专利名称：由标本切片获得图像的方法
技术领域：
本发明有关一种由标本切片(slice)获得图像的方法，该方法 包括重复地-获得标本的表层的图像，和-去除标本的表层，由此把下一切片带到表面.背景技术从例如具有离子-光学柱和电子-光学柱二者的粒子-光学装 置，诸如来自FEI公司的商用DualBean^仪器中，可获知这种重复地 去除表层(也称为切片)并获取标本图像的方法。要注意，本发明的上下文中的'图像，应解释为既是在显示单元 上显示的图像，又是在例如计算机存储器中的其表征。将这种方法应用于工业和实验室中，例如用来分析和检查生物标 本和聚合物标本，再如用来形成生物組织和聚合物中结构的三维(3D)重构。用于执行该已知方法的仪器包括电子-光学柱，其通过在标本上 进行聚焦高能电子束扫描来获取标本的图像，并且典型地高能电子 的能量在0.1-30 keV之间。从扫描电子显微镜(SEM)中，可获知这 种柱的工作方式。在电子束撞击标本的位置，响应撞击电子的轰击， 可能会发射诸如二次电子、反向散射电子、X射线和光的二次辐射. 通过对由例如二次电子探测器(SED)发射的二次电子数量进行探 测，能够获取(依赖于位置的)标本表面的信息.该信息能够作为 图像在显示器上显示，或者能够把所述图像存储起来用于将来检索 或处理。如此获取到标本表面的图像之后，可以使用离子柱去除表层。从 聚焦离子束(FIB)仪器中，可获知这种柱的工作方式。所述柱发射高 能离子聚焦束，诸如具有例如40 keV能量的Ga+离子束.在离子束 撞击标本的位置，材料被去除。通过在离子束撞击标本位置的附近
导入特定气体，使这种去除得到了极大的增强.这种离子束能够扫 过所述表面，由此滞留时间(与诸如当前密度和能量的离子束特性 一同)决定了表层会被去除多少。结果，去除了材料切片.去除了所述表层之后，新的表层暴露出来，并且用电子束能够获 取如此暴露的表层的图像。通过重复地获取表层的图像，并且从标本去除表层(从表层去除切片)，能够制成标本的3D重构。或者， 通过例如提供表面信息的技术，能够把标本内部的感兴趣的区域带 到表面来进行检查。问题是当观察某些诸如聚合物和生物组织的材料时，标本的对 比度可能太差而不能容易地区分标本的特征.正如本领域技术人员 所知，为了提高对比度，可以对标本进行着色来优先使标本的一些 部分比其他部分显得突出.为了使着色变得有效，人们必须优先约 束标本的一些部分，由此在标本不同的部分之间进行区分，在电子显微学中，可以使用重金属盐作为着色剂.这种重金属盐 通常由金、铀、钌、锇或钨得到.因为重离子易于与电子束相互作 用，并且产生相位对比度、吸收对比度和/或引起反向散射电子，所 以使用重离子，这些重金属盐中的一些会粘附到标本的特殊物质。0s04 (四氧化锇)就是一个例子，其形成与不饱和脂肪酸的-c-c-双键的特殊的化学反应。其他可以使用的着色剂例如是具有例如适当的生物活性基团(诸 如抗体)的重金属的化合物。这种着色剂也被称为标签. 一个例子 是被抗体吸收的胶体金粒子。其他的这种着色剂基团的例子是由美 国Nanoprobes Inc.生产的化11(^01(1*粒子，其可以用来标记任何具 有合适的反应基团诸如低核苷酸、脂质、肽、蛋白质和酶抑制剂的 分子。为了对标本进行着色，将该标本暴露于着色剂.所述暴露能够采 取把标本暂时浸入到诸如1%的0s04溶液的液体中的形式。着色处理 中更进一步的步骤可以包含用水、酒精等对标本进行清洗.这种着 色处理在例如John E. Scott和Constance R. 0rford的"Dermatan sulphate—rich proteoglycan associates with rat-tendon collagen at the d band in the gap region" (Biochem. J.， 第(1981) 197期，第213-216页)中进行了阐述，特别是在'materials and methods' —节中《所述暴露也能够采取把标本暴露于着色剂的气体或蒸汽的形 式。这在例如Y. Nagata等人的"Observation on backscattered electron image (BEI) of a scanning electron microscope (SEM) in semi-thin sections prepared for light microscopy" (Tokai J. Exp. Clin. Med. ， 1983 May 8(2)，第167-174页)中进行了阐 述.为了良好的对比度，必须对标本进行充分地着色.然而，着色剂 的剂量存在最优值过度着色会造成对比度降低，因为标本的太多 部分都变成被着色的了，由此(被着色的)感兴趣的结构不再相对 于背景突出。因此，必须寻找到着色的适当剂量.着色剂和要被着色的材料的特定组合的问题是在标本中着色剂 的扩散率非常低。在生物组织中，许多重金属着色剂表现出低扩散率，而在聚合物中，扩散率甚至更低，结果，当例如对厚的聚合物 标本进行着色使其表面被着色到适当的水平之时，标本的内部没有 被充分着色以获得良好的对比度.然而，若着色使其内部得到充分 着色，则表面又会着色太重以致不适合获得良好的图像.因此，需要以这样一种方式对厚的标本进行着色，即把整个标本 着色到适当的水平。发明内容本发明旨在提供一种用于以这样一种方式对厚的标本进行着色 的方法，即整个标本能够以适当的着色水平进行成像。为此目的，根据本发明的方法，其特征在于在至少其中一次去除 表层之后，将标本暴露于着色剂。通过每次剥离表层时对标本的表面进行再着色，能够将该表面每 次既着色到最佳的水平，又着色到恒定的水平。要注意，可以在每次单独地去除表层之后不必进行再着色，而仅 在预定数目的层之后需要再着色.这可以导致处理时间减少，并且 因此缩短周期时间。在根据本发明的方法的实施例中，用离子-光学装置获取图像。
虽然该方法能够与不同种类的诸如光显微镜法和荧光显微镜法 的显微镜法一同使用，但是特别有吸引力的是与电子和离子显微镜 法一同使用.要注意，当每次去除表层之后仅对非常薄的如20nm的层进行着 色(例如，通过将标本短时间暴露于着色剂)时，作为另一优点， 扫描电子显微镜(SEM)图像的分辨率得到了改善.这能够解释如下在SEM中，通常通过探测反向散射的电子来观察着色的标本，因 为着色剂的重金属引起大量的反向散射.这种反向散射的电子能够 深入标本的内部(例如，表面之下0.5,)产生，并且仍可探测到. 这意味着，当重金属原子出现在标本内部深处时，仍可探测到它们， 这会造成图像不仅显示表面处着色结构的信息，还显示着色的表面 下结构的信息。通过仅对例如20 nm的薄层进行着色，仅仅在此薄 层中的着色结构对图像有所贡献.未着色标本的光原子只引起很少 的反向散射的电子，因此基本上将不会对图像有所贡献.结果，图 像因此只显示标本最上层中的着色结构，并且因此改善了图像的分 辨率。同样的作用还改善了例如从标本探测到的X射线的分辨率，所述 X射线是着色标本中电子束撞击重金属原子的结果.在根据本发明的方法的另一实施例中，使用粒子束去除表层.使用离子束或电子束，再辅以蚀刻气体来去除表层是公知的技 术，其能够去除例如几十纳米的层，然而可以去除甚至更厚的层. 去除的层的一般厚度大约为30-60 nm。在根据本发明的方法的另 一实施例中，通过将标本暴露于气体或 蒸汽来完成着色.通过将标本暴露于气体或蒸汽，使该方法得到了最好的执行，以便剥离和再着色的表面不需要进行进一步的干燥.这不仅因为标本 不会反复地变湿和变干而变形，从而提供了更好的结果，而且还节 约了时间，因为通过变湿着色后面是漂洗典型地要花几十分钟或更 长，而暴露于气体或蒸汽在例如十秒之内产生了良好的效果。另一 优势在于能够仅对标本的非常薄的层着色，如前面所提及的，其导 致改善的分辨率.在根据本发明的方法的另一实施例中，着色发生在真空腔室中，
或者至少在具有低压的腔室中。在真空中进行着色，可以进行不与大气中的气体发生反应而改变 的表面着色，所述反应例如是与氧的化学反应，或者例如是由大气中的水蒸汽引起的水合作用.换而言之在去除表层之后，使标本 的表面保持新鲜.在根据本发明的方法的另一实施例中，标本在真空腔室中进行着 色，所述真空腔室是粒子-光学装置的一部分.通过在粒子装置的真空腔室中将标本暴露于着色剂，标本不必从 装置中除去，并且可以保持其相对于柱的位置。这导致处理时间的 大大减少，因为不用耗费时间来搜索某些特征.而且，因为标本并 不需要在真空腔室中重新定位(这通常通过对真空腔室进行排气， 然后安装标本，之后排空腔室来进行)，因此节省了时间.在根据本发明的方法的另一实施例中，将标本暴露于一种以上的 着色剂。电子显微学中已知的问题是， 一种重金属着色剂不能很好地与另 一种重金属标记区别开来。两种重金属标记都显示出相同的性能 与电子束的强烈相互作用。要注意，可以设想对从不同的重金属发射的特征X射线辐射进行 探测，但是这样做的效率比对例如反向散射电子进行探测的效率低 得多，导致在电子束的给定的暴露时间对X射线进行探测时的较低 的信噪比。因此，在电子显微学中，不太可能进行对比着色(differential staining)(使用反向散射电子)。通过当用笫一种着色剂使标本着色时获取图像，然后，用不同的 着色剂使标本着色之后获取标本的图像，能够独立地观察到每种着 色剂的效果.用于一片切片的着色剂不需要用于另一切片.可以想象得到，使 用一种着色剂，粘附到某种类型的组织或材料上，观察笫一切片， 其后观察另一切片，其利用另一种着色剂进行着色，与另一种类型 的组织或材料相粘附。因此，根据本发明的方法使用例如反向散射 电子也能够实现标本的对比着色。在根据本发明的方法的另一实施例中，当用一种着色剂以及用一
种以上的着色剂对标本进行着色时，获得标本的图像，由此使对比 着色能够进行。通过把用一种着色剂对标本进行着色时所获得的图像与用另一 种着色剂对标本的同 一切片进行另外着色时所获得的图像进行比 较，能够观察到对比着色.要注意，通过从用另 一种着色剂对标本进行另外着色时所获得的 图像减去用一种着色剂对标本进行着色时所获得的图像，由此消除 或至少极大地降低了第 一种着色剂的影响，能够观察到第二种着色 剂的单独效果.在根据本发明的方法的另 一实施例中，当用 一种着色剂对标本进 行着色时获得标本的图像，其后去除表层，将标本暴露于另一种着 色剂，然后获得另一图像，由此获得一次用一种着色剂着色的标本 的图像.在根据本发明的方法的另一实施例中，在未着色的条件下以及在 着色的条件下获得标本表层的图像，并且由此所获得的图像以这样 一种方式进行合并，即在着色的图像中消除或至少极大地减少未着 色标本的地形和拓朴信息。在根据本发明的方法的另 一实施例中，着色剂包括具有重金属和 有机基团的分子。在本发明的另一方面中，装备气体注入系统用来对进入粒子-光 学装置的真空腔室的着色气体或蒸汽进行管理.
将以示意图为基础对本发明加以阐明，其中相应的特征由相应的 参考4示i5指示。 为此目的，图1示意性地图示了根据本发明的方法，图2示意性地图示了根据本发明的方法，其中应用了对比着色，和图3示意性地图示了一种被装备用来执行根据本发明的方法的 装置，具体实施方式
图1示意性地图示了根据本发明的方法.该方法开始，其后在步骤101中对标本进行着色.在步骤102 中，获取并且存储标本表面的图像.只要必须去除表面的更多切片 (在步骤103中确定)，那么就在步骤104中去除表层。在步骤103中，对必须去除更多切片的判定可以例如基于当前感 兴趣的结构，其位于表面上并且在步骤102中获取的图像中可见， 或者它可以例如基于预定的切片数，其等同于将要观察的标本的某 一预定厚度。在步骤104中去除表层之后，对标本进行再着色，并且只要需要 就通过重复步骤101、 102和103来获取新的图像.若不需要去除另外的表层(取决于步骤103中的判定)，则例如 可以构造标本的3D图像(步骤105 ).图2示意性地图示了根据本发明的方法，其中应用了对比着色.如图1中所述的方法中，该方法开始，其后在步骤201中用第一 种着色剂对标本进行着色，并且在步骤202中获取此切片的第一图 像。此后，在步骤203中，用另一种着色剂，即笫二种着色剂对标 本进行着色.在步骤204中，获取这种双重着色标本的此切片的第 二图像。通过在步骤205中执行适当的图像处理，例如从在步骤204中 获取的此切片的第二图像减去在步骤202中获取的此切片的第一图 像的信息，能够获取此切片的图像，所述图像只显示由第二种着色 剂进行着色而产生的信息。这极大地简化了对对比着色效果的解释。在步骤206中，其等同于图1中的步猓103，对是否需要去除表 层进行判定，若需要，则在步骤207中剥离表层，并且重复步骤 201-206，直到206的判定结果是不需要去除另外的表层.最后，在步骤207中可以用任何所用的着色或任何其组合来构造 标本的3D图像.要注意，代替用两种不同的着色剂进行着色，该方法也能够用来 利用两种以上的着色剂进行着色，导致从标本获得的甚至更多的信 息。
还要注意，其中图像彼此相减的该方法也能够用来获得只有一种 着色剂的标本的图像，同时减去未着色标本的拓朴或其他信息.为了实现此目的，应该跳过步骤201,图3示意性地图示了一种被装备用来执行根据本发明的方法的 装置。图3示出了被装备有产生聚焦离子束11的离子-光学柱il和产 生聚焦电子束21的电子-光学柱！L的粒子-光学装置.束ll、 21都 可以相互独立地在标本1上进行扫描，所述标本安装在标本台2上。另外，束ll、 12中的每一个可以在任何时刻被阻断，因此能够 一次利用束ll、 21之一进行工作，当以从扫描电子显微学得知的方式用电子-光学柱20产生的电 子束21对标本1进行扫描时，探测到(依赖于位置的)二次辐射， 诸如通过众所周知的Everhart-Thornley型二次电子探测器30 (SED) 探测的二次电子.此探测器30的信号被中央控制处理单元(CCPU) 40 使用，并且图像可以在观察屏50上进行显示。还可以探测诸如被X 射线探测器31探测到的X射线或被反向散射电子探测器(BSD) 32探 测到的反向散射电子的其他信号，所述其他信号随后由CCPU 40进 行处理。尤其是由BSD 32探测到的信息是重要的，因为重金属标记 引起大量的反向散射电子，并且由此产生大BSD信号。CCPU 40还尤其对离子柱11，、电子柱H，、标本台2、气体注 入器4和着色单元5进行控制。获得了标本的此切片的图像之后，离子束11在标本1上进行扫 描，由此去除标本的表层.通过在离子束撞击标本位置的附近注入 特定气体，极大地提高了去除率。这样的气体能够用气体注入系统4 注入真空腔室3中。去除表层并且由此暴露标本的新鲜切片之后，通过把诸如Os04 气体的着色剂注入到标本来对标本进行着色。着色的量由局部蒸汽 压力以及标本暴露于蒸汽的时间来控制.通过着色单元5，把着色剂 注入到真空腔室3内。通过停止着色气体或蒸汽的供应来完成着色，借助真空泵(未示 出)把剩余的着色剂从真空腔室3中除去，其后可以以前面所提及 的方式获得另一图像。 要注意，也可以通过在注入特定气体的同时使电子束在标本上扫 描来实现表面材料的去除。进一步要注意，为了去除材料，并不需要使离子束聚焦.另外， 对于去除材料，散焦离子束和例如由气体放电引起的离子轰击是公 知的，然而，实验结果表明，使用聚焦离子束是优选的方法，因为 用聚焦束对标本进行扫描会导致材料的均勻去除，否则优先蚀刻/研 磨的机会得到提高，导致从标本非均匀地去除材料.还要注意，根据本发明的方法能够例如用于没有人工干预或中间图像观察地、自动地重构标本的3D图像，
权利要求
1.用于由标本切片获得图像的方法，该方法包括重复地-获得标本(1)的表层的图像，和-去除标本的表层，由此把下一切片带到表面，其特征在于-在至少其中一次去除表层之后，将标本暴露于着色剂。
2. 根据权利要求1的方法，其中用粒子-光学装置获得所述图像.
3. 根据前述权利要求中的任何一项的方法，其中使用粒子束(ll) 去除表层.
4. 根据前述权利要求中的任何一项的方法，其中通过将标本暴 露于气体或蒸汽来实现着色.
5. 根据权利要求4的方法，其中所述着色发生在真空腔室(3)中，或者至少在具有低压的腔室中。
6. 根据权利要求5的方法，其中标本在真空腔室(3)中被着色，所述真空腔室是粒子-光学装置的一部分.
7. 根据前述权利要求中的任何一项的方法，其中将标本暴露于 一种以上的着色剂.
8. 根据权利要求7的方法，其中在只用一种着色剂对标本进行 着色时以及在用附加的着色剂对标本进行着色时获得标本的图像，由此能够实现对比着色。
9. 根据权利要求7的方法，其中当用一种着色剂对标本进行着 色时获得标本的图像，其后去除表层，将标本暴露于另一种着色剂， 然后获得另 一图像，由此获得一次利用 一种着色剂着色的标本的图 像.
10. 根据前述权利要求中的任何一项的方法，其中在未着色的 条件下以及在着色的条件下获得标本的表层的图像，并且由此获得 的图像以这样的方式进行合并，即在着色的图像中消除或至少极大地减少未着色标本的地形和拓朴信息。
11. 根据前述权利要求中的任何一项的方法，其中所述着色剂 包括具有重金属和有机基团的分子。
12.气体注入系统(5)，其特征在于该气体注入系统被装备用来 对粒子-光学装置的真空腔室(3)中的着色气体或蒸汽进行管理.
全文摘要
本发明涉及由标本切片获得图像的方法，该方法包括重复地获得标本(1)的表层的图像，并且去除标本的表层，由此把下一切片带到表面；其特征在于在至少其中一次去除表层之后，将标本暴露于着色剂。该方法尤其适合用于装备有扫描电子显微镜柱(<sub>20</sub>)和聚焦离子束柱(<sub>10</sub>)的粒子-光学仪器中。例如，通过将诸如OsO<sub>4</sub>(四氧化锇)的气体注入到标本，能够在原位置上对标本着色。该方法还可以通过下述来执行对比着色首先制作暴露于第一种着色剂的标本的图像，随后，当利用第二种着色剂对标本进行附加着色时，制作标本的图像。
文档编号G01N23/22GK101126726SQ20071014102
公开日2008年2月20日 申请日期2007年8月16日 优先权日2006年8月16日
发明者J·J·L·穆尔德斯, L·罗塞尔, W·M·巴辛 申请人:Fei公司