专利名称：一种色谱指纹图谱峰纯度的检验方法
技术领域：
本发明属于色谱峰纯度的检验方法，特别属于一种中药色谱指纹图谱峰纯 度的检验方法，尤其属于用自身正交投影法进行中药色谱指纹图谱峰纯度检验 的方法。
背景技术：
准确识别色谱峰的纯度是色谱的定性和定量分析的前提。由于中药的化学 成分多为次生代谢产物，彼此间的化学结构差别很小、理化性质近似，其色谱 峰在色谱指纹图谱上不可避免有重叠，准确判别色谱峰纯度更显重要。鉴别色 谱指纹图谱色谱峰的纯度、确认色谱峰，不仅增加指纹图谱的信息量，而且有 助于对中药的深入研究。色谱峰纯度的定性可归结为仪器方法和化学计量学方 法，其中后一方法又是前一方法的基础。现报道的化学计量学方法有①巻积-奇异值渐进图法(沈卫阳，MM.巻积一奇异值渐进图法在色谱峰纯度鉴别中
的应用，计算机与应用化学，2002, 19(3): 283-284.);②二维巻积法(沈卫阳， 胡育筑.二维巻积及其在色谱峰纯度鉴定中的应用.高等学校化学学 报，2003, 23 (3):388-390.);③导数色谱法(吉宁，高国强，陈玉奠.导数色谱 法鉴定高效液相色谱峰纯度.中国药科大学学报，1 991,22(5): 295-298.); ④主成分分析法(Prtnclpal component annlysis，简称PCA)(黄芳，康继宏，郁 建，等.色谱峰纯度的定性方法.色谱，1995,13(1): 33-37.);⑤渐进因子分析法 (Evolving factor analysis, 简称EFA) ( Lorber A. Error propagation and figures of merit for quantification by solving matrix equations. Anal Chem， 1988， 58,1167-1168.)。
3以上方法均没能充分利用联用色谱仪器在色谱分离过程中所记录的各流出 组分的波谱信息。 发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种只需对色谱峰进行自身的正交投影 分析即可验证峰自身的纯度并使之程序化，无需其它对照品或参考物质的色谱 峰纯度检验方法。本发明解决技术问题的技术方案为 一种色谱指纹图谱峰纯度的检验方法，包括含DAD检测器的高效液相色谱仪对物质进行检测，存储程序的数字计算机，该存储程序的数字计算机执行如下步骤a) 在图谱的全部信息中提取待识别的色谱峰，并扣除噪音信号；b) 在扣除噪音信号的待识别色谱峰中设置标准窗口，移动窗口获取光谱数 据，作为标准光谱，并以其建立正交投影阵，再用待识别色谱峰沿色谱方向的 每一光谱矢量对正交投影阵进行投影、扣除所取窗口处的光谱数据，得残余光;並 l曰Sc) 计算待识别色谱峰与残余光谱的夹角，判断夹角余弦是否小于噪音信号，若夹角余弦小于噪音信号，则待识别色谱峰为纯峰；若夹角余弦大于噪音信号， 则待识别色谱峰为混合峰。 所述的噪音信号为0.05。述的色谱指纹图谱峰纯度的检验方法在大决明子指纹图谱中的应用。 所述的色谱指纹图谱峰纯度的检验方法在温郁金挥发油指纹图谱中的应用。本发明的基本原理为设X为采用联用色谱测得的色谱指纹图谱的# X #阶二维数据矩阵，它们的行方向表征了色谱的流出信息(M个流出时间点)，列方向表征了光谱信息(N个吸收波长)。用j;表示i中的待鉴别的目标组分 色谱峰的# x "阶二维数据矩阵，考虑到仪器的背景，可把矩阵z分成两个 部分，即Ja =《+ Jc (1)J。表示来自目标组分的主要信息，而《则表示来自仪器的背景。在目标色谱峰前后的零浓度区内分别各选取一点s (目标色谱峰前)与e (目标色谱峰后)，以此两点的光谱矢量及和及及对照组分的光谱失量及，组成光谱矩阵 爿。」=[A,及，及] (2) w为移动窗口大小，首先在A中自s处起至e处止移动窗口 w获取光 谱数据，作为标准光谱。标准光谱每取一个窗口，以其建立正交投影阵-# = / — (3) 其中，/为单位矩阵，,为力的广义逆阵。用待鉴别色谱峰A的沿色谱 方向的每一光谱矢量义。,对#进行投影运算(扣除所取窗口处的光谱数据)jstc/= # jtc_/ (4) z。,表示Z。的第J条光谱，足/表示a,投影后的残余光谱。为消除不等性 噪声的影响，令投影后所得的残余光谱a/与投影前的原始光谱a,的夹角余弦为r,，即x y = x c: <《i卜:ii i卜s ii) (5)并以A作为鉴别色谱峰纯度的判据。由于#扣除了^,与」相关的光谱信息，a/保留了^与」不相关的光谱信息，所以A值越小，即投影后的残余光谱与投影前的原始光谱a,的夹角越大，说明^/保留;^的光谱信息越少，^与j相关性越大；反之2v值大，说明A/保留^的光谱信息越多，7。,与j的光谱相关性越小。当巧值等于0时，7。/与4完全正交，#完全扣除了^与J相关的光谱信息，完全只剩下随机噪声。以投影矩阵#对指纹图谱z中的目标色谱峰x。的每一列 光谱进行投影，可得沿色谱方向的光谱残差夹角余弦曲线，若该曲线目标色谱 峰时间范围的A值为零或接近于零，则说明它所对应的目标色谱峰为一与对照 组分相同的单一物质峰，否则，目标色谱峰为一重叠峰。由于各种物质成分的复杂性及色谱的流出时间较长，在色谱指纹图谱的测 定中不可避免地存在着仪器的背景，因此要进行二维数据的背景扣除，以免对 色谱峰纯度产生误判。本发明利用正交投影法，通过目标色谱峰(待纯度鉴别的色谱峰)的二维数 据，以移动窗口取光谱数据，作为标准光谱，并以其建立正交投影阵见再用目 标色谱峰的沿色谱方向的每一光谱矢量对 行投影、运算(扣除所取窗口处的 光谱数据)得残余光谱，再以残余光谱与投影前的原始光谱的夹角余弦为鉴别 指标来评价色谱峰的纯度，可以方便快捷地验证自身峰纯度，由于采用了正交 投影法，本发明不需要标准品或对照品就可直接判断色谱峰的纯度，处理快速、 简便，程序化。
图l为本发明的流程图。图2为大决明子生品的HPLC指纹图谱。图3为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚标准品溶液的 HPLC指纹图谱。图4为大黄酚15的残余光谱与原始光谱夹角余弦共有模式图。图5为供试品溶液1号色谱峰的残余光谱与原始光谱夹角余弦共有模式图。图6为温郁金挥发油的HPLC指纹图谱。 图7为吉马酮标准品的HPLC图谱。图8为67号峰吉马酮残余光谱与原始光谱夹角余弦模式图 图9为61号未知成分色谱峰的残余光谱与原始光谱夹角余弦模式图。 图10为64号未知成分色谱峰的残余光谱与原始光谱夹角余弦模式图。 图11为65号未知成分色谱峰的残余光谱与原始光谱夹角余弦模式图。 在图l一ll中，1一16为大决明子待测纯度的色谱峰，21为芦荟大黄素，22为大黄酸，23为大黄素，24为大黄酚，25为大黄素甲醚。61—69为温郁金挥发油待测纯度的色谱峰。
具体实施方式
如图1所示，步骤101为采用含DAD检测器的高效液相色谱仪对物质进行图 谱分析，禾U用MATLAB语言进行处理，得到图谱的全部信息，所述的信息包括 相应峰的峰面积，峰高、保留时间。步骤102为在指纹图谱的全部信息中提取待识别的色谱峰。步骤103为将在待提取识别的色谱峰中扣除噪音信号得到没有仪器干扰的 待识别色谱峰；所述的噪音信号不大于0.05。步骤104为在扣除噪音信号的色谱峰中设置标准窗口，移动标准窗口建立 正投影矩阵。步骤105为将待识别色谱峰对正投影矩阵进行投影。步骤106为将步骤105的投影结果扣除所取窗口处的光谱数据得到残余光谱。步骤107:计算待识别色谱峰与残余光谱的夹角。步骤108:判断夹角余弦是否小于噪音信号，若夹角余弦小于噪音信号，则为步骤110，待识别色谱峰为纯峰；若夹角余弦大于噪音信号，则为步骤109， 待识别色谱峰不为纯峰。将本发明用于鉴别决明子色谱指纹图谱峰纯度。1仪器与试剂Agilent 1100高效液相色谱仪(包括AgilentllOO四元泵，Agilent 1100 二极管阵列检测器，Agilent 1100色谱化学工作站)；决明子生品药材购自佳木 斯市药材公司，产于安徽。经佳木斯大学生药学教研室刘娟教授鉴定为决明 (Casw'a o&"w'/bh'a L.)的种子，符合《中华人民共和国药典》2005版规 定。芦荟大黄素对照品(批号766-200210)、大黄素对照品(批号756-200110)、 大黄酸对照品(批号:774-200311)、大黄酚对照品(批号796-200204)、大黄 素甲醚对照品(批号758-2004080)均购自中国药品生物制品检定所。乙腈、甲 醇为色谱纯，盐酸、磷酸及氯仿为分析纯。2样品制备2.1对照品溶液称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲 醚对照品适量，以甲醇为溶剂，配制成200 ug，mL—i的芦荟大黄素、大黄酸、 大黄素、大黄酚和大黄素甲醚五种成分的混合对照品溶液。2.2供试品溶液取决明子样品，粉碎，过80目筛，称取2.0g,加1.5 mol ，L—'的盐酸溶液30mL，加热回流1. 5 h，放冷，加氯仿25mL，回流20 min, 取出，分取氯仿层，酸水层再加氯仿25 mL,回流20 min，分取氯仿层，同上 法操作，加氯仿再回流提取二次，合并四次氯仿提取液，加水20mL振摇洗脱， 弃去水层，将氯仿液蒸干，残渣加甲醇15mL使溶解，过滤，定量转移至25mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.45 ym微孔滤膜过滤，即得。3色谱条件色谱柱Zorbax Eclipse XDB - C18 ( 4. 6 mm X 250 mm，5um )，保护柱: Zorbax SB - ds柱(4. 6 mm X 12. 5 mm， 5 u m );流动相乙腈(A) - 0. 1 %磷 酸水溶液(B)作梯度洗脱，0 min， 10 % A - 90 。/。 B; 5 min， 15 % A - 85 % B; 10 min， 40 % A - 60 % B; 40 min， 70 % A - 30 % B; 41 min后IOO % A。流 速1.0mL*min—N柱温室温；检测波长278 nm，参比波长550 nm;光谱 数据记录范围220 500 nm，波长间隔2 nm;色谱记录时间0 50 min;进样量 10 ii L。4目标峰确定取决明子供试品溶液按选定色谱条件测定，记录其色谱图，结果见图2。另 取取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品混合溶液同法 测定，结果见图3。比较对照品与决明子图谱，并利用色谱工作站峰判定功能， 初步确定图2中的12、 15、 16号峰分别为大黄素、大黄酚、大黄素甲醚目标峰。在供试品溶液色谱12、 15、 16号峰前后的零组分区采集色谱光谱二维数据， 以所取窗口为标准光谱，以其建立正交投影阵抓用待鉴别色谱峰的沿色谱方向 的每一光谱矢量Aj对#进行投影运算(扣除所取窗口处的光谱数据)，计算待 鉴别色谱峰的光谱正交投影前后光谱矢量的夹角余弦。由计算结果可知图2中 的12、 15、 16号峰分别为大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的色谱纯峰。如第15 号大黄酚的残余光谱与原始光谱夹角余弦共有模式图如图4。同理，可确定其它各未知成分色谱峰的纯度，如供试品溶液色谱峰1号为 未知成分峰，其残余光谱与原始光谱夹角余弦共有模式图如图5，由此，可确定 1号峰为一不纯峰。用本发明鉴别温郁金挥发油色谱指纹图谱峰纯度。1仪器与试剂Agilent 1100高效液相色谱仪(包括Agilent1100四元泵，Agilent 1100 二极管阵列检测器，Agilent 1100色谱化学工作站)；温郁金购于北京兴中中药 饮片厂，产地浙江，经佳木斯大学生药教研室史权教授鉴定，符合中国药典(2005 版) 一部项下的规定。吉马酮对照品(批号111665-200401)购自中国药品生物 制品检定所。甲醇为色谱纯，无水硫酸钠、磷酸为分析纯。2供试品制备2.1挥发油制备取经粉碎过30目筛的温郁金粗粉100g，置2000 mL圆 底烧瓶中，加8倍量的水浸泡过夜，按中国药典(2005版) 一部附录X D中挥 发油测定的甲法，水蒸气蒸馏提取8h。收集挥发油部分，加入无水硫酸钠脱水 后，密封、暗处冷藏。2.2供试液制备取温郁金挥发油20 yL,置10mL量瓶中，加入甲醇至 刻度，摇匀。经0.45 ym微孔滤膜过滤，制成温郁金挥发油的供试液。取吉马 酮对照品约10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀， 经0.45 um微孔滤膜过滤，吸取滤液l mL置lO mL容量瓶中，加入甲醇至刻 度，配制吉马酮对照品溶液。3色谱条件色谱柱ZorbaxEclipseXDB-C18(4.6咖X250咖，5践)，保护柱:Zorbax SB-d8柱(4.6mmX12. 5mm， 5um);流动相甲醇(A) - 0. 2 %磷酸水溶液(B) 作梯度洗脱，0 min, 55 % A - 45 % B; 5 min， 55 % A - 45 % B; 25 min， 75 % A - 25 % B; 40 min, 75 % A - 25 % B; 50 min， 100 % A。流速1. 0 ml min _1;柱温室温；检测波长210 nm;光谱数据记录范围190 350 nm，波长间 隔2 nm;色谱记录时间0 50 min;进样体积20 u L。4目标峰确定取温郁金挥发油供试液按选定色谱条件测定，记录其色谱图，结果见图6。 另取吉马酮对照品同法测定，结果见图7。经渐进窗口正交投影进行色谱指纹图 谱峰的匹配，可知图6中第67号色谱峰为吉马酮。5色谱峰纯度鉴别在温郁金挥发油指纹图谱第67号色谱峰前后的零组分区采集色谱光谱二维 数据，以所取窗口为标准光谱，以其建立正交投影阵必用目标色谱峰的沿色谱 方向的每一光谱矢量;^对#进行投影运算(扣除所取窗口处的光谱数据)，并 计算目标色谱峰的光谱正交投影前后光谱矢量的夹角余弦。由计算结果可知图6 中的67号峰为吉马酮的色谱纯峰，其残余光谱与原始光谱夹角余弦模式图如图 8所示。同理，可确定其它各未知成分色谱峰的纯度，如供试液色谱指纹图谱中 的第61、 64、 65号未知成分色谱峰的残余光谱与原始光谱夹角余弦模式图，如 图9、图10、图11所示，由此，可确定61号峰为一纯峰，64、 65号色谱峰各 为一混合峰。
权利要求
1、一种色谱指纹图谱峰纯度的检验方法，包括含DAD检测器的高效液相色谱仪对物质进行检测，将检测结果输入存储程序的数字计算机，其特征在于该存储程序的数字计算机执行如下步骤a)在图谱的全部信息中提取待识别的色谱峰，并扣除噪音信号；b)在扣除噪音信号的待识别色谱峰中设置标准窗口，移动窗口获取光谱数据，作为标准光谱，并以其建立正交投影阵，再用待识别色谱峰沿色谱方向的每一光谱矢量对正交投影阵进行投影、扣除所取窗口处的光谱数据，得残余光谱；c)计算待识别色谱峰与残余光谱的夹角，判断夹角余弦是否小于噪音信号，若夹角余弦小于噪音信号，则待识别色谱峰为纯峰；若夹角余弦大于噪音信号，则待识别色谱峰为混合峰。
2、 根据权利要求l所述的一种色谱指纹图谱峰纯度的检验方法，其特征在 于所述的噪音信号为0.05。
3、 一种权利要求l所述的色谱指纹图谱峰纯度的检验方法在大决明子指纹 图谱中的应用。
4、 一种权利要求1所述的色谱指纹图谱峰纯度的检验方法在温郁金挥发油 指纹图谱中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种色谱指纹图谱峰纯度的检验方法，包括以下步骤采用含DAD检测器的高效液相色谱仪对中药进行指纹图谱处理，得到指纹图谱的全部信息；在色谱图中提取待识别的色谱峰；在待提取识别的色谱峰中扣除噪音信号；设置标准窗口；移动窗口建立正投影矩阵；将待识别色谱峰对正投影矩阵进行投影，得到残余光谱；计算待识别色谱峰与残余光谱的夹角；判断夹角余弦是否小于噪音信号；若夹角余弦小于噪音信号，则待识别色谱峰为纯峰；若夹角余弦大于噪音信号，则待识别色谱峰为混合峰。本发明与现有技术相比，不需要标准品或对照品就可直接判断色谱峰的纯度，处理快速、简便，程序化。
文档编号G01N30/86GK101256175SQ20071019008
公开日2008年9月3日 申请日期2007年11月21日 优先权日2007年11月21日
发明者邹纯才, 鄢海燕 申请人:皖南医学院