一类不对称菁类荧光染料的利记博彩app

专利名称：一类不对称菁类荧光染料的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及适合用于核酸染色的染料，更具体地说涉及不对称 菁类荧光染料。
背景技术：
荧光检测技术在DNA杂交测试、基因重组测试、免疫检测、血 细胞分析和紳瘤细胞早期诊断等方面的广泛应用极大地促进了荧光 染料的发展。最早应用于生物分析的荧光染料为吖啶、菲啶类染料， 如吖啶橙、溴乙锭等，它们通过嵌入或静电吸引与DNA小分子结合， 结合后荧光大大增强。但未结合染料的自身荧光会造成高的荧光背 景，从而干扰检测。同时溴乙4定等有很大的毒性和致癌性，因此它 们已逐渐被其它荧光染料代替。
目前，使用比较多的有罗丹明、荧光素类、BODIPY类和菁类 荧光染料。菁类荧光染料首先由Williams发现，至今已有150年的 历史，如今作为生物荧光检测探针、CD和VCD记录材料、感光材 料光敏剂、光电转换材料等已被广泛的应用，其中作为生物分子的 荧光探针用于检测核酸、蛋白质等尤其成为关注的焦点。
菁染料曱川链两端的含氮芳香母核有很多种类，包括噻唑、噻 吩、2-喹啉、4-喹啉和3H-吲哚啉等。按其相同与否可分为对称和不 对称两类。其中，不对称菁染^f主要应用于物理结合荧光标示，与 核酸的结合方式包括静电吸引、碱基对嵌入及沟槽结合。具体的结 合方式取决于染料的结构及染料与核酸浓度的比例。不对称菁染料 中最典型的一类为TOTO及其类似物和衍生物类。TOTO (p塞唑橙二 聚体)、YOYO (恶唑黄二聚体)是由Glazer研究组开发的一类对核酸具有高度亲和力的多正电荷不对称菁类荧光染料，通过改变多亚曱 基链两端的染料分子可以得到不同的异二聚体类似物和衍生物。这 类染料在溶液中无荧光，与核酸结合后焚光增强，因此降低了检测
过程中的荧光背景干扰。Jason等用溶液粘度测定法和原子力显微镜 解释了 TOTO和YOYO与DNA的双嵌入作用[丄A. Bordelon, K.J. Feierabend, S.A. Siddiqui, L丄.Wright. J. Phys. Chem. B， 2002, 106, 4838-3843]。 Ftirstenberg等利用超快速荧光转换和时间相关单光子计 数法进 一 步阐述了荧光增强的动力学机理[A. Ftirstenberg, M.D. Julliard, T.G. Deligeorgiec, N.I, Gadjev. J. AM. CHEM. SOC.， 2006, 128, 7661-7669]。但是此类染料的光i普在可见光区(490-530 nm),而生物
样品在这个区域有很强的吸收和荧光发射，这会造成荧光检测效率 大大降低。尽管通过增加共轭链数可以使染料的吸收和发射波长产 生红移达到近红外区(WO-IOOO nm)，如TOTAB、 TOTIN、 TO-PRO-3、 PO-PRO-2和BO-PRO-2等[K.M. Sovenyhazy,丄A. Bordelon, J.T. Petty. Nucleic Acids Res, 2003, 31, 2561],但这类染料一般分子较大，结构 复杂，合成步骤多，因而使其商品化受到了限制。
此外，随着曱川链的增长，菁染料的光稳定性逐渐下降，因此 需要进一步提高长波长菁染料的光稳定性。
美国专利6004816描述了一种用于分类和计数白细胞的试剂， 其中包含的荧光染料特异性结合RNA而增加其荧光强度。但是这种 焚光染料的光稳定性仍然不足，容易造成实验误差。
美国专利公开2003/0145394公开了 一种氦-氖激光器可激发的荧 光染料，其用于检测和计数网织红细胞。这种荧光染料需要昂贵的 氦-氖激光器，实际应用的设备成本较高。
因此，需要开发新的荧光染料，该荧光染料优选具有以下性质 在不存在核酸时不发荧光，而在存在核酸时具有良好的荧光量子产 率；具有一定水平的水溶性，同时具有一定的穿过细胞膜的能力； 光谱范围与生物样品的光谱范围有较大差异。

发明内容
在一个方面，本发明结合现有的各类菁染料的优点，在其基础
上改进，提供了一类不对称菁类荧光染料，其具有下列结构通式I:
其中
n为1 、 2或3;
X为C(CH3)2、 O、 S或Se;
R,和R2各自独立选自H、 C^烷基、-(:1.6烷基-0115或卣素； Rs为H、 Cw烷基、OR5、 -&.6烷基-0115、 COOR5、 N02、 CN 或卣素；
&为Cw烷基、-CVJ^l-OR"苄基或卤素，所述苄基由选自 以下的取代基任选取代卣素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、 芳基、烷氧基、杂环基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧 基；
Rs为H或C,.,8烷基； Y为负离子。
优选n为l或2，更优选n为l。
优选X为C (CH3)2、 O或S;更优选X为C (CH。2或S;最优 选X为S。
优选1^和R2各自独立选自H、 C,.)8烷基或卣素；更优选R,和 R2各自独立选自H或Cws烷基；再更优选R,和R2各自独立选自H 或Cl12烷基；再更优选&和R2各自独立选自H或CV6烷基；最优 选R,和R2均为H。优选R3为H、 Cw8烷基、OR5、 COORs或面素；更优选R3为H、 <^.12烷基、OR5、 COORs或卤素；最优选R3为H、 C^烷基、OR5、 COORs或囟素。
优选R4为Cl18烷基、千基或卣素，所迷千基由选自以下的取代 基任选取代卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧 基、杂环基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；更优选114 为C^8烷基或者苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基 或氨基任选取代；更优选R4为Cw2烷基或者千基，所述千基由面素、 羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；更优选R4为Cl12烷基或 者千基，所述千基由卣素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取 代；最优选R4为Cw烷基或千基，所述千基由面素、羟基、巯基、 氰基、硝基或氨基任选取代。
优选115为H或Cw烷基，更优选Rs为H或C^烷基。 优选Y-为卤素离子、C104-、 PF6—、 CF3S03-、 BF4-、乙酸根或对 甲苯磺酸负离子。
在一个实施方案中，本发明还提供上述式I化合物的缀合物。 在另一个方面，本发明还4是供合成上述式I化合物或其缀合物 的方法。
在另一个方面，本发明还4是供包含上述式I化合物或其缀合物 的组合物，所述组合物用于生物样品的染色。
在另一个方面，本发明还4是供使用上述式I化合物或其缀合物 或包含式I化合物的组合物以染色生物样品的方法。
本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图 和本发明的具体实施方式
之后将变得显而易见。


图1是化合物A、 B和已知化合物M在乙醇中的光稳定性对比。 横坐标为时间(小时)，纵坐标为吸光度值保留百分数。所用光源为500W碘鴒灯；所用仪器为紫外可见分光光度计，型号Lambda35。 图2是化合物A、 B和已知化合物M在DMSO中的光稳定性对 比。横坐标为时间(小时)，纵坐标为吸光度值保留百分数。所用光 源为500W碘鴒灯；所用仪器为紫外可见分光光度计，型号Lambda 35。
图3是化合物A和已知化合物M在乙醇溶液中的吸收光谱和发 射光语。横坐标为波长(nm),纵坐标为吸光度和荧光强度的归一化 数值。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号Lambda 35;荧光分 光光度计，型号LS55。
—图4是化合物B和已知化合物M在乙醇溶液中的吸收光谱和发 射光语。横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸光度和荧光强度的归一化 数值。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号Lambda 35;荧光分 光光度计，型号LS55。
图5是化合物A在含不同浓度pET-32a (+)质粒DNA的水溶液 中的焚光发射光i普。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。化合 物A的浓度为3.3 nM。箭头表示DNA的浓度(ng/mL)变化从小到大 依次为0、 6.67、 13.33、 20、 26.67。所用仪器为荧光分光光度计， 型号LS55。
具体实施例方式
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。 本文中使用的术语"烷基"包括直链烷基和支链烷基。如提及 单个烷基如"丙基"，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如
"异丙基"，则只特指支链烷基。例如，"&.6烷基"包括C"烷基、
Cw烷基、曱基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适
用于本说明书中使用的其它基团。
本文中使用的术语"卣素"包括氟、氯、渙和碘。
本文中使用的术语"千基，，是指-CIVPh基团。当用"任选取代"修饰卡基时，指该千基可以未取代的形式存在，或者可被合适的取 代基在任何合适的位置取代。合适的取代基包括但不限于卣素、轻 基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卣代烷基、 氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基等，只要最终形成的化合物具有本 发明期望的性质。优选千基由卣素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨 基任选取代。
本文中使用Y表示负离子，其可为任何合适的负离子，包括但 不限于无机负离子或有机负离子，例如卣素离子、CIO" PF6-、 CF3S03-、 BF4-、乙酸根或对曱苯磺酸根负离子。
本发明的化合物及其缀合物
在一个方面，本发明提供了具有下列结构通式I的不对称菁类 荧光染料
其中
n为1、 2或3;
X为C (CH3)2、 O、 S或Se;
R,和R2各自独立选自H、 C!-,8烷基、-。1.6烷基-0115或卣素； 113为H、 &.18烷基、OR5、 -(^.6烷基-0115、 COOR5、 N02、 CN 或卣素；
R4为CV,8烷基、-&_6烷基-0115、苄基或卤素，所述苄基由选自 以下的取代基任选取代卣素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、 芳基、烷氧基、杂环基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
Rs为H或Cw8烷基； Y-为负离子。
优选n为1或2,更优选n为1 。
优选X为C (CH3)2、 O或S;更优选X为C (CH3)2或S;最优 选X为S。
优选R!和R2各自独立选自H、 (^.18烷基或卣素；更优选R,和 R2各自独立选自H或烷基；更优选R,和R2各自独立选自H或
烷基；更优选R,和R2各自独立选自H或Cw烷基；最优选& 和Rs均为H。
优选R3为H、 &.18烷基、OR5、 COORs或卣素；更优选R3为H、 C^2烷基、OR5、 COORs或卣素；最优选R3为H、 (^.6烷基、OR5、 COORs或卣素。
优选R4为烷基、千基或囟素，所述卡基由选自以下的取代 基任选取代卣素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧 基、杂环基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；更优选114 为Cw8烷基或者苄基，所述苄基由面素、羟基、巯基、氰基、硝基 或氨基任选取代；更优选IV为Cw2烷基或者千基，所述卡基由囟素、 羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；更优选R4为CV12烷基或 者千基，所述千基由卣素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取 代；最优选114为C^烷基或千基，所述千基由卣素、羟基、巯基、 氰基、硝基或氨基任选取代。
优选R5为H或Cl12烷基，更优选R5为H或C,.6烷基。
优选Y-为囟素离子、C1CV、 PF6'、 CF3S(V、 BF4-、乙酸根或对 曱苯磺酸根负离子。
本发明化合物可作为本文中所述的盐形式直接用于生物样品的 染色。或者，在一个实施方案中，本发明化合物可作为式I化合物的 衍生物的形式使用，所述衍生物包括但不限于缀合物。
典型地，缀合物在荧光激活细胞分选仪(FACS)中使用。本文中 使用的"缀合物"是指本发明荧光染料通过共价键与其它分子连接 而形成的化合物。可与本发明荧光染料缀合的分子可为与细胞或细 胞成分特异性结合的分子，包括但不限于抗体、抗原、受体、配体、 酶、底物、辅酶等。通常，测试样品与荧光缀合物温育一段时间， 使得该荧光缀合物与测试样品中的某些细胞或细胞成分特异性结
色步骤可依次进行多次，或用多种缀合物同时进行多种染色。染色 完成后，样品在荧光激活细胞分选仪中进行分析，其中激发光源激 发缀合物中的本发明荧光染料，而测定装置测定由激发的荧光染料 产生的发射光。
或者，在另一个实施方案中，该荧光缀合物还可用于固相免疫 测试，例如夹心型免疫测试。固相免疫测试的技术是本领域7>知的， 可由标准教科书获得。本发明的荧光缀合物可用作固相免疫测试中 的各种合适成分。
化合物的合成
在另一个方面，本发明还4是供合成上述式I化合物的方法。 该不对称菁类荧光染料的合成一般通过以下流程进行首先由 未取代或取代的2-曱基苯并噻唑、2-曱基苯并嚼唑或2,3,3-三曱基-3H-吲哚啉等原料开始，使其与取代或未取代的千基面化物反应，两者 的摩尔比为1: 1-2,在曱苯中回流12-36小时，可制得季铵盐中间体 II:II
其中X、 Rn 113和Y-如式I化合物中所述定义； 然后，将制得的季铵盐中间体II与连接分子缩合，可得到式III 化合物
其中X、 n、 Rp 113和Y-如式I化合物中所述定义，连接分子可 为N，N，-二苯基曱脒或其高级同系物；
通过与制备式II化合物类似的方法得到取代或未取代的4-曱基 喹啉季铵盐中间体，最后将其与式III化合物在吡啶或醋酐的作用下 回流，即可得到本发明的不对称菁类荧光染料。所得荧光染料可通 过本领域公知的分离和纯化技术回收，以达到需要的纯度d
本发明中使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技 术人员公知的方法或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简 单地制备得到。
应认识到，本发明化合物中的各种环取代基有 一 些可在上述步 骤进行之前或刚完成后，通过标准的芳族取代反应来引入或通过常 规的官能团修饰来产生，这包括在本发明的方法步骤方面。这种反 应和修饰包括例如取代基通过芳族取代反应的引入、取代基的还原、 取代基的烷基化和取代基的氧化。用于这些过程的试剂和反应条件 是化学领域公知的。芳族取代反应的具体实例包括用浓硝酸引入硝 基，用例如酰囟和路易斯酸(如三氯化铝)在Friedel Crafts条件下引 入酰基，用烷基卣和路易斯酸(如三氯化铝)在Friedel Crafts条件下 引入烷基，和引入卤素基团。修饰的具体实例包括通过例如用镍催化剂进行催化氢化或者用铁在盐酸存在下进行加热处理，将硝基还
原成氨基；将烷硫基氧化成烷基亚磺酰基或烷基磺酰基。
包含式I化合物的本发明荧光缀合物可通过任何本领域已知的常 规方法合成。
组合物
在再另一个方面，本发明还提供包含上述式I化合物或其缀合 物的组合物，所述组合物用于生物样品的染色。
本发明的组合物除包含式I化合物或其缀合物外，还可包含生
物样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、渗透压调节剂、pH调节
剂、表面活性剂等。本发明的组合物可作为水溶液形式存在，或者 可作为临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。
使用
在再另一个方面，本发明还提供使用上述式I化合物或包含式I 化合物的组合物以染色生物样品的方法，该方法包括使上述式I化合 物或其缀合物或包含式I化合物的组合物与生物样品接触的步骤。本 文中使用的术语"接触"可包括在溶液或固相中接触。
特点
由以上描述以及本领域技术人员^^知的常识，可了解本发明焚
光染料的各种优点，包括但不限于以下
(1) 本发明的荧光染料化合物分子中引入了空间位阻大的千 基，提高了染料的光稳定性，减小了因甲川链增长而导致的染料光 稳定性下降的问题；
(2) 本发明的荧光染料化合物在一端引入了喹啉环，与曱川链 相同的对称苯并噻唑和吲哚啉类菁染料相比，最大吸收波长可增加 约80nm,发射波长范围宽，可达650 nm-900 nm的近红外区，可避 免生物自身的荧光背景干扰，同时其染料摩尔消光系数大，灵敏度高，可应用于核酸标记、免疫4企测、血细胞分析等各生物分析领域；
(3) 本发明的荧光染料化合物没有过长的甲川链，因此结构简 单，原料易得，毒副性小，成本低廉，易产业化；
(4) 本发明的荧光染料化合物可应用廉价、体积小、性能稳定 的红色半导体激光器作为光源，大大降低配套的仪器成本。
为了说明本发明的化合物对染料性能的优化改进，在实施例6, 7中以已知化合物M作为参照。M结构如下
M可通过以下合成路径来合成，也可参见Journal of the American Chemical Socitey (1945) 67, 18889-93。<formula>complex formula see original document page 17</formula>
实施例1
中间体l-苄基-2-曱基苯并噻唑季铵盐的合成
将20 mmol 2-曱基苯并瘗唑和22 mmol溴化卡加入到50 ml含20 ml曱苯的圆底烧瓶中，氩气保护。反应加热回流持续反应24小时后 停止。混合物冷却后过滤沉淀并用乙醚洗涤滤饼。干燥后得到淡粉 色的固体粉末，粗收率58%。
实施例2
化合物A的制备
在60 ml醋酸中，将lOmmol l-卡基-2-曱基苯并噻唑季铵盐与30 mmol N,N，-二苯基曱脒于90。C油浴上加热搅拌1.5小时。将反应得 到的红色油状物用石油醚悬浊洗涤3次，除去醋酸。然后加入一定 量的乙醚析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将此粗产品通过硅胶柱 分离，用洗脱液二氯曱烷:曱醇=100:3，收集黄色组分，收率42%。
向其中加入l-卡基-4-曱基喹啉季铵盐4mmo1及吡咬10ml, 90。C油 浴上加热搅拌1.5小时。将反应液倒入乙醚中，析出暗紫色小颗粒， 过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷:甲醇- 100:5， 收集蓝色组分，得到标题化合物，收率70%。
tH-NMR 5 (400 MHz, CD3OD, TMS) 5.49 (s， 2H)， 5.71 (s, 2H), 6.44 (d, 1H), 6.98 (d， 1H), 7.18-7.80 (m, 18H), 8.23 (t, 1H), 8.31 (d, 1H), 8.36 (d, 1H)。 MS (EI) C33H27BrN2S m/z: 483.2 [M-Br〗+。
实施例3
化合物B的制备<formula>complex formula see original document page 18</formula>在60ml醋酸中，将10mmo1 l-(4-氟)-卡基-2-曱基苯并噻唑季铵 盐与30 mmol N,N，-二苯基曱脒于90°C油浴上加热搅拌1.5小时。将 反应得到的红色油状物用石油醚悬浊洗涤3次，除去醋酸。然后加 入一定量的乙醚析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将此粗产品通过 硅胶柱分离，用洗脱液二氯曱烷:曱醇=100:3,收集黄色组分，收率 47%。向其中加入l-(4-氟)-千基-4-曱基喹啉季铵盐5mmo1及吡啶 10ml, 90°C油浴上加热搅拌l.5小时。将反应液倒入乙醚中，析出 暗紫色小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯 曱烷:曱醇=100:5，收集蓝色组分，得到标题化合物，收率65%。 'H國NMR 5 (400 MHz, CD3OD,TMS) 5.46 (s, 2H), 5.68 (s, 2H), 6.45 (d，
1H), 6.97 (d, 1H), 7.05-7.76 (m, 16H), 8.18 (t, 1H), 8.30 (d, 1H), 8.37 (d, 1H)。 MS (EI) C33H25BrF2N2S m/z: 519.2 [M-Br] +。实施例4
化合物c的制备
将10mmo1 l-(4-曱氧基)-千基-2-曱基苯并噻唑季铵盐与14 mmol N, N，-二苯基甲脒在40 ml醋酸中，于90°C油浴上加热搅拌2小时。 将反应得到的红色油状物用石油醚悬浊洗涤3次，除去醋酸。然后 加入一定量的乙醚析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将此粗产品通 过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷:甲醇=100:3.5,收集黄色组分， 收率35%。向其中加入l-乙基-4-曱基喹啉季铵盐3 mmol及吡咬8 ml， 90°C油浴上加热搅拌1小时。将反应液倒入乙醚中，析出暗紫色小 颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯曱烷:甲醇= 100:6，收集蓝色组分，收率75%。
^-NMR 5 (40Q MHz， CD3OD, TMS) 1.23 (t, 3H), 3.76 (tetra, 2H), 3.69 (s， 3H), 5.69 (s, 2H), 6.44 (d， 1H), 6.98 (d, 1H), 7.18-7.90 (m, 12H)， 8.23 (t, 1H), 8.31 (d, 1H), 8.36 (d, 1H)。 MS (EI) C29H27IN2OS m/z: 451.2 [M-
I]+。
实施例5
化合物D的制备<formula>complex formula see original document page 20</formula>
将lOmmol l-(4-羧基)-千基-2,3,3-三甲基苯-3H-吲哚啉季铵盐与 15 mmol N,N，-二苯基曱脒在40ml醋酸中，于90°C油浴上加热搅拌 1.5小时。将反应得到的红色油状物用石油醚悬浊洗涤3次，除去醋 酸。然后加入一定量的乙醚析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将此 粗产品通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯曱烷:曱醇=100:4,收集黄色 组分，收率37%。向其中加入1,4-二曱基喹啉季铵盐4 mmol及醋酐 8 ml， 90°C油浴上加热搅拌2小时。将反应液倒入乙醚中，析出暗 紫色小颗粒，过滤，干燥。染泮+通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲 烷:曱醇=100:20,收集紫色组分，收率68%。
iH-NMR 5 (400 MHz, CD3OD, TMS) 1.73 (s， 6H), 3.80 (s， 3H), 5.49 (s, 2H) 6.44 (d, 1H), 6.96 (d, 1H) 7.21-7.80 (m, 12H), 8.22 (t, 1H), 8.32 (d,
1H), 8.36 (d, 1H)。 MS (EI) C31H29IN202 m/z: 461.2 [M-I]+。
实施例6 化合物E的制备
<formula>complex formula see original document page 20</formula>
将8 mmol l-千基-2-曱基苯并噻唑季铵盐与10 mmol丙二醛缩苯
胺盐酸在20 ml溶剂(醋酸:醋酸酐=1:1)中加热到120°C,反应1小 时后，冷却，加入乙酸乙酯析出固体。过滤，乙酸乙酯沖洗3次， 除去未反应的过量的缩合剂。干燥，得棕黄色粉末，粗收率79%。 向其中加入l-(4-硝基)-千基-4-甲基喹淋季铵盐6 mmol及醋酐10 ml, 120°C油浴上加热搅拌1.5小时。将反应液倒入乙醚中，析出暗紫色 小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯曱烷:曱 醇=100:10，收集蓝色组分，收率43%。
!H國NMR 5 (400 MHz, CD3OD, TMS) 5.49 (s， 2H), 5.72 (s, 2H),6.24 (d, 1H), 6.37 (d, 1H), 6.48 (t, 2H), 8.29 (t, 1H), 7.22-7.85 (m， 17H), 8.38 (d, 1H), 8.45 (d, 1H)。 MS (EI) C35H28BrN302S: m/z: 554.2 [M誦Br] +。
实施例7
化合物A、 B和M在乙醇和DMSO中的光稳定性测定
将化合物A、 B和M分别配成1 x 1(T5M的甲醇和DMSO溶液 装入可以密封的比色皿中。使用50g/L的亚滩酸钠溶液盛于一个长方 体玻璃缸中^L截止滤光器，滤去波长小于400 nm的紫外光。另外， 亚硝酸钠溶液也能起到冷阱的作用，使样品的温度保持常温。测定 样品的初始吸光度值后，选用500W碘鴒灯作为光源，距离样品20 cm 处，通电光照，计时。每隔l小时后，测量样品光照后的吸光度值。 如图l和2所示，经过6小时光照后，已知化合物M在乙醇和DMSO 中分别褪色38%和54%;化合物A分别褪色16%和45%;化合物B 分别褪色21%和48%。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号Lambda 35。
数据显示，本发明化合物相对已知化合物，显示出明显较高的 光稳定性。
实施例8
化合物A、 B和M在乙醇中的荧光量子产率的测定
配置一定浓度的化合物A、 B和M的乙醇溶液，满足经紫外可见分光光度计测定最大吸收值<0.1。分别选定激发波长测定荧光强
度。平行测定三次，算出荧光量子产率，取平均值。以罗丹明B作 为标准物(Of = 0.97,乙醇)计算，在乙醇溶液中已知化合物M的荧 光量子产率0F = 0.44 x 10-2; A的荧光量子产率0>F = 0.76 x 10'2; B 的荧光量子产率①F = 0.55 xlO-2。如图3和4分别为化合物A和M, B和M在乙醇中的吸收和发射光i普。所用仪器为紫外可见分光光度 计，型号Lambda 35;荧光分光光度计，型号LS 55。
数据显示，本发明化合物相对已知化合物，显示出较高的荧光 量子产率。
实施例9
化合物A在含不同浓度DNA的水溶液中荧光强度的测定
配制浓度为1 x 10-4 M的化合物A的DMSO溶液，取lOO^L加 去离子水稀释至3mL置于比色皿中，测定其荧光强度。然后，取浓 度为10ng/|iiL的pET-32a (+)质粒DNA 2 滴加到上述比色皿中， 稳定后测定其荧光强度。如此继续滴加该DNA并测定荧光强度值， 结果见图5,随着DNA浓度的增大，荧光逐渐增强。同时，染料发 射光谱与加入DNA之前相比出现lOnm左右的红移。测试温度为0-5°C;所用仪器为荧光分光光度计，型号LS55。根据图5可知，本 发明荧光染料产生的荧光强度与DNA的浓度呈浓度依赖性，从而可 用于细胞内核酸的染色。
权利要求
1.一类荧光染料，所述染料具有如下结构通式I其中n为1、2或3；X为C(CH3)2、O、S或Se；R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5或卤素；R3为H、C1-18烷基、OR5、-C1-6烷基-OR5、COOR5、NO2、CN或卤素；R4为C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5、苄基或卤素，其中苄基由选自以下的取代基任选取代卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；R5为H或C1-18烷基；Y-为负离子。
2. 权利要求1的化合物，其中&和112独立选自H、 C1－18烷基 或卣素；优选R1和R2均为H。
3. 权利要求1-2中任一项的化合物，其中113为H、 C1－18烷基、 OR5、 COOR5或卣素；优选R3为H、 C1－C6烷基、OR5、 COOR5或卣素。
4. 权利要求1-3中任一项的化合物，其中114为<^.18烷基、千基 或囟素，所述千基由选自以下的取代基任选取代面素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；优选R4为C"6烷基或卡基，所述千基由 卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代。
5. 权利要求1-4中任一项的化合物，其中115为H或Cw2烷基， 优选R5为H或C^烷基。
6. 权利要求1-5中任一项的化合物，其中X为C (CH3)2、 O或 S;优选X为C(CH3)2或S。
7. 权利要求1-6中任一项的化合物，其中n为1或2。
8. 权利要求1-7中任一项的化合物，其中Y-为卣素离子、CKV、 PF6-、 CF3S03-、 BF4-、乙酸根或对曱苯磺酸负离子。
9. 权利要求1-8中任一项的化合物，其中所述化合物为<formula>see original document page 3</formula><formula>see original document page 3</formula>
10. —种缀合物，其特征在于，所述缀合物中包含权利要求1-9 中任一项的化合物。
11. 一种合成权利要求1-9中任一项的化合物的方法，所述方法包括1)使未取代或取代的2-曱基苯并噻唑、2-曱基苯并噁唑或2，3,3-三曱基-3H-吲咮啉与取代或未取代的千基自化物反应，得到季铵盐中 间体II:II2)将l)中得到的季铵盐中间体II与N,N，-二苯基曱脒或其高级同系物缩合，可得到式m化合物:3) 通过与制备式II化合物类似的方法，得到取代或未取代的4-曱基喹啉季铵盐中间体；4) 将3)中得到的4-曱基喹啉季铵盐中间体与式III化合物回流， 得到式I化合物；其中X、 n、 Rt、 R2、 R3、 R4、 R5和Y-如权利要求1-9中任一项的定义。
12. —种用于生物样品染色的组合物，其特征在于所述组合物包 含权利要求1-9中任一项的化合物或权利要求10的缀合物。
13. —种染色生物样品的方法，所述方法包括将权利要求1-9中 任一项的化合物、权利要求10的缀合物或权利要求11的组合物与 生物样品接触。
全文摘要
本发明提供了一种式I的不对称菁类荧光染料，其中X、n、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和Y^-如说明书中的定义。本发明还提供了该荧光染料的缀合物、制备方法、包含这种荧光染料的组合物和使用这种荧光染料或其组合物进行生物染色的方法。
文档编号G01N1/30GK101343420SQ200710137258
公开日2009年1月14日 申请日期2007年7月12日 优先权日2007年7月12日
发明者彤 吴, 孙世国, 彭孝军, 兵 徐, 樊江莉, 王炳帅, 邵建辉 申请人:大连理工大学;深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司