丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒及检测方法

专利名称：：丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒及检测方法
技术领域：
：本发明属于丙型肝炎检测
技术领域：
。更具体涉及一种与丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒，同时，本发明还涉及一种丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒检测丙型肝炎病毒的方法，以及多肽和包括生物素等标记的多肽在作为检测丙型肝炎病毒表面包膜抗原夹心法试剂盒中的应用，可广泛应用于医学等相关领域。
背景技术：
：丙型病毒性肝炎(简称丙型肝炎)是由丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus,HCV)引起的肝脏炎症性疾病。HCV感染呈全球性分布，主要通过血液传播。据世界卫生组织统计，全球HCV感染率约为3%，估计有l.7亿人感染HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万。我国血清流行病学调查资料显示，一般人群抗HCV阳性率为3.2%,各地区感染率有一定差异。急性HCV感染者约80o/。发展为慢性丙型肝炎(CHC)，在20年间约20%可发展为肝硬化，每年约有1%4%肝硬化患者发展为肝癌。CHC已成为不可忽视的重要疾病，及早发现和治疗CHC患者已受到重视。CHC治疗目的包括根除或长期抑制病毒复制，减轻肝内炎症和纤维化，最终阻止进展为肝硬化、肝癌和肝功能衰竭，并提高患者的生活质量。HCV病毒颗粒直径3060nm，含类脂外膜，属于黄病毒科，是一种单股正链RNA病毒，全长约9500bp，HCV整个基因组只有一个可读框(ORF)，位于基因组中央。在基因组的5'和3'末端各有一段非编码序列。5'末端有一个长度和序列非常稳定的非编码区(URT)，可以说是整个基因组最为保守的区域，长度是341个核苷酸。3'末端非编码区由三部分组成，从编码病毒前体蛋白的可读框的第一个终止密码之后是3040个核苷酸的非编码变异序列，然后是polyU(或polyA)结构，最后面有98个核苷酸的高保守序列。中间是几乎跨越了整个基因组的大的ORF，由9033个核苷酸组成，能编码约30103033aa的病毒前体多聚肽，经过蛋白酶切割修饰后，前体多肽产生2种结构蛋白，即核心蛋白(C区)和膜蛋白(E区)，5种非结构区蛋白NS!、NS2、NS3、NS4和NSs。HCV的复制是利用RNA指导的RNA多聚酶，又称RDRP，并无阅读保护酶来修正复制中的错误，因而HCV的变异较大，尤其在结构基因的E区的3'末端和非结构基因的NS1区的5'末端之间是一个高度可变区，在结构基因的C区和非结构基因的NS3、NS4和NSs区则保守性较高。目前，临床上检测HCV感染的方法大致包括(1)ELISA法检测抗-HCV抗体，包括重组免疫印迹(RIBA);(2)PCR检测HCV的RNA，包括荧光PCR、免疫PCR法(PCR-ELISA)、及用于定量的bDNA和NASBA技术；(3)基因型芯片检测技术。酶联免疫吸附法检测抗HCV的特异性好，灵敏度高，操作简便，目前已成为采供血机构检测抗-HCV的常规方法。然而抗-HCV样本的浓度介于试剂盒临界范围时，由于受到各种不确定因素如试剂盒的敏感度、操作人员技术熟练程度及其责任心、实验室温度、加样器等影响，很可能造成假阳性或假阴性的结果。文献曾报道用ELISA法检测抗-HCV灰带区血样经重复检测有12.6%(11/87)的假阴性率。对落在灰区范围内的随机抽样样本进行的PCR检测中，HCVRNA的阳性率为18%(3/17)，表明灰区内样本确实存在着病毒复制。如果没有设置灰区，一年之内就可能有5份抗-HCV阳性的样本输入到无辜的患者体内。为提高抗-HCV的检出率，最大限度地防止漏检，提高输血的安全性，笔者认为灰区的设置有着重要的意义。至于灰区的范围应该多大才合适，还须做进一步的研究。对于落在灰区内的样本应进行重复检验。有条件的单位应予行PCR检测，以提高检验的准确性。PCR检测HCV的RNA，特别是支链DNA(bDNA)技术的最大特点是不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，不利因素少，因此稳定性、重复性高，用于HCVRNA的动态水平研究结果准确。但bDNA技术的局限性也显而易见，即放大倍数少、敏感性低、检测范围窄、不适用于HCVRNA的低水平检测。基因芯片技术适用于研究HCV的流行病学、变异趋势、传播途径，对丙型肝炎患者判断病情、指导治疗、预测疗效及预后有重要意义，但其成本高，易出现假阳性。由于现有的临床检测HCV感染的方法的各种局限性，临床工作者迫切希望出现一种新型的临床检测HCV的方法，该方法应具有特异性高，成本低廉，操作简便，诊断迅速的特点。
发明内容本发明的目的是在于提供一种丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒，能快速、灵敏、准确的检测丙型肝炎病毒。本发明另一个目的是在于提供了一种丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒的检测方法，该方法特异性高，成本低廉，检测速度快，操作方便，省时效率高。本发明的丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒在快速检测HCV感染中可广泛应用。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施一种丙型肝炎病毒表膜抗原夹心法试剂盒，它包括-a、酶标板(CdlStar咏购自武汉大风生物科技有限公司)；b、生物素标记的能与HCVE2蛋白特异性结合的12肽；c、多肽为SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示的序列；d、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；e、辣根过氧化物酶的底物；f、酶联免疫检测仪(购自南京华东电子集团医疗装备有限公司)；g、E2蛋白作为标准阳性孔。核糖体文库筛选技术是将编码随机肽的DNA文库在体外转录、翻译，转录产物mRNA由于缺乏终止子，不能从核糖体上释放，而与新生多肽、核糖体以共价键结合，形成mRNA—核糖体一蛋白质三聚体结构，此三聚体形式将蛋白和mRNA信息连接在一起，使基因型和表型得到统一。利用固相化抗原或受体的特异性的单克隆抗体亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的mRNA—核糖体一多肽复合物，通过降低Mg^浓度，核糖体解离，释放mRNA，回收核糖体富集库中的mRNA，逆转录成cDNA,PCR扩增，其产物可作为下一轮体外合成的模板，经过几轮筛选，能找到与抗体特异性结合的多肽。近年来，应用核糖体展示技术已进行了许多研究，如筛选配体或受体，筛选抗体或确定抗原表位，开发新的蛋白酶抑制物和新的药物。5一种与丙肝病毒包膜抗原高度特异结合的多肽具体制备步骤如下一、制备E2-GST融合蛋白的步骤如下A.挑取含有pGEX-KG-E2(见参考文献Li，etal.，EngineeringofiV-glycosylationofHepatitisCVirusEnvelopeProteinE2EnhancesTcellresponsesforDNAimmunization,2007.25:1544隱1551.)的大肠杆菌BL21DE3(购自美国invitrogen公司)接种于3ml含有氨节青霉素(5Q吗/ml)的LB培养基中，对照组别接种含有pGEX-KG(GST蛋白的原核表达载体，购自AmershamBiosciences公司)的大肠杆菌BL21DE3,37。C培养12~16小时。B.将小试管中的菌液分别转移到200ml含有氨苄青霉素(50pg/ml)的LB液体培养基(LB液体培养基为10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶解至1000ml双蒸水)中，37'C培养到OD600为12。C.加入100mM异丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1mM，3(TC诱导45小时。D.将诱导以后的菌液分装到250ml的离心管中，4t:,7700g,5min离心，弃上清。E.沉淀物用磷酸盐缓冲液PBS(140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾)洗涤1次，4°C，7700g,5min离心，弃上清。F.将沉淀重悬于8ml含1mM苯甲基磺酰氟(PMSF:17.42mgPMSF溶于lml异丙醇中，-20'C保存)的PBS中。G.将菌液放置冰中，超声碎菌，加入20。/。曲通X-100(TritonX-100:1mlTritonX-100溶于4ml无菌双蒸水中)，使其终浓度1%,4°C,轻混30分钟。H.每EP管中加入lml超声降解的菌液，4°C,12000g,10min离心，取上清。I.4°C,12000g,离心10min,再取上清。J.各EP管加入20pi琼脂糖凝胶4B(Sepharose4B:购自AmershamBiosciences公司，美国)，混匀，室温2025。C孵育30min。4。C，5000rpm,5min，离心，弃上清。K.每个EP管中各加入1000.01MPBS洗涤，离心洗涤后将含有Separose4B的悬浊液收集于一管，4'C,5000rpm,5min，离心，弃上清，共洗涤3次。L.加入与Sepharose4B等量的谷光苷肽洗脱缓冲液(GlutathioneElutionBuffer:0.0154g谷光苷肽溶解于0.25mlpH8.0的1M过滤除菌，分装，4'C保存)，室温2025。C轻轻混匀10min，4°C，5000rpm，5min，取上清。M.重复步骤L两次。收集的上清则为E2-GST融合蛋白。二、制备随机DNA文库的步骤如下A.寡核昔酸为3，-CCTCTATATAGGTACCGATCG(NNM)"AGGCCGGTAGTAGTAGTAGTAGTACTTMGGCCA-5'(卯bp)(划线部分分别为SD序列、启始密码子、HisTag、斜体部分为Saw/ZI酶切位点)(N代表A,C,T或G,M代表A或C)B.第一轮PCR的上游引物Ul为5'-GCTCGTATAATGTGTGGCCACAACGGA4GATATATCCATG-3'(43bp)(划线部分为5'端茎环和斜体部分为核糖体结合位点:RBS)，下游引物Dl为3'-GTAGTACCTQ-5'(52bp)(划线部分分别为5麵ffl酶切位点、Gly-Ser序列和3，端茎环)C.第二轮PCR的上游引物U2为5'-GCGCTGCAGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTG-3'(42bp)，(划线部分分别为尸M酶切位点和Tac启动子)。下游引物为Dl。随机ssDNA文库和引物由上海博亚生物有限公司合成。随机DNA文库的构建示意图见图1。D.以寡核普酸为模板，用引物U1和D1进行第一轮PCR，反应体系为10XTagDNAPolymerasebuffer(含Mg2+)5n1dNTPmix(10mM)引物Ul(20nM).1fil引物Dl(20pM)1.Hi寡核苷酸(0.05吗7(al).1^双蒸水40plTagDNA聚合酶1.pi总体积50|al反应程序a.95°C，2分钟b.95°C，36秒；63°C，36秒；72°C，84秒；共25个循环。c.72°C，5分钟E.PCR产物经2M的琼脂糖凝胶(0.4g琼脂糖粉末溶解于20mUXTAE溶液)电泳，然后用回收试剂盒(QIAEXIIgelExtractionKit,美国promega公司)回收。F.经步骤E回收所得的PCR产物作为模板，进行第二轮PCR扩增，反应体系为10XTagDNAPolymerasebuffer(含Mg2+)5pidNTPmix(10mM)J1^1引物Ul(20|aM)Jpl引物Dl(20nM)Jul第一轮PCR产物4^1双蒸水37^1TagDNA聚合酶总体积反应程序a.95°C，2分钟b.95°C，36秒；62°C，36秒；72°C，84秒；共25个循环。c.72°C，5分钟G.步骤F所得得PCR产物经2。/。的琼脂糖凝胶电泳，然后用回收试剂盒回收，回收所得片段即可用于体外转录翻译三、制备核糖体文库的步骤如下A.核糖体文库构建及筛选流程如图2所示:将编码1014个随机12肽的DNA库在体外进行偶联的转录/翻译，转录产物mRNA由于缺乏终止子，不能从核糖体上释放，从而形成一个稳定的mRNA-核糖体-新生多肽复合体结构。利用连接有Sepharose4B(sigma公司)的E2-GST融合蛋白(E2-GST-Sepha薦e4B)亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的mRNA—核糖体一多肽复合物，通过降低Mg^浓度，核糖体解离，释放mRNA,回收核糖体富集库中的mRNA，逆转录成cDNA.PCR扩增，其产物可作为下一轮体外合成的模板，经过六轮筛选，能找到与E2蛋白特异性结合的多肽。B.反应体系DNA模板(0.3mg/ml)10(^1S30PremixwithoutAminoAcids20|al氨基酸混合液(无甲硫氨酸)2.5pi氨基酸混合液(无亮氨酸)2.5|nlS30Extract,linear15(jl总体积50pi轻轻混匀EP管中各混合物，5000rpm，离心30秒，让混合物沉积于EP管底部。C.30'C孵育2.5小时。D.EP管冰上放置5分钟中止反应，EP管中物质即为核糖体展示文库。四、核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽的步骤如下A.在100pi体外转录翻译混合物中加入6单位的无RNA酶的DNase(Promega公司，美国)，10XDNaseI缓冲液(Promega公司，美国)637i:温育30min。然后加中止缓冲液，65°C，10min灭活DNase。B.取60piE2陽GST-Sepharose4B,4。C，5000rpm，5min离心，弃上清。C.沉淀用500^1洗脱缓冲液(washingbuffer:50mMpH7,5的Tris-醋酸，150mM氯化钠NaCl,0.1%Tween-20,50mM醋酸镁)洗涤3次。D.将100pi体外转录/翻译混合物加入到洗涤过的E2-GST-Sepharose4B中，4'C摇动1小时。E.4。C，5000rpm，5min离心，弃上清，沉淀用washingbuffer洗涤3次。F.沉淀中加入100pielutionbuffer,4。C摇动10min使mRNA与核糖体解离，4°C，5000rpm，5min离心，取上清。G.用RNaidKit(购自biol01公司，美国)回收mRNA，具体方法如下a.上清中加入3倍体积的RNABindingSalt(RNaidKit成份)混匀。b.再加入lp(alRNAMATRIX(RNaidKit成份)，室温放置5min。c.13000rpm，lmin离心，弃上清。d.用RNAwash(RNaidKit成份)洗涤2次，(RNAwash:乙醇-l:l)。e.加入lPpl无RNase的H20,4555。C温育5min。f.13000rpm，2min离心，取上清，上清即是RNA模板，可用于RT-PCR。H.RT-PCR,其反应体系为AMV/Tfl5XReactionbuffer10dNTPmix混合物1^引物U1(20mM)1引物D1(20mM)1|lUMgS04(25mM)2piAMVReverseTranscription1(JiTflDNAPolymerase1nlRNA模板1pi无酶水29^总体积50^反应程序为48°C，45分钟；94°C,2分钟；94°C，30秒；63°C，l分钟，72°C，2分钟；共31个循环；72°C，7分钟I.2%琼脂糖琼脂糖凝胶电泳。J.回收分子量大小为155bp的RTPCR产物。K.以回收产物为模板，再行第二轮PCR扩增，回收分子量大小为181bp的PCR产物。L.将回收的第二轮PCR产物连接至载体pUC19(购自美国Invitrogen公司)上，具体步骤为a.将PCR产物及载体pUC19酶切，反应体系为10XY十Buffer2jnl5awHI1(ji尸M1plddH2017(il总体积20(al37'C水浴2小时M.分别回收分子量大小为128bp的DNA片段以及分子量大小为2.668kb的pUC19目的片断，然后用回收试剂盒(QIAEXIIgelExtractionKit,美国promega公司)回收。a.用DNA连接酶将步骤b所的DNA和载体pUC19连接，反应体系为DNA4plpUC192pi10XBuffer2T4连接酶2pl双蒸水10m1总体积2016'C孵育20小时b.将步骤c所得的连接产物分别转化至大肠杆菌DH5a。取连接产物10|xl，加入100plDH5a感受肽细胞，冰浴30分钟，42°C90秒，再冰浴5分钟，加入800^1LB液体培养基(LB液体培养基为10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶解至1000ml双蒸水)，37'C,225rpm振摇4050分钟。取200|_d菌液均匀涂在有氨苄青霉素(Ampf)抗性的LB固体培养基(LB固体培养基为10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，15g琼脂粉溶解至1000ml双蒸水)上(氨苄青霉素浓度为50吗/ml)，37'C培养过夜。c.挑取单个克隆菌落，置于3mlLB液体培养基(含氨苄青霉50^g/ml)培养过夜。d.提取步骤e获得的菌液的质粒DNA。e.PCR鉴定步骤f所得的DNA，反应体系为:10XTaqDNApolymerasebuffer5(oldNTPmix混合物(10mM)1m1引物U2(20mM)1(il引物D1(20mM)1|ul质粒DNA1|_U双蒸水40piTaqDNAPolymerase1(xl总体积50^反应程序为95°C，2分钟；95°C，30秒；62°C，1分钟，72°C，l分钟24秒；共25个循环；72°C，5分钟f.将步骤g所得产物经SawHI和鉴定，正确的克隆送至上海华诺公司测序。根据测序结果，请西安美联公司合成的，得到了4条一种分离的多肽，其氨基酸序列分别为PE2A(SEQIDNO:l):GFGRYRRHGSPWPE2B(SEQIDNO:2):MAIGPYPACGSGPE2C(SEQIDNO:3):LSVLVISMFNAVPE2D(SEQIDNO:4):MARHRNWPLVMV五、利用丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒检测丙肝病毒颗粒的步骤如下A.96孔酶标板在紫外灯下照射2小时。每孔加入100^10.05%戊二醛，室温(26°C)孵育1小时。每孔加入100|il20~50mg/L的多肽'室温(26°C)孵育1小时,或4。C过夜。PBS洗涤3遍，甩干。B.每孔加入lOOpl封闭液乙醇胺封闭过夜，4°C孵育过夜。C.洗涤液洗涤五次次后，分别加入？)Lig^g的生物素标记的多肽(包括bio-PE2D，bio-PE2A,bio-PE2B等不同组合)到96孔板中，每孔体积为100^1，37°C孵育lh。D.洗涤五次后，加入10ppl稀释度为1:1000的辣根过养化物酶标记的链霉亲和素(HRP-advin，购自晶美公司)。E.加入邻苯二氨显色，酶标仪OD450nm下读取OD值。显示生物素标记的多肽能与丙肝病毒颗粒直接结合。结果显示分离得到的多肽能特异性结合丙肝病毒E2糖蛋白，并能与丙肝病人血清里的病毒直接结合，其OD值大于与正常人血清结合的OD值的23倍以上。可达到直接检测病人血样里病毒含量的效果。六、利用丙型肝炎病毒包膜抗原试剂盒检测丙肝病毒颗粒的步骤如下-F.96孔板里每孔加入13^丙肝病毒颗粒(3xl()S个病毒)和162碳酸氢钠缓冲液(0.05MpH9.6)，混合，4'C孵育7小时。G.洗涤液(0.P/。Tween-20的PBS磷酸盐缓冲液)洗涤五次。H.每孔加入100pl封闭液(1。/。BSA的PBS磷酸盐缓冲液)，4'C孵育过夜。I.洗涤液洗涤五次次后，分别加入2iagWg的生物素标记的多肽到96孔板中，每孔体积为10(^1，37°C孵育lh。J.洗涤五次后，加入IO(VI稀释度为1:1000的辣根过养化物酶标记的链霉亲和素(HRP-advin，购自晶美公司)。K.加入邻苯二氨显色，酶标仪OD450nm下读取OD值。显示生物素标记的多肽能与丙肝病毒颗粒直接结合。该实验证明分离得到的生物素标记的多肽能特异性结合丙肝病毒颗粒(HCVcc)的E2糖蛋白，结合能力呈剂量依赖性。本发明的优点本实验首次应用核糖体文库筛选了与丙肝病毒包膜E2蛋白结合的多肽。筛选到的三种多肽(ZD,ZA,ZB)与丙肝病毒表面包膜E2蛋白蛋白具有高亲和力，本实验首次用多肽和生物素标记的多肽，双夹心法检测丙肝病人血清中的丙肝病毒包膜抗原，本发明所提供的针对丙肝病毒E2糖蛋白的小分子多肽(12肽)分子量小，易于合成。与同类产品相比灵敏度高于传统检测HCV抗体方法，接近传统HCVRNA检测方法，成本较传统检测HCVRNA检测方法低，不需要PCR仪。图l.随机DNA文库的构建流程图。RBS表示核糖体结合位点，N代表A,C，T或G,M代表A或C图2.核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽的构建流程图。图3.SPR检测多肽PE2A、多肽PE2B、多肽PE2C、多肽PE2D与E2蛋白的亲和力，它们结合的亲合力大小是多肽PE2D〉多肽PE2B〉多肽PE2A〉多肽PE2C。图4A多肽抑制HCVE2蛋白与人肝细胞Huh7.5细胞结合图4B多肽抑制HCVE2蛋白与DC-SIGN+靶细胞结合(A)流式细胞仪检测多肽A、多肽B、多肽D分别抑制HCVE2蛋白结合人肝癌细胞Huh7.5的能力(图4A);多肽分别抑制HCVE2蛋白结合人肝癌细胞Huh7.5的能力的剂量依赖性(图4A)。(B)流式细胞仪检测多肽A、多肽B、多肽D分别抑制62蛋白结合00810^^1113丁3细胞的能力(图4B);多肽分别抑制E2蛋白结合人肝癌细胞DC-SIGN+-NIH3T3的能力的剂量依赖性(图4B)。图5.多肽PE2D能竞争性抑制E2与HCV的受体CD81,和肝素的结合。图6.多肽PE2D能特异性抑制丙肝假病毒(HCVpp)感染靶细胞，且多肽PE2D抑制能力呈剂量的依赖性。图4A是假病毒的构建步骤，图4B是假病毒在293细胞里表达E1、E2蛋白，图4C是PE2D(SEQIDNO:4)阻止假病毒感染Huh7.5细胞，并呈剂量依赖性。图7.ELISA检测不同浓度PE2D与HCV病毒颗粒(HCVcc)结合的能力呈剂量依赖性。图8.ELISA检测不同浓度的PE2D能抑制HCVcc与Huh7.5结合的能力不同，剂量越大，抑制能力越强。图9.HCV包膜抗原诊断夹心法试剂盒检测方法:包被多肽，加样品，再加生物素表记的多肽,以及辣根过养化物酶标记的链霉亲和素检测HCV抗体阳性或HCVRNA检测阳性的丙肝病人血清中的病毒。正常人血清作为对照。具体实施例方式实施例1丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒的配置-a、酶标板(CdlStar@,购自武汉大风生物科技有限公司；b、生物素标记的能与HCVE2蛋白特异性结合的12肽；c、多肽为SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示的序列；d、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；e、辣根过氧化物酶；f、酶联免疫检测仪(购自南京华东电子集团医疗装备有限公司)；g、E2蛋白作为标准阳性对照。一、制备E2-GST融合蛋白的步骤如下A.挑取含有pGEX-KG-E2(见参考文献EngineeringofN-glycosylationofHepatitisCVirusEnvelopeProteinE2EnhancesTcellresponsesforDNAimmunization,Vaccine.2007.25:1544-1551,)的大肠杆菌BL21DE3(购自美国invitrogen公司)培养于3ml含有氨苄青霉素(50g/ml)的LB培养基中，对照组别接种含有pGEX-KG(GST蛋白的原核表达载体，购自AmershamBiosciences公司)，37。C培养12-16小时。B.将小试管中的菌液分别转移到200ml含有氨苄青霉素(50g/ml)的LB液体培养基(LB液体培养基为10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶解至1000ml双蒸水)中，37'C培养到OD600为12。C.加入100mM异丙基-(5-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1mM,3(TC诱导45小时。D.将诱导以后的菌液分装到250ml的离心管中，4。C,7700g，5min离心，弃上清。E.沉淀用磷酸盐缓冲液PBS(140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾)洗涤1次,4。C，7700g,5min离心，弃上清。F.将沉淀重悬于8ml含1mM苯甲基磺酰氟(PMSF:17.42mgPMSF溶于lml异丙醇中，-20。C保存)的PBS中。G.将菌液放置冰中，超声碎菌后加入20。/。曲通X-100(20%TritonX-100:1mlTritonX-100溶于4ml无菌双蒸水中)，使其终浓度1%,4°C,轻混30分钟。H.每EP管中加入lml超声降解的菌液，4°C，12000g，10min离心，取上清。I.上清再次离心，4°C,12000g,10min，再取上清。J.各EP管加入20pi琼脂糖凝胶4B(Sepharose4B:购自AmershamBiosciences公司)，室温(20-25°C,以下相同)轻混30min。4°C，5000rpm,5min，离心，弃上清。K.每个EP管各加入100pi0.01MPBS洗涤，离心洗涤后将含有Separose4B的悬浊液收集于一管，4°C,5000卬m,5min，离心，弃上清，共洗涤3次。L.加入与Sepharose4B等量的GlutathioneEIutionBuffer(0.0154g谷光苷肽溶解于0.25mlpH8.0的1MPBS过滤除菌，分装，4'C保存)，室温轻混10min,4°C,5000rpm，5min，取上清。M.重复步骤L两次。收集的上清则为所需E2-GST融合蛋白。二、制备随机DNA文库的步骤如下(见图1):A.寡核昔酸为3，-CCTCTATATAGGTACCGATCG(NNM)i2AGGCCGGTAGTAGTAGTAGTAGTACCT4GGCCA-5'(90bp)(划线部分分别为SD序列、启始密码子、HisTag、斜体部分为B"w//1酶切位点)(N代表A,C，T或G,M代表A或C)B.第一轮PCR的上游引物Ul为5'-GCTCGTATAATGTGTGGCCACAACGGA4GATATATCCATG-3'(43bp)(划线部分为5'端茎环和斜体部分为核糖体结合位点:RBS)，下游引物Dl为3'-GTAGTA￡￡IQ-5，(52bp)(划线部分分别为S麵HI酶切位点、Gly-Ser序列和3，端茎环)C.第二轮PCR的上游引物U2为5'-GCGCTGCAGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTG-3'(42bp),(划线部分分别为尸Wl酶切位点和Tac启动子)。下游引物为D1。随机ssDNA文库和引物由上海博亚生物有限公司合成。随机DNA文库的构建示意图见图1。D.以寡核普酸为模板，用引物U1和D1进行第一轮PCR，反应体系为:10XTagDNAPolymerasebuffer(含Mg2+)5|ul緒Pmix(10mM)引物Ul(20pM)"I引物Dl(20nM)寡核苷酸(0.05吗1)"I双蒸水40|alTagDNA聚合酶Jul总体积反应程序a.95°C，2分钟b.95°C，36秒；63°C，36秒；72°C，84秒；共25个循环。c.72°C，5分钟E.PCR产物经2。/。的琼脂糖凝胶(0.4g琼脂糖粉末溶解于20mllXTAE溶液)电泳，然后用回收试剂盒(QIAEXIIgelExtractionKit,美国promega公司)回收。F.经步骤E回收所得的PCR产物作为模板，进行第二轮PCR扩增，反应体系为-10XTagDNAPolymerasebuffer(含Mg2+)5^1dNTPmix(10mM)1^1引物Ul(20pM).M引物Dl(20pM)第一轮PCR产物4|xl双蒸水37plTagDNA聚合酶总体积50|al反应程序a.95°C，2分钟b.95°C，36秒；62°C，36秒；72°C，84秒；共25个循环。c.72°C，5分钟G.步骤F所得得PCR产物经2y。的琼脂糖凝胶电泳，然后用回收试剂盒回收，回收所得片段即可用于体外转录翻译DNA模板。三、制备核糖体展示文库的步骤如下A.核糖体文库(见参考文献Wu,etal"P印^fe2005，26(11):2057-2063.),构建及筛选流程如图2所示:将编码1014个随机12肽的DNA库在体外进行偶联的转录/翻译，转录产物mRNA由于缺乏终止子，不能从核糖体上释放，而与新生多肽、核糖体以共价键结合，形成一个稳定的复合体结构。利用连接有Sepharose4B的E2-GST蛋白(E2-GST—Sepharose4B)亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的mRNA—核糖体一多肽复合物，通过降低Mg^浓度，核糖体解离，释放mRNA，回收核糖体富集库中的mRNA，逆转录成cDNA.PCR扩增，其产物可作为下一轮体外合成的模板，经连接有Sepharose4B的GST蛋白(GST—Sepharose4B)反筛以去除非特异性结合的多肽,E2-GST—Sepharose4B正筛，经过六轮筛选，筛选到与E2蛋白特异性结合的多肽。B.反应体系DNA模板(0.3mg/ml)10plS30PremixwithoutAminoAcids20氨基酸混合液(无甲硫氨酸)2.5^1氨基酸混合液(无亮氨酸)2.5WE.coliS30Extract15pi总体积50(al轻轻混匀步骤B中各混合物，5000rpm，离心30秒，让混合物沉积于EP管底部。C.3(TC孵育2.5小时。D.EP管冰上放置5分钟中止反应。即得到核糖体展示文库。四、核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽的步骤如下(见图2)A．在100“1体外转录翻译混合物中加入6单位的无RNA酶的DNase(Promega公司，美国)，10XDNaseI缓冲液(Promega公司，美国)6gl，37℃温育30min。然后加§¨l中止缓冲液，65~C，10rain灭活DNase。B．取60“1E2一GST-Sepharose4B，4℃，5000rpm，5min离心，弃上清。C．沉淀用500glwashingbuffer(50mMpH7．5的Tris一醋酸，150mMNaCl，0．1％Tween．20．50mM醋酸镁)洗涤3次。D．将100ul体外转录／翻译混合物加入到洗涤过的E2-GST-Sepharose4B中，4℃摇动I小时。E4℃，5000rpm，5min离心，弃上清，沉淀用洗脱缓冲液洗涤3次。F．沉淀中加入100¨lelutionbuffer，4℃摇动10rain使mRNA与核糖体解离，4"C，5000rpm，5rain离心，取上清。G．用RNaidK“(购自biol01公司，美国)回收mRNA，具体方法如下g．上清中加入3倍体积的RNABindingSalt(RNaidKit成份)混匀。h．再加入lOglRNAMATRIX(RNaidKit成份)，室温放置5min。i．13000rpm，1rain离心，弃上清。i．用RNAwash(RNaidKit成份)洗涤2次，(RNAwash~gg。11)。k．加入1．Ogl无RNase的H20，55口C温育5min。1．13000rpm，2min离心，取上清，上清即是RNA模板，可用于RT-PCR。H．RT-PCR，其反应体系为AMV／Tfl5×Reactionbuffer10“ldNTPmix混合物1“1引物U1(20raM)lpl引物Dl(20mM)1肛1硫酸镁(25mM)2plAMVReverseTranscription1LLlYflDNA聚合酶1“lRNA模板1pl无酶水29^总体积50pi反应程序为48°C，45分钟；94°C，2分钟；94°C，30秒；63°C,l分钟，72°C，2分钟；共31个循环；72°C,7分钟I.2%琼脂糖琼脂糖凝胶电泳。J.回收分子量大小为155bp的RTPCR产物。K.以回收产物为模板，再行第二轮PCR扩增，回收分子量大小为181bp的PCR产物。L.将回收的第二轮PCR产物连接至载体pUC19(购自美国invitrogen公司)上，具体步骤为a.将PCR产物及载体pUC19酶切，反应体系为10XY+Buffer2pi5應HI1pi尸M1(ilddH2017|ul总体积20(J37'C水浴2小时b.分别回收分子量大小为128bp的DNA片段以及分子量大小为2.668kb的pUC19目的片断(回收方法同上)。c.用DNA连接酶将步骤b所的DNA和载体pUC19连接，反应体系为DNA4|alpUC192pilOXBuffer2^1T4连接酶2pi双蒸水10^总体积20^16。C孵育20小时d.将步骤c所得的连接产物分别转化至大肠杆菌DH5a。取连接产物lOpl，加入100)ilDH5a感受肽细胞，冰浴30分钟，42°C90秒，再冰浴5分钟，加入800)alLB液体培养基(LB液体培养基为10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶解至1000ml双蒸水)，37°C，225rpm振摇4050分钟。取200|il菌液均匀涂在有氨苄青霉素(Amp"抗性的LB固体培养基(LB固体培养基为10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，15g琼脂粉溶解至1000ml双蒸水)上(氨苄青霉素浓度为50|ag/ml)，37。C培养过夜。e.挑取单个克隆菌落，置于3mlLB液体培养基(含氨苄青霉50pg/ml)培养过夜。f.提取步骤e获得的菌液的质粒DNA。g.PCR鉴定步骤f所得的DNA，反应体系为10xTaqDNApolymerasebuffer5(jldNTPmix混合物(l0mM)1引物U2(20mM)1pl引物D1(20mM)1^质粒DNA1pi双蒸水40|alTaqDNAPolymerase1pi总体积50pi反应程序为95°C，2分钟；95°C，30秒；62°C，1分钟，72°C，l分钟24秒；共25个循环；72°C，5分钟h.将步骤g所得产物经^^/7I和/VI鉴定，正确的克隆送至上海华诺公司测序。M.根据测序结果，请西安美联公司合成12肽，见表l。表l筛选出的与E2蛋白结合的多肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>实施例2表面等离子共振技术(SPR)检测多肽与E2蛋白的亲和力的歩骤如下A.让测试仪器Biocore(美国)通过一段HBS缓冲液直至基线稳定。B.注射40)iU氨基偶联试剂(含0.02M的l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)禾B0.05M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))，活化CM5传感片上的羧基。C.用pH值为5.0的醋酸缓冲液将E2蛋白稀释至5mg/ml，注射该溶液40D.上机检测，流速为20(al/min。E.将多肽PE2A、PE2B、PE2C、PE2D稀释为不同浓度，以2pl/min上机与CM5传感片上的E2蛋白作用7分钟。F.以2pl/min的流速注射10pl的HC1再生液使基线恢复，实时采集响应信号。G.用BIACORE的专用软件进行数据分析，我们发现分析PE2D与E2蛋白的亲和力最高，结果见图3，其亲和力有关参数见表2。表2多肽与E2蛋白相互结合作用的动力学数据多肽ka/M-V1(x104)kd/s1(x103)WM1(x107)PE2A3.221.392.32PE2B2.561.222.10PE2CnononoPE2D7.511.455.18实施例3流式细胞仪检测多肽与靶分子细胞结合的步骤如下A.培养人肝癌细胞Huh7.5(见参考文献Zhong,etal.,RobusthepatitisCvirusinfectioninvitro,2005,PNAS,102:9294-9299)和DC-SIGN+-NIH3T3(表面有DC-Sign分子的小鼠的成纤维细胞)细胞(见参考文献Wu,etal.，FunctionalevaluationofDC-SIGNmonoclonalantibodiesrevealsDC-SIGNinteractionswithICAM-3donotpromotehumanimmunodeficiencyvirustypeItransmission.J.virol.2002,76:5卯5-5914)。培养条件均为10%胎牛血清的DMEM培养基(Gibco公司购买)，培养于37°C，含5%二氧化碳的培养箱中。B.将多肽PE2A、PE2B、PE2D分别与E2-GST蛋白混合(对照管加入GST蛋白)，总体积为50pl，其中多肽的浓度均为500pM，E2-GST蛋白和GST蛋白的浓度均为20|ag/ml，37。C孵育30分钟。C.将步骤B所得的多肽与蛋白的混合物分别与收获的Huh7.5和DC-SIGN+^1113丁3细胞混合，总体积为100pl，其中细胞个数为2乂106个。37°C孵育30分钟。D.每管加入1mlPBS洗涤，1000rpm，5min，弃上清，用80|11重悬细胞。E.加入20pl1:500的E2-GST抗体，37。C孵育30分钟。F.重复D步骤一次。G.加入1|ilPE标记的羊抗兔的二抗，37t:孵育30分钟。H.每管加入1mlPBS洗涤，1000rpm，5min，弃上清，用500(al重悬细胞。I.经上机检测，申请人发现PE2A,安PE2B，PE2D分别与E2-GST蛋白作用后，能显著抑制￡2蛋白结合至,11117.5细胞(图4)及0(:-810^^1]^丁3细胞(图5)，且成剂量依赖关系，多肽剂量愈大，其与E2的亲合力愈强，抑制HCVE2侵袭靶细胞能力愈强(图4A和图4B)。实施例4多肽D能部分竞争性抑制E2与HCV的受体CD81,和肝素的结合(图5)。实施例5PE2D能抑制HCVppv假病毒(图6A,6B)侵袭人靶细胞(图6C).HCVppv假病毒的构建见6A,6B,PE2D抑制HCVppv假病毒侵袭人靶细胞的能力呈剂量依赖性，多肽D浓度愈大,其抑制能力愈强(图6C)。实施例6检测多肽PE2D与丙肝病毒颗粒(HCVcc)结合的步骤如下A.96孔板里每孔加入丙肝病毒颗粒(3xl0S个病毒)和162pl碳酸氢钠缓冲液(0.05MpH9.6)，混合，4'C孵育7小时。B.洗涤液(0.1。/。Tween-20的PBS磷酸盐缓冲液)洗涤五次。C.每孔加入100^1封闭液(1%BSA的PBS磷酸盐缓冲液)，4°C孵育过夜。D.洗涤液洗涤五次次后，分别加入O吗，2昭，4吗，3吗的bio-PE2D到96孔板中，每孔体积为10(Hil，37°C孵育lh。E.洗涤五次后，加入lOPpl稀释度为1:1000的辣根过养化物酶标记的链霉亲和素(HRP-advin，购自晶美公司)。F.加入邻苯二氨显色，酶标仪OD492nm下读取OD值。显示bio-PE2D能与丙肝病毒颗粒直接结合。该实验证明分离得到的多肽能特异性结合丙肝病毒颗粒(HCVcc)，结合能力呈剂量依赖性(图7)。实施例7检测多肽PE2D抑制丙肝病毒颗粒(HCVcc)感染人肝细胞Huh7.5细胞的步骤如下A.培养人肝癌细胞Huh7.5于24孔板中，置于37'C，含5%二氧化碳的培养箱中，培养条件为10%胎牛血清的DMEM培养基，。B.每孔加入PE2D和3xl()S个丙肝病毒颗粒，PE2D的浓度分为200pM，40p(iM。C.37'C孵育5小时，洗涤细胞后，加入培养基培养3天。D.加入荧光标记的HCV-E2抗体(购自上海巴斯德研究所)与细胞孵育30分钟E.荧光显微镜下计数每孔红色荧光点数(ffu/we11，58nm)。该实验证明分离得到的多肽PE2D能特异性抑制丙肝病毒颗粒(HCVcc感染人肝细胞，且剂量越大，抑制能力越强，呈剂量依赖性(图8)。实施例8一种夹心法试剂盒在制备检测丙型肝炎病毒包膜抗原的方法，利用该试剂盒检测150例丙型肝炎病人血清里的丙肝病毒(该病毒是从湖北.武汉有关医院收集到丙型肝炎病毒人血清里的丙肝病毒)，150例正常人血清作为对照(体检收集到正常人血清为参考物)，步骤如下A.96孔酶标板在紫外灯下照射2小时。每孔加入100^10.05%戊二醛，室温(26°C)孵育1小时。每孔加入100)il30mg/L的多肽，室温(26°C)孵育1小时,或4°C过夜。PBS洗涤3遍，甩干。B.封被每孔加入100pl封闭液乙醇胺封闭过夜，4°C孵育过夜。C.重复B步骤一次。D.每孔加入lOO)il丙肝病人血清或健康人血清，37。C孵育l2小时。E.重复B步骤一次。F.每孔加入lOOjil10mg/L的生物素标记的多肽(北京华大基因公司合成)37i:孵育12小时。G.重复B步骤一次。H.每孔加入100^1辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(稀释度为1:1000)，37。C孵育30分钟。I.加入邻苯二氨显色，酶标仪OD492nm下读取OD值(见图9)。结果显示生物素标记的多肽能特异性与丙肝病人血清里的病毒直接结合，其OD值大于与正常人血清结合的OD值的23倍以上。可达到直接检测病人血样里病毒含量的效果SEQUENCELISTING<110>武汉大学<120>丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒及检测方法<130〉丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒及检测方法<160>4<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>12<212〉PRT<213〉人工合成<400>1GlyPheGlyArgTyrArgArgHisGlySerProT卬1510<210>2<211〉12<212>PRT<213>人工合<400〉2MetAlaHeGlyProTyrProAlaCysGlySerGy1510<210>3<211>12<212>PRT<213>人工合成<400>3LeuSerValLeuValHeSerMetPheAsnAlaVal<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>权利要求1、一种丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒，该试剂盒包括a.生物素等标记的能与HCVE2蛋白特异性结合的多肽；b.多肽为SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4所示的序列；c.辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；d.辣根过氧化物酶底物；e酶标板，酶标仪；f.酶联免疫检测仪；g.E2蛋白作为标准阳性对照。2、利用权利要求1所述的一种夹心法试剂盒在制备检测丙型肝炎病毒包膜抗原的方法，该检测方法包括下列步骤-A.96孔酶标板在紫外灯下照射2小时,每孔加入100pi0.05%戊二醛，室温26。C孵育1小时,每孔加入100^30mg/L的多肽，室温26'C孵育1小时,或4oC过夜,PBS洗涤3遍，甩干；B.洗涤液为0.1%Tween-20的PBS磷酸盐缓冲液洗涤五次；C.封被每孔加入100pl封闭液乙醇胺封闭过夜，4°C孵育过夜；D.重复B步骤一次；E.每孔加入100^U丙肝病人血清或健康人血清，26。C-37。C孵育1~2小时；F.重复B步骤一次；G.每孔加入100)all0mg/L的生物素标记的多肽，37'C孵育12小时；H.重复B步骤一次；I.每孔加入lOOpd辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，稀释度为1:1000，37。C孵育30分钟，加入辣根过氧化物酶底物邻苯二氨显色，酶标仪OD492nm下读取OD值。全文摘要本发明公开了一种丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒及检测方法，包括酶标板，能与HCVE2蛋白特异性结合的三种多肽，生物素标记的能与HCVE2蛋白特异性结合的三种多肽，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。一种夹心法试剂盒在制备检测丙型肝炎病毒包膜抗原的方法，步骤是首先包被多肽，再加入待测病人血清，第三是加入生物素标记的多肽，第四是加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，第五是加入邻苯二氨显色，酶标仪OD450nm下读取OD值。多肽及其标记物作为检测丙型肝炎病毒包膜抗原的试剂盒中的应用。可广泛应用于医学等相关领域。文档编号G01N33/576GK101458255SQ200710168890公开日2009年6月17日申请日期2007年12月14日优先权日2007年12月14日发明者章晓联申请人:武汉大学