专利名称：一种定量检测人自身抗体的化学发光配体分析方法
技术领域：
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本发明涉及生物医学技术领域，是一种用于体外定量检测人体内自身抗体的化 学发光配体(纳米磁颗粒)定量分析方法。
背景技术：
自身免疫性疾病(Autoimmune diseases)是指机体对自身抗原发生免疫反应而 导致自身组织、器官损伤和相应功能障碍所引起的一大类疾病。目前已被公认的自 身免疫疾病至少有30多种。人体的生长、发育和生存有完整的自身免疫耐受机制的 维持，正常的免疫反应有保护性防御作用，即对自身组织、成分不发生免疫反应。 一旦自身耐受的完整性遭到破坏，则机体视自身组织、成分为"异物"，从而发生 自身免疫反应，产生自身抗体。因此人自身抗体是指人体对自身组织、器官、细胞 及细胞成分发生免疫反应而产生的抗体。
正常人体液中可以有低滴度的自身抗体，但不会发生疾病。伹如果自身抗体的 滴度超过一定水平，就可能对身体产生损伤，诱发疾病。自身抗体的产生可能是致 病抗原(细菌、病毒等)与自身成分之间存在某些相同的分子结构出现了与自身抗 原发生交叉反应的免疫应答；也可能是某些感染因素使自身抗原变性，免疫系统对 这些暴露的新抗原产生自身抗体。 一些特定自身抗体的定量检测对于许多疾病的珍 断、预防、治疗及疗效评价都具有十分重要的意义。如甲状腺过氧化物酶自身抗体 (TPO-Ab)、甲状腺球蛋白自身抗体(TG-Ab)、甲状腺微粒体自身抗体(TM-Ab) 和谷氨酸脱羧酶65自身抗体(GAD65-Ab)、胰岛细胞自身抗体(ICA)、胰岛素自 身抗体(IAA)等，下面以甲状腺过氧化酶物自身抗体(TPO-Ab)为例作具体说明。
甲状腺过氧化物酶(TPO)是甲状腺细胞中的膜结合酶，分子量约为100KDa， 它是三种甲状腺抗原之一，对甲状腺荷尔蒙合成有重要作用。TPO自身抗体通过细 胞介导和抗体依赖的细胞毒作用使甲状腺激素分泌不足造成自身免疫相关的甲状腺 机能减退，自身免疫性甲状腺疾病的一个特点就是存在甲状腺抗原的自身抗体。因 而，TPO自身抗体的检测有助于确定慢性自身免疫性甲状腺炎和对甲状腺功能减退 分型。TPO自身抗体检测对甲亢也有重要价值，尤其是临床症状有怀疑而 TSH-REZAK⑧检测阴性的病例。另外对甲状腺功能正常的甲状腺肿排除并生的甲状 腺自身免疫疾病有帮助。
目前国内的自身抗体检测试剂盒大多采用ELISA技术，如武汉博士德生物工程 有限公司TPO自身抗体检测试剂盒采用ELISA技术。ELISA方法主要采用TPO抗 原包被微孔板，与TPO自身抗体反应后通过加入酶标记第二抗体和显色底物进行检 测，属于间接法进行定性检测。该方法无法对自身抗体进行准确定量，因此不能为 自身免疫性疾病的诊断及疗效评价提供可靠依据。北京倍爱康生物技术股份有限公 司提供了 一种人甲状腺过氧化物酶抗体酶联免疫检测方法用重组人甲状腺过氧化 物酶抗原包被免疫磁珠作为固相，使之与自身抗体反应后进行固液分离，然后加入碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG抗体(第二抗体)和底物进行显色检测，该方法属 于ELISA间接法测定。
本发明采用酶促化学发光免疫分析技术及自创的葡萄球菌蛋白A包被纳米磁颗 粒配体技术，利用葡萄球菌蛋白A能与人和小鼠体内的免疫球蛋白IgG的Fc结合 位点发生反应的共同特性，用辣根过氧化物酶标记的抗原分别与标准品中的单克隆 抗体以及样品中的人血清自身抗体结合形成抗原-抗体免疫复合物。然后在包被于纳 米磁颗粒表面的蛋白A作用下形成三明治式复合体系，用单克隆抗体标准品建立标 准曲线，建立配体法化学发光免疫定量分析方法，用于自身免疫性疾病的诊断及治 疗效果的观察。本方法属于直接法定量检测，可以准确定量检测自身抗体的浓度。 本方法中作为标准品的单克隆抗体与血清样品中的自身抗体并不进入同一反应体 系，只是利用了它们具有与蛋白A特异性结合的共性进行对照，因此不会发生交叉 反应，所以检测效果具有特异性强、灵敏度及准确度高等优点，且不会出现假阴性 或假阳性现象。
发明内容
本发明的目的在于建立一种人血清中自身抗体的快速、准确的定量检测技术平 台，可用于多种自身抗体的定量检测。
一种定量检测人自身抗体的化学发光配体分析方法，将化学发光免疫定量检测 CLIA技术与纳米磁颗粒配体技术相结合，是一种基于配体检测原理的直接测定方 法，其核心在于巧妙地利用葡萄球菌蛋白A (SPA)能与人和小鼠体内的免疫球蛋 白IgG的Fc结合位点发生反应的共同特性，用自创SPA包被纳米磁颗粒配体技术 建立自身抗体的化学发光配体定量免疫分析方法。下面以甲状腺过氧化酶物 (Thyroid peroxidase, TPO)自身抗体(TPO-Ab)的定量检测为例作具体说明。
首先将蛋白A包被于纳米磁颗粒表面，利用高亲和力、高特异性的单克隆抗体 配制标准品(用以建立标准曲线)，用相对过量的标记抗原(高度纯化的TPO-HRP) 分别与标准品中的TPO单克隆抗体及血清样品中的TPO自身抗体结合形成免疫复 合体。该复合体在包被于纳米磁性颗粒表面的蛋白A的作用下，形成三明治式复合 体系，因为蛋白A会被(TPO-Ab)-TPO-HRP免疫复合体的Fc部分结合。其中蛋白 A部分包被于纳米磁性颗粒表面上，从而形成一个固相，以磁板进行固液相分离。
吸去含有未结合标记物的上清液并洗珠后，加入增强型化学发光底物工作液， 工作液中的发光底物鲁米诺在辣根过氧化物酶(HRP)的催化和发光启动试剂 (NaOH+H202)作用下发光。鲁米诺的最大发射光波长为425nm,由于鲁米诺体系的 发光为闪光型且信号较弱，因此我们使用四苯硼钠和肉桂酸作为联合增强剂以增强 发光信号。发光强度依赖于免疫反应中辣根过氧化物酶的浓度。反应20min后测定 其相对发光值RLU，用TPO单克隆抗体配制的标准品建立标准曲线，可从标准曲 线上查出病人TPO自身抗体的浓度值。
样品或标准品中TPO-Ab浓度越高则标记物特异性结合越多，因此所检测到的 发光强度也越强，即其相对发光值RLU是与TPO-Ab浓度成正比的。在样品中没有TPO-Ab的情况下无免疫体系形成，因为酶标记物仅结合TPO-Ab,而不结合蛋白A。 本方法中作为标准品的单克隆抗体与血清样品中的自身抗体并不进入同一反应 体系，只是利用了它们具有与SPA特异结合的共性进行对照，因此不会发生交叉反 应，所以检测效果具有特异性强、灵敏度及准确度高等优点，且不会出现假阴性或 假阳性现象。本方法成功地解决了自身抗体无法准确定量检测的难题，是未来标记 免疫分析技术发展的新方向。
定量检测人自身抗体的化学发光配体分析方法，以TPO自身抗体为例，其研制 方法如下
1) 试剂盒组成成分
TPO-Ab化学发光配体定量免疫分析诊断试剂盒的主要组分为标记物一一
TPO-HRP,标准品——TPO单克隆抗体，配体试剂——SPA-纳米磁颗粒，增强型化 学发光底物工作液——A液和B液，洗涤液；
2) 试剂盒各组分的制备
(1) 辣根过氧化物酶HRP标记抗原TPO的制备在过碘酸钠的作用下，用HRP 标记TPO形成TPO-HRP:采用透析法和HPLC进行二次纯化；
(2) 特异性单克隆抗体的制备通过细胞融合杂交瘤技术制备TPO单克隆抗体 (TPO-Ab)，将其作为绘制参照曲线的标准品；
(3 )葡萄球菌蛋白A(SPA) —纳米磁颗粒制备将SPA通过碳二亚胺包被于有机石丄 烷化磁性纳米粒子表面； (4)增强化学发光底物工作液的优化配制以鲁米诺为发光底物，采用四苯硼钠、
肉桂酸和鲁米诺按一定比例配制作为增强型化学发光底物工作液以提高发光强度；
3) TPO-Ab化学发光配体(纳米磁颗粒)定量分析方法及临床检测标准的建立
(1) 建立人血清中TPO-Ab的化学发光配体(纳米磁颗粒)定量分析方法，并制定该 试剂盒的实验操作方法及质量控制标准；
(2) TPO-Ab化学发光配体定量分析诊断试剂盒的小试及部分临床实验
采集临床标本，用本试剂盒测定受检者血清中TPO-Ab的准确含量，大量临床 试验结果显示，其临床符合率》95%;因此，本试剂盒的TPO-Ab临床测定值，可 为自身免疫性甲状腺疾病诊断、早期干预治疗、正确用药及疗效评价提供可靠依据；
4) 建立一个成熟、灵敏、高效的自身抗体化学发光配体(纳米磁颗粒)定量检测技 术平台，可利用本方法开发大量的人自身抗体系列化学发光配体(纳米磁颗粒)定 量分析诊断试剂盒，形成一个全新的自身抗体化学发光配体(纳米磁颗粒)定量检 测试剂盒的研发和生产体系。
定量检测人自身抗体的化学发光配体分析方法，以TPO自身抗体为例，本试剂
盒的实验操作程序如下
(1) 将实验所需试剂及样本放置室温，平衡至少30分钟以上才可进行操作；
(2) 取一块微孔板进行编号，所有实验均做双孔重复；
(3) 取各个浓度的标准品、质控血清和样品25-20(^1加入相应编号的孔中；
(4) 每孔均各加入50~200pl TPO-HRP;(5) 倒置充分混匀SPA-纳米磁颗粒，每孔均各加入25 150plSPA-纳米磁颗粒；
(6) 充分混匀，室温振荡1 4小时；
(7) 将其放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；
(8) 去除磁板，每孔均各加入200~1000nl洗板液；
(9) 振荡4 15秒后，将其放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；
(10) 重复一遍步骤8、 9;
(11) 每孔各加入发光增强A液100-300^1;
(12) 每孔加各入发光增强B液100~300pl;
(13) 用化学发光仪测定每孔的发光强度；
(14) 从标准曲线上读取样品及质控血清的浓度。
图1 SPA结合率图
图2 TPO-Ab化学发光配体(纳米磁颗粒)定量分析原理示意图
具体实施例方式
本方法的内容，通过以下实施例作具体说明 TPO自身抗体化学发光配体(纳米磁颗粒)定量分析方法的建立 (一)试剂盒各组分的制备
TPO-Ab化学发光配体定量分析诊断试剂盒主要组分为标记物(TPO-HRP), 标准品(TPO单抗)，配体试剂(SPA-纳米磁颗粒)，增强型化学发光工作液，洗涤 液。 _ 1、标记抗原(TPO-HRP)的制备及检测 a、制备采用过碘酸钠酶法标记技术制备TPO-HRP:
(1)称取TPO 2.0mg放入5ml玻璃瓶内，加入l.Oml ( 0.05mol/L， pH7.5 )碳酸 盐缓冲液溶解，4'C储存备用；
(2 )称取10.0mg的HRP放入一只16xl00mm玻璃试管内，加入l.Oml去离子水， 振荡，待其完全溶解后，取出0.74ml放入另一只16xl00mm玻璃试管内，加入 0.lmol/L的NaI04溶液0.2ml (NaI04溶液必须新鲜配制)，用胶塞将玻璃试管口塞 紧，室温下避光反应2小时；
(3)取出已溶解好的TPO抗原(步骤l)加入至得自步骤(2)的混合液中，室 温下避光反应3小时；
(4 )加入浓度为5mg/ml的用O.lmmol NaOH溶解的NaBH4溶液(NaBH4必须新 鲜配制)，室温下避光反应0.5小时；
(5 )将上述反应液装入透析袋中，用0.01 mol/LPBS pH7.5缓冲液进行透析，4°C 放置过夜；
(6)更换透析液后再继续透析，4t:放置过夜；
(7 )收集反应液加入等体积的含10%BSA的O.Olmol/LPBS pH7.5缓冲液；
8(8 )用高压液相色谱法进行二次纯化，收集蛋白峰1.47ml并于-20'C下冷冻保存。 b、 HRP标记抗原的纯度检测用紫外分光光度法测得HRP浓度为0.78mg/ml， TPO 浓度为1.35mg/ml。
因此其摩尔浓度之比为HRP:TPO( 0.78+40000) : ( 1.35+100000)=1.44:1.00。 结合物中酶总量=0.78mg/mlx 1.47ml = 1.15 mg 酶结合率(％) =(1.15 mg〃.4 mg) x 100%= 15.54% 抗原标记率(1.35mg/mlx 1.47ml )/2.0 mgxl00%=99.23%
"酶标抗原的活性检测
用琼脂扩散法使酶标抗原与TPO单克隆抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1天， 再以蒸馏水浸泡l小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，结果出现较强的颜 色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶活性，也有抗体活 性。结合物在显色后，琼扩滴度达1:26，表明酶标抗原性能良好。 d、酶标抗原工作浓度的确定
用O.Olmol/LPBS缓冲液(pH=7.5)将酶标抗原分别按1:500、 1:750、 1:1000、 1:1500和1:2000、 1:2500、 1:3000、 1:4000和1:5000的倍数稀释，以CLIA方法 进行方阵滴定，结果显示当稀释度为1:3000时反应模式最好，也说明酶标抗原具有 良好的酶活性及抗原活性。因此确定酶标抗原的工作浓度为 1.35mg/ml+300(^0.45吗/ml。
2、 TPO单克隆抗体的制备及性能检测 (O抗原提纯与动物免疫
甲状腺过氧化物酶(TPO)加完全福氏佐剂并经充分乳化，选择与所用骨髓瘤细 胞同源的BALB/c健康小鼠进行动物免疫。末次免疫后3 4天，分离融合后的脾细 胞。
(2) 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备
采用Sp2/0骨髓瘤细胞株进行培养，在融合前先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适 应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2xl0S/ml，次日一般即为 对数生长期细胞。采用小鼠腹腔细胞为饲养细胞(feedercell)。
(3) 细胞融合
将骨髓瘤细胞与脾细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后用培养液稀释 PEG,消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。
(4) 有限稀释法筛选阳性细胞株 筛选阳性株选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株。融合细胞呈克隆生长，经有
限稀释后吸取培养上清，用ELISA检测抗体含量。筛选出高抗体分泌孔，将孔中细 胞再进行克隆化，然后进行抗原特异的ELISA测定，选择高分泌特异性细胞株进行 扩大培养或冻存。
(5) 单克隆抗体的制备和冻存
抗体制备采用小鼠腹腔接种法，选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠进行腹腔注射。 通常在接种一周后即有明显的腹水产生。选出阳性细胞株并及早冻存。(6) 单克隆抗体的纯化
用葡萄球菌蛋白A亲和层析柱纯化单克隆抗体，回收率达90%以上。洗脱液中 的抗体浓度用紫外光吸收法粗测。经低pH洗脱液洗脱后在收集管内预置中和液或 速加中和液，以保持纯化抗体的活性。
(7) 单克隆抗体的性能检测 我们对单克隆抗体的滴度、纯度及特异性和亲和力等进行了全面鉴定,其主要技
术指标如下-
TPO单克隆抗体主要技术指标
ELISA滴度1: (1.21X105)
检测灵敏度<4.93pg/mL
交叉反应率<0. 1%
亲和常数5.16xl0，1
滴度检测以TPO为检测抗原，通过间接ELISA法测定抗体滴度，其滴度(于 1.0mg/ml) =1: (1.12x105)。
纯度检测经提取纯化后用非还原SDS-PAGE法检测单抗纯度，结果在160 kD 左右有一条清晰的条谱带，经蛋白A亲和层析其纯度达95%以上。
特异性抗TPO单抗的特异性良好，不与人血清A蛋A结合反应，来自ANA、 DNA以及风湿因子的干扰很小，交叉反应率<0.1%。
亲和力检测根据Beatty等人所建立的方法，以5、 2.5、 1.25和0.625pg/ml 4 个浓度TPO稀释液依次包被微孔板,通过作图法取其最大OD值一半(即OD的50%) 处对应的抗体浓度。代入公式K= (n - 1) /2 ( nAb，-Ab)计算亲和常数,式中Ab和Ab' 分别表示当抗原浓度为Ag和Ag，时，产生半数吸光值的抗体浓度(mol/L)，i^Ag/Ag'。 求其平均数得亲和常K-5.16xlO^M—1。 3 、 SPA—纳米磁颗粒的制备
(1) SPA—纳米磁颗粒的制备我们对纳米磁颗粒与SPA的反应比例进行了一系列 探讨试验。具体制备方法如下
① 取5 mg有机硅垸化磁性粒子，用重蒸水洗1 - 2次；
② 用0.02mol/LpH5.6-6.2的PBS洗一次；
③ 用0.02mol/LpH5.6-6.2的PBS调整总体积约为10ml;
④ 加一定量SPA放在摇床上进行匀化10—20分钟，SPA的具体质量根据纳米 磁颗粒与SPA的反应质量比而定；
加入碳二亚胺(EDC )约5. Omg;
◎室温反应，放在摇床上进行匀化10小时；
⑦ 用0.1mol/LpH7.4PBS+0.1。/。BSA洗涤三次；
⑧ 用重蒸水洗3次；
⑨ 用0.lmoI/L pH7.4PBS洗3次；
⑩ 用0.05mol/LTris+0.004mol/LEDTApH7.5缓冲液洗3次； 用0.05mol/L Tris+0.004mol/L EDTA pH 7.5缓冲液定容为1.0mg/ml， 2-4°C
保存，待用。
(2) SPA结合量的测定SPA结合量一般以每毫升或每克有机硅烷化纳米磁颗粒偶 联SPA的量表示，其数值可用作决定亲和吸附剂实际用量的参数，采用直接测定法 测定结合量。
将纳米磁颗粒与SPA按不同比例进行包被反应，测定SPA的结合率。测定结果 显示，当磁颗粒与SPA的比例至1:50时，SPA的结合量近乎饱和，因此，我们所 采用的磁颗粒与SPA的比例为1:50。
SPA结合率测定结果
纳米磁颗粒/SPA1:51:101:201:501:751:100
SPA结合率(。/。)25.6438.1347.1862.7163.7664.97
4、 增强型化学发光底物工作液的配制
(1) 配制0.05 mol/L pH 9.0的Tris-HCl缓冲液
(2) A液在上述Tris-HCl缓冲液中加入4.58mmol/L鲁米诺。
(3) B液在上述Tris-HCl缓冲液中加入以下物质
① 0.81 mmol/L四苯硼钠；
② 0.38 mmol/L肉桂酸；.
③ 7.56mmol/L过氧化氢。
5、 洗涤液的配制
① TrisBase 6.05g/L;
② NaCl 8.55/L;
③ Tween-20 0.5ml/L;
④ 用HCl调pH至7.8士0丄 (三)试剂盒实验操作方法及步骤
建立TPO-Ab化学发光配体定量分析方法，采取的实验操作步骤如下
(1) 将实验所需试剂及样本放置室温，平衡至少30分钟以上才可进行操作；
(2) 取一块微孔板进行编号，所有实验均做双孔重复；
(3) 取各个浓度的标准品、质控血清和样品25 200nl加入相应编号的孔中；
(4) 每孔均各加入50~200pl TPO-HRP;
(5) 倒置充分混匀SPA-纳米磁颗粒，每孔均各加入25 150plSPA-纳米磁颗粒;
(6) 充分混匀，室温振荡1 4小时；
(7) 将其放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；
(8) 去除磁板，每孔均各加入20(M000nl洗板液;
(9) 振荡4 15秒后，将其放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；
(10) 重复一遍步骤8、 9;
(11) 每孔各加入发光增强A液100-30(^1;(12) 每孔加各入发光增强B液100~300pl;
(13) 用化学发光仪测定每孔的发光强度；
(14) 从标准曲线上读取样品及质控血清的浓度。
本试剂盒灵敏度可达0.1U/mL，且无明显交叉反应，准确度达95-105%，标准 曲线满足临床标本所需的测量范围为0. l-2000U/mL，临床符合率>95%。
1、自身免疫性甲状腺疾病及对照组TPO-Ab检测结果比较
组别例数检出例数检出率
甲亢组14313896.50%
甲低组13212695.45%
正常人组11700
2、临床结果分析统计
甲几甲低备注
灵敏度(真阳性率)96.50%95.45%
特异度(真阳性率)100%100%
假阳性率0%0%
假阴性率3.50%4.55%
粗一致性(Crude agreement)98.08%97.59%
调整一致性(adjusted agreement)98.10%97.64%
约登指数(youden's index)0.96500.9545
阳性试验的预示值100%100%
阴性试验的预示值95.90%95.12%
用本试剂盒测定受检者血清中TPO-Ab的含量，正常人血清中TPO-Ab检出率 为0;甲亢患者组TPO-Ab检出率为96.50%;甲低患者组TPO抗体检出率为95.45%。 因此，本试剂盒的TPO-Ab临床测定结果，具有灵敏度及准确度高，特异性强，检 测结果准确可靠等优点，可为自身免疫性甲状腺疾的病早期诊断、早期干预治疗、 正确用药及疗效评价提供可靠依据，对自身免疫性甲状腺疾的治疗具有十分重要的 意义。
权利要求
1、一种定量检测人自身抗体的化学发光配体分析方法，其特征在于将化学发光免疫定量检测CLIA技术与纳米磁颗粒配体技术相结合，是一种基于配体检测原理的直接检测方法，其核心在于巧妙地利用葡萄球菌蛋白A(SPA)能与人和小鼠体内的免疫球蛋白IgG的FC位点发生反应的共同特性，用自创的SPA包被纳米磁颗粒配体技术建立自身抗体的化学发光配体定量分析方法。
2、 根据权利要求1所述的一种定量检测人自身抗体的化学发光配体分析方法，以 TPO自身抗体为例，其特征在于首先将葡萄球菌蛋白A包被于纳米磁颗粒表面； 利用自己制备的高亲和力、高特异性的TPO单克隆抗体配制标准品以建立标准曲'线，让标准品中的TPO单抗和血清样品中的自身抗体分别与相对过量的酶标抗原 TPO-HRP反应形成(TPO-Ab)-TPO-HRP免疫复合体，用蛋白A包被的纳米磁颗粒 作为配体进行固液分离，因为蛋白A会被(TPO-Ab)-TPO-HRP免疫复合体的Fc部 分结合，从而形成一个固相，以磁板方法分离；通过辣根过氧化物酶(HRP)催化 的酶促化学发光反应进行发光检测；根据标准品的发光值建立标准曲线，可从标准 曲线上查出病人血清样品中TPO自身抗体的浓度值。
3、 根据权利要求2所述的一种定量检测人自身抗体的化学发光配体分析方法，其特 征在于作为标准品的单克隆抗体与血清样品中的自身抗体并不进入同一个体系， 只是利用了它们具有与蛋白A特异结合的共性进行对照，因此不会发生交叉反应， 检测结果准确可靠，不会出现测量结果偏低的假阴性现象，解决了自身抗体检测无 法准确定量的难题。
4、根据权利要求2或3所述的一种定量检测人自身抗体的化学发光配体分析方法， 以TPO自身抗体为例，其特征在于研制方法为1) 试剂盒组成成分TPO-Ab化学发光配体定量免疫分析诊断试剂盒主要组分为标记物一一 TPO-HRP,标准品——TPO单克隆抗体，配体试剂——SPA-纳米磁颗粒，增强型化 学发光底物工作液——A液和B液，洗涤液；2) 试剂盒各组分的制备(1) 辣根过氧化物酶HRP标记TPO抗原的制备在过碘酸钠的作用下，用HRP 标记TPO形成TPO-HRP，采用透析法和HPLC进行二次纯化；(2) 特异性单克隆抗体的制备通过细胞融合杂交瘤技术制备TPO单克隆抗体 (TPO-Ab)，将其作为绘制参照曲线的标准品；'(3 )葡萄球菌蛋白A(SPA) —纳米磁颗粒制备将SPA通过碳二亚胺包被于有机硅 '垸化磁性纳米粒子表面； (4)增强化学发光底物工作液的优化配制以鲁米诺为发光底物，采用四苯硼钠、 肉桂酸和鲁米诺按一定比例配制作为增强型化学发光底物工作液以提高发光强度；3) TPO-Ab化学发光配体(纳米磁颗粒)定量分析方法及临床检测标准的建立(1) 建立人血清中TPO-Ab的化学发光配体(纳米磁颗粒)定量分析方法，并制定该 试剂盒的实验操作方法及质量控制标准；(2) TPO-Ab化学发光配体定量分析诊断试剂盒的小试及部分临床实验采集临床标本，用本试剂盒测定受检者血清中TPO-Ab的准确含量，大量临床 试验结果显示，其临床符合率》95%;因此，本试剂盒的TPO-Ab临床测定值，可 为自身免疫性甲状腺疾病诊断、早期干预治疗、正确用药及疗效评价提供可靠依据；4) 建立一个成熟、灵敏、高效的自身抗体化学发光配体(纳米磁颗粒)定量检测技 术平台，可利用本方法开发大量的系列人自身抗体化学发光配体(纳米磁颗粒)定 量分析诊断试剂盒，形成一个全新、高效的人自身抗体化学发光配体(纳米磁颗粒) 定量检测试剂盒的研发和生产体系。
5、 根据权利要求2或3所述的一种定量检测人自身抗体的化学发光配体分析方法， 以TPO自身抗体为例，其特征在于本试剂盒的实验操作程序为(1) 将实验所需试剂及样本放置室温，平衡至少30分钟以上才可进行操作；(2) 取一块微孔板进行编号，所有实验均做双孔重复；(3) 取各个浓度的标准品、质控血清和样品2S 200nl加入相应编号的孔中；(4) 每孔均各加入50 200^ilTPO-HRP;(5) 倒置充分混匀SPA-纳米磁颗粒，每孔均各加入25 150nlSPA-纳米磁颗粒；(6) 充分混匀，室温振荡1 4小时；(7) 将其放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；(8) 去除磁板，每孔均各加入200-1000^1洗板液；(9) 振荡4 15秒后，将其放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；(10) 重复一遍步骤8、 9;^ 11)每孔各加入发光增强A液100~300W;(12) 每孔加各入发光增强B液100~300nl;(13) 用化学发光仪测定每孔的发光强度；(14) 从标准曲线上读取样品及质控血清的浓度。
6、 根据权利要求4所述的一种定量检测人自身抗体的化学发光配体分析方法，以TPO自身抗体为例，其特征在于本试剂盒的实验操作程序为(1) 将实验所需试剂及样本放置室温，平衡至少30分钟以上才可进行操作；(2) 取一块微孔板进行编号，所有实验均做双孔重复；(3) 取各个浓度的标准品、质控血清和样品25 200pl加入相应编号的孔中；(4) 每孔均各加入50-200^1 TPO-HRP:(5) 倒置充分混匀SPA-纳米磁颗粒，每孔均各加入25 150plSPA-纳米磁颗粒；(6) 充分混匀，室温振荡1 4小时；(7) 将其放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；(8) 去除磁板，每孔均各加入200 1000nl洗板液；(9) 振荡4 15秒后，将其放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液;(10) 重复一遍步骤8、 9;(11) 每孔各加入发光增强A液100~300pl;(12) 每孔加各入发光增强B液100~30(^1;(13) 用化学发光仪测定每孔的发光强度；(14) 从标准曲线上读取样品及质控血清的浓度。
全文摘要
一种定量检测人自身抗体的化学发光配体分析方法，属于生物医学技术领域。本方法巧妙利用葡萄球菌蛋白A(SPA)能与人和小鼠体内IgG的Fc位点发生反应的共性，利用高亲和力、高特异性的单克隆抗体配制标准品以建立标准曲线，使单克隆抗体和样品中的自身抗体分别与酶标记抗原反应，用SPA包被的纳米磁颗粒作为配体进行固液分离，通过辣根过氧化物酶(HRP)催化的酶促化学发光反应进行发光检测，建立人自身抗体的化学发光配体定量分析方法。本发明适用于所有自身抗体的定量检测，解决了大多数自身抗体无法准确定量检测的难题，同时避免了交叉反应，也不会出现假阴性或假阳性现象。
文档编号G01N33/58GK101470117SQ20071006021
公开日2009年7月1日 申请日期2007年12月26日 优先权日2007年12月26日
发明者潘学继, 王立凯 申请人:天津市协和医药科技有限公司