， 一般采用普通冠醚阴离子染料进行比色定量。
离子选择电极法ISE法是采用灵敏的特定专用电极，在专用仪器上进行血 清和尿等体液的K+、 Na+的测定，因标本用量少，快速准确，几乎有取代其他方 法的趋势。其仪器测定原理是离子选择电极与参比电极组合浸泡在待测标本溶 液中，进行检测。目前已有的电极种类为①玻璃膜电极，感应材料为玻璃薄 膜的有PH电极、K+电极和Na+电极；②固相膜电极，由难溶性金属物质加压成
型，以固体膜或单日膜作为感应膜的电极有cr电极和r电极；③液态膜电极，
将环氧树脂或内装聚氯乙稀为感应膜的Ca"电极；④用缬氨霉素膜制成的K+电 极。上述电极均有一定的寿命，因为电极使用一段时间就会自动老化，有效期
长短不一。
原子分光光度法原子分光光度法可用于检测血清K+、 Na+，操作繁杂，误 差较大，不及火焰光度法简便。
钾测定的决定性方法是同位素稀释质谱法及中子活化法。WHO推荐的方法是 火焰光度计法。目前离子选择电极法应用较为普遍，但是电极成本昂贵。
酶测定法和火焰光度计法或离子选择电极法均有较好的一致性，且抗干扰性 强，稳定性好，弥补了生化分析仪不能同时测定钾钠的不足。有较好的分析性 能，易于自动化，在临床化学分析中必定取代火焰光度计法成为常规分析项目。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生 成吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致在400 一700nm波长处吸光度的上升，得以测定钾(离子)浓度的方法，同时，本发 明还将给出用以实现该方法的钾(离子)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可 以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行钾(离子)浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明钾(离子)浓度测定方法原理如下
腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶/1^ 腺苷三磷酸+
丙酮酸
丙酮酸+辅酶八+氧丙酮酸氧化酶过氧化氢+ 二氧化碳+
乙酰辅酶A
过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或
醌亚胺色原+水
这种方法应用需要钾离子激活的丙酮酸激酶(pyruvic kinase; EC2.7丄40) 酶(偶)联丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)及过氧化物酶
(peroxidase ; EC 1.11丄7)酶促反应终点比色法。在钾(离子)的激活下， 丙酮酸激酶酶解磷酸烯醇式丙酮酸反应产生丙酮酸，再通过(偶)联合丙酮酸 氧化酶的作用，最后生成的过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将无色的还原型 色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400—700nm (根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料一吲嗒胺色原 (Indaminedye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye) —含量高低的光吸收大小； 通过测量400—700nm (根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的速 度，得出钾(离子)浓度大小测定结果。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下 成分关系的本发明钾(离子)诊断/测定试剂盒较为理想
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
过氧化物酶 30000 U/L
丙酮酸激酶 10000 U/L丙酮酸氧化酶 12000 U/L
腺苷二磷酸 3 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸 3 mmol/L
辅酶A 2 mmol/L
还原型色原体组合 0. 2_20 mmol/L
所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配对
组合
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸
3-甲基_2_苯噻唑酮腙
N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2.4- 双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3.5- 双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 齊基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3- 甲基-乙基-羥基苯胺
4- 氨基抗砒 石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒 N,N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2.4- 双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3.5- 双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒 双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗石比
2,2'-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
木发明的钾(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮 酸、辅酶A、过氧化物酶、还原型色原体组合。试剂盒可以是干粉状态，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、
辅酶A。 试剂2
缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、丙酮酸激酶、丙酮 酸氧化酶。
过氧化物酶、还原型色原体组合、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、腺苷二磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以 是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、 辅酶A。 试剂2
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶。过氧化物酶、还原型色原体组合、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、腺苷二磷酸、
磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试 剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直
接使用。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液画mmol/L
稳定剂500 mmol/L
丙酮酸激酶10000U/L
丙酮酸氧化酶12000 U/L
过氧化物酶30000 U/L
腺苷二磷酸3 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸3 mmol/L
辅酶A2 mmol/L
4-氨基抗砒2 mmol/L
石碳酸10 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C,反应时间10分钟，测试主波长 505nm，测试副波长600nm，被测钾(离子)样品与试剂的体积比例为1/25， 反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约2分钟左右， 检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，
检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大小。
实施例二
本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂l
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂
腺苷二磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸
辅酶A
2，4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
10Ommol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L 2 mmol/L 0.2 mmol/L
试剂2
100mmol/L 500 mmol/L 10000 U/L 12000 U/L 30000 U/L 0.6 mmol/L
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂 丙酮酸激酶 丙酮酸氧化酶 过氧化物酶 4-氨基抗砒
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，测试主波长 546nm，测试副波长600nm,被测钾(离子)样品与试剂的体积比例为1/20， 反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约2分钟左右， 检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，
13检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大小。 实施例三
本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂 腺苷二磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸
辅酶A
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂
丙酮酸氧化酶 过氧化物酶 双甲基苯胺
謹mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L 2 mmol/L 0.6 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 12000U/L 30000 U/L 2 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 10000 U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 丙酮酸激酶
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，测试主波长 578nm，测试副波长660nm，被测钾(离子)样品与试剂的体积比例为1/30， 反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约2分钟左右，
14检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，
检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体 组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器 得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.05;吸光度时间 反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达10 mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过土 5%;试剂测试的精密度 (重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.024 ± 0.012 AA/ mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
1权利要求
1. 一种酶比色法及酶联法技术的钾(离子)浓度测定方法，其方法原理如下腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸 <u>丙酮酸激酶/K</u><u>+</u> 腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+辅酶A+氧 <u>丙酮酸氧化酶</u> 过氧化氢+二氧化碳+ 乙酰辅酶A过氧化氢+还原型色原体组合 <u>过氧化物酶</u> 吲嗒胺色原或 醌亚胺色原+水将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400—700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度，得出钾(离子)浓度大小测定结果。
2. —种钾(离子)诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L稳定剂 1——-4000 mmol/L过氧化物酶 500———訓OO U/L丙酮酸激酶 IOOO-——80000 U/L丙酮酸氧化酶 1000———80000 U/L腺苷二磷酸 1—50 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸 1—50 mmol/L辅酶A 1—50 mmol/L还原型色原体组合 O.l-20 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范 围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、过氧化物酶、还原型色原体组合组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、过氧化物酶、还原型色原体组合组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成。过氧化物酶、还原型色原体组合、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、过氧化物酶、还原型色原体组合组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶组成。过氧化物酶、还原型色原体组合丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂i_4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycero1)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
7.根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个配对组合，但不仅限于这28<formula>formula see original document page 0</formula>4-氨基抗砒石碳酸4-氨基抗砒N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒N,N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 .4- 双氯石碳酸4-氨基抗砒 ,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒 .5- 双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺4-氨基抗砒2,2'-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒3-甲基-乙基-羥基苯胺。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的钾(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、辅酶A、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出钾(离子)浓度的大小。
文档编号G01N21/31GK101464407SQ200710192200
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司