专利名称：：动物源性食品中磺胺类药物多残留检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
：本发明属于食品检测分析
技术领域：
，尤其是一种动物源性食品中磺胺类药物多残留检测试剂盒及其检测方法。技术背景磺胺类药物的基本结构为对氨苯磺酰胺，具有芳氨基和磺酰胺基，多为两性化合物，药物具有一定酸性。磺胺类药物的抑菌作用是由于磺胺类药物中能分解出对氨基苯磺酰胺，其分子的大小和形状与组成叶酸中的对氨基苯甲酸相近，化学性质也类似。由于细菌对二者缺乏选择性，大量的对氨基苯磺胺替代了对氨基苯甲酸而被细菌吸收，干扰细菌叶酸的合成而影响其生长繁殖，从而可抑制大多数革兰氏阳性菌和某些阴性菌。磺胺类药物应用较广，具有一定疗效的就有几十种。在食源性动物的饲养中，磺胺类药物作为兽药被广泛用于兽医临床对细菌感染性疾病的防治。这类药物具有显著的毒性副作用，通过任何途径摄入都会在人体中蓄积，并可引起泌尿系统的损害，特别是在体内形成的乙酰化磺胺在酸性尿中溶解度很低，可在肾小管、肾盂、输尿管等处析出结晶，损害肾脏。磺胺类药物具有抗原性，刺激机体内抗体的形成，造成过敏反应，表现在皮炎，白细胞减少，溶血性贫血和药热。有资料表明，磺胺二甲嘧啶等一些磺胺类药物在连续给药中能够诱发啮齿动物甲状腺增生，具有潜在的致癌性。还可导致许多细菌产生抗药性，引起耐药菌株的增加。如果这类药物不按规定或要求使用与停药，动物体内的药物残留会随着食物链影响人体的健康，因此，欧盟、加拿大和美国规定所有磺胺类药物在可食组织和奶中总量的最高残留限量为100pg/kg，而日本规定为20pg/kg，并且具有逐步严格控制的发展趋势。长期食用有这些药物残留的动物性食品可能有害健康，引起慢性中毒。因此，各国政府对磺胺类药物在动物性食品中使用严格规定了MRL或ADI。2002年12月我国农业部公告第235号文规定在所有食品动物的肌肉、脂肪、肝和肾中最高残留限量为100pg/kg，并将其列为兽药残留监控的重点。目前，针对磺胺类兽药残留的检测方法有薄层色谱法(TLC)、高压液相色谱(HPLC)法、液质联用(HPLC/MS)、气相色谱法(GC)、酶联免疫吸附法(ELISA)和毛细管电泳法(HPCE)等。由于复杂的仪器设备和繁琐的前处理过程，仪器分析方法不适合现场监控和大量样本的筛选，其中ELISA方法作为一种新型的动物源性食品中磺胺类药物残留筛选方法已被使用，如中国专利申请(200510086777)，该方法与仪器分析技术相比虽然具有快速、简便的特点，但是它采用的是单克隆抗体及二抗酶技术和间接竞争免疫检测方法，在二抗酶技术中，二抗-酶与一抗结合反应、位点交叉问题，易引起非特异性结合，导致结合偏差致使灵敏度较差，而间接竞争免疫检测方法稳定性较差。
发明内容本发明的目的在于提供一种具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价的动物源性食品中磺胺类药物多残留检测试剂盒及其检测方法。本发明是通过以下技术方案来实现的一种动物源性食品中磺胺类药物多残留检测试剂盒，由盒体、包被板以及托架构成，包被板和托架固装在盒体内，其特征在于该托架上设置有-(1)磺胺类药物标准溶液凹孔其磺胺类药物标准溶液浓度为812mg/L，使用时用稀释液稀释至卯105ng/L后，再按l:3稀释六个梯度；(2)酶标记的磺胺类药物抗原工作液凹孔其酶标记的磺胺类药物抗原工作液使用时用酶标记的磺胺类药物抗原稀释液按1:200倍稀释；(3)酶标记的磺胺类药物抗原稀释液凹孔其酶标记的磺胺类药物抗原稀释液为磷酸盐缓冲溶液，pH7.4，使用时用二次水按1:5稀释；(4)底物显色剂A液凹孔其底物显色剂A液为含过氧化氢脲的醋酸钠缓冲液；(5)底物显色剂B液凹孔其底物显色剂B液为含3，3'，5，5'-四甲基对二氨基联苯(TMB)的二甲基亚砜溶液；(6)终止液凹孔其终止液为1.25mol/LH2S04;(7)浓縮洗涤液凹孔其浓縮洗涤液为1%吐温的磷酸盐缓冲液。而且，所述的包被板为96孔抗磺胺类药物多克隆抗体预包被板，并且其由微孔条组成，其制备是由含多抗的磷酸盐缓冲液(pH9.6)，包被2226小时，加入封闭液封闭、冻干、真空包装。而且，所述的封闭液为含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。而且，所述的多克隆抗体是选用雌性大白兔进行五次免疫后，由兔子的耳缘静脉采集血液进行效价检测，并离心获得抗血清，使用G-Sepharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化。而且，所述的托架为泡沫塑料材质或者纸制材质。一种动物源性食品中磺胺类药物多残留检测试剂盒的检测方法包括以下步骤(1).室温下样品的前处理；(2).所有试剂及标本在检测实验前必须置室温(20'Ci5。C左右)，将试剂盒打开，平衡12小时；(3).将酶标记的磺胺类药物抗原工作液用酶标记的磺胺类药物抗原稀释液l:200稀释(1份加199份稀释液)，再将PBS加入空白孔，对磺胺类药物标准溶液及待测样品进行双孔平行加样，同时加入稀释后的酶标记的磺胺类药物抗原工作液，封板振荡混匀13分钟，室温孵育0.51.5小时；(4).洗板机洗包被板4次，将孔内液体甩掉，用吸水纸扣干，每孔加入底物显色剂A液和底物显色剂B液按14.6:0.45比例的混合液，室温显色25~35分钟；(5).向孔中加入终止液，轻轻振荡混匀，读取450nm吸光值。本发明的有益效果和优点是1.本发明具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点，而且适用范围较广。主要适用于动物肌肉、组织、肝脏、蛋类、牛奶及制品、水产品等各种动物源性食品中磺胺类药物残留量的检测。其抗体具有良好的广谱性和灵敏度，检测极限低于100p^kg，所得抗体和酶标抗原稳定，具有常温保藏时间长的优点。2.本发明提供的快速检测方法操作简便、快速，完成全部检测操作过程只需1.5-2小时，而且检测的精确度可达90%以上，非常适合现场检测的需要。由于抗体和酶标抗原，在常温下可以保藏1周、酶标抗原包备的酶标板在4t:下可以保藏6个月以上，从而为进行大规模样品的集中检测，提供了极大的方便。3.本发明成本低廉、检测效率高、操作简便，既有经济效益又有社会效益，是一种创新性较高的具有良好的应用前景的动物源性食品中磺胺类药物多残留检测的试剂盒。图1为本发明动物源性食品中磺胺类药物多残留检测试剂盒托架的结构示意图；图2为本发明动物源性食品中磺胺类药物多残留检测试剂盒包被板的结构示意图；图3为本发明七种磺胺类药物标准曲线。具体实施方式本发明通过以下实施例进一步详述，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本动物源性食品中磺胺类药物多残留检测试剂盒，由盒体(未视出)、包被板9以及托架1构成，包被板采用96孔抗磺胺类药物多克隆抗体预包被板和托架固装在盒体内，其中托架上设置有磺胺类药物标准溶液凹孔5，其磺胺类药物标准溶液浓度为10mg/L，使用时用稀释液稀释至100)ig/L后，再按1:3稀释六个梯度；酶标记的磺胺类药物抗原工作液凹孔3，其酶标记的磺胺类药物抗原工作液使用时用酶标记的磺胺类药物抗原稀释液按1:200倍稀释；酶标记的磺胺类药物抗原稀释液凹孔6，其酶标记的磺胺类药物抗原稀释液为50mmol/L磷酸盐-0.9%NaCl缓冲溶液，pH7.4，使用时用二次水按1:5稀释；底物显色剂A液凹孔7:其底物显色剂A液含过氧化氢脲的醋酸钠缓冲液；底物显色剂B液凹孔8:其底物显色剂B液含3,3'，5,5'-四甲基对二氨基联苯(TMB)的二甲基亚砜溶液；终止液凹孔4，其终止液为1.25mol/LH2S04;浓縮洗涤液凹孔2，其浓縮洗涤液为1%吐温的磷酸盐缓冲液。一种应用在动物源性食品中磺胺类药物多残留检测试剂盒的检测方法包括以下步骤1.室温下样品的前处理称取样品与缓冲液剧烈混匀2min，滤纸过滤，用移液器取滤液以l:4倍稀释，样品稀释倍数20倍。2.所有试剂及标本在检测实验前必须置室温(2(TC士5'C左右)，将试剂盒打开，平衡l小时以上；3.将酶标记的磺胺类药物抗原工作液用酶标记的磺胺类药物抗原稀释液1:200稀释(l份加199份稀释液)，再将PBS加入空白孔，对磺胺类药物标准溶液及待测样品进行双孔平行加样，同时加入稀释后的酶标记的磺胺类药物抗原工作液，封板振荡混匀2分钟，室温孵育l小时；4.洗板机洗包被板4次，将孔内液体甩掉，用吸水纸扣千，每孔加入底物显色剂A液和底物显色剂B液按14.6:0.45比例的混合液，室温显色30分钟；5.向孔中加入终止液，轻轻振荡混匀，读取450nm吸光值。下面通过一具体实例，对本发明的效果进行叙述。检测猪肉样品中残留的的磺胺类药物l.样品处理称取4克样品与20mLPBS缓冲液剧烈混匀2min，滤纸过滤，用移液器取滤液以1:4倍稀释(50PBS缓冲液加150pL滤液)。样品稀释倍数20倍。其中以上所有试剂和样品处理必须室温下进行。样品检测所有试剂及标本在检测实验前必须置室温(2(TC士5X:左右)，将试剂盒打开，平衡1小时以上；取出框架及需要数量的微孔条，将不用的微孔条放入自封袋，保存于4'C;根据所需用量将酶标记的磺胺类药物抗原工作液用酶标记的磺胺类药物抗原稀释液l:200稀释(l份加199份稀释液)，仅供现检测用。(未经稀释的酶标记的磺胺类药物抗原于4'C保存)；加样设空白孔一孔，加PBS100iiL;将标准溶液及待测样品进行双孔平行加样100^iL，同时加入稀释后的酶标记的磺胺类药物抗原工作液100mL;封板振荡混匀2分钟，室温孵育1小时；洗板机洗板4次，将孔内液体甩掉，用吸水纸扣干，每孔加入显色剂A和显色剂B按0.45:14.6比例混合(用前15分钟内混合)的混合液150jiL，室温显色30分钟；每孔加入终止液5(HiL，轻轻振荡混匀，读取450nm吸光值(以空白孔作零吸光值，建议用双波长450/650nm检测，在加入终止液15分钟内读完数据)。2.结果的计算(1)计算抑制率值按公式(A)计算不同浓度磺胺药物对抗原抗体结合反应的抑制率IC%=;^样品-zJ空白—,4对照-^空白x100....................................(A)式中IC%一磺胺药物对抗原抗体结合反应的抑制率；A——450nm吸光值与650nrn吸光值的差值；A样品一磺胺药物标准液或样液的平均吸光度值；A空白——不加入酶标及磺胺药物标准液的平均吸光度值。(2)绘制标准曲线以抑制率为纵坐标，磺胺药物浓度对数为横坐标绘制校正曲线。每次试验均应重新绘制标准曲线，见图3。(3)结果计算从图1绘制的标准曲线上读取样液抑制率所对应的磺胺药物浓度(C)，按公式(B)计算试样中的磺胺药物残留量X=CxR....................................(B)式中X——试样中磺胺药物残留量，单位为微克每千克(^g/kg);C——根据样品孔的抑制率查得试样中磺胺药物浓度，单位为微克每升R——某类样品换算系数，分别为猪肉25;鸡肉25;猪肝20;鸡蛋25;牛奶40;鱼25;3.试剂盒灵敏度、特异性、精密度、准确度和保存期试验a)试剂盒灵敏度试验50%抑制浓度(即IC5o，指O标准溶液的吸光度值的50%处所对应的药物浓度)常作为评价竞争ELISA试剂盒灵敏度的指标，分别测定20次标准曲线的50%抑制浓度，确定该试剂盒七种磺胺类药物标准曲线ICsc应在1.314pg/L的范围之内。分别测定20份猪肉、鸡肉、鱼、鸡蛋、猪肝、牛奶的空白样品及20份磺胺0标准品，并将测定平均值加3倍标准差作为最低检测限。结果判定该试剂盒对磺胺二甲异噁唑，磺胺噻唑，磺胺甲氧嘧啶，磺胺甲氧哒嗪，磺胺吡啶，磺胺甲基硫代二嗪，磺胺氯达嗪的检出限分别为0.1，0.2，0.4，1.5，1.6，2.1，3.0ng/L。对实际样品的最低检测限见表1，除牛奶中的磺胺氯达嗪外，均能满足最大残留限量的要求。表l实际样品中七种磺胺类药物的最低检测限<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(2)试剂盒特异性试验以抗体与结构类似化合物的交叉反应程度，以抑制抗体最大结合率的50^所需目标分析物的浓度IC5。i与所需各种结构类似化合物的浓度IC5。m之比的百分数表示，即交叉反应率C.R(X)。C.R(%)=IC50i/IC50m*100交叉反应越小，抗体特异性越高，交叉反应越大，抗体广谱性越高。试剂盒广谱性试验结果如表2所示，结果表明该试剂盒对7种磺胺类药物的交叉反应率均210%，说明该试剂盒针对磺胺类药物的广谱性较好，可保证对动物源性食品中七种磺胺类药物的同时检测。表216种磺胺类药物对磺胺二甲异噁唑的交叉反应率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>磺胺甲氧哒嗪8.415磺胺吡啶1013磺胺甲基硫代二嗪12.810磺胺氣达嗪149磺胺甲基嘧啶19"7磺胺多辛314磺胺嘧啶324磺胺喹沙啉卯1.4磺胺二甲嘧啶1301磺胺甲噁唑1351磺胺噁唑1500.9磺胺地索辛1900.7磺胺异噁挫>200<0.7(3)试剂盒精密度试验标准可重复性从三批酶标板中，每板各抽出20个微孔，测定同一浓度标准溶液的吸光度值(OD值)，重复测定10次，计算变异系数，变异系数范围在0.89%13.02%。样品可重复性取不同浓度的磺胺标样，添加到样品中，分别取三个不同批次的试剂盒各三个，每个浓度重复5次，分别计算板内，批内，批间变异系数。动物组织的变异系数均低于15%，肝脏的变异系数均低于21%，蛋类的变异系数均低于16%，牛奶的变异系数均低于18%。试剂盒的准确度-取3个浓度的磺胺标样，对样品进行添加回收试验，每个浓度设4个平行，分别计算回收率，见表3。表3不同样品中磺胺类药物的加标回收率待测物添加水平样品猪肉鸡肉猪肝蛋类牛奶鱼磺胺二甲异噁唑5076.699.8131.5103.7104.981.51008U92.398.896.7111.995.720081.6訓84.9113.6119.080.3磺胺噻唑50120.0102.065.0110.5115.998.5100103.189.682.4105.8113.6105.2200跳8101.588.5122.0104.0歸磺胺甲氧嘧啶5082.5135.8131.9125.4111.277.610080.0118.0113.1U4.7124.483.620077.995.613U121.5130.975.7磺胺甲氧哒嗪5099.5132.4134.7122.1117.8119.510079.3115.5107.8101.3119.299.220068.2122.5109.9116.8123.581.0<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(4)试剂盒保存期试验试剂盒保存条件为2-8°C，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50%抑制浓度、磺胺添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37'C保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20'C冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8'C至少可以保存6个月以上。权利要求1.一种动物源性食品中磺胺类药物多残留检测试剂盒，由盒体、包被板以及托架构成，包被板和托架固装在盒体内，其特征在于该托架上设置有(1)磺胺类药物标准溶液凹孔其磺胺类药物标准溶液浓度为8～12mg/L，使用时用稀释液稀释至90～105μg/L后，再按1∶3稀释六个梯度；(2)酶标记的磺胺类药物抗原工作液凹孔其酶标记的磺胺类药物抗原工作液使用时用酶标记的磺胺类药物抗原稀释液按1∶200倍稀释；(3)酶标记的磺胺类药物抗原稀释液凹孔其酶标记的磺胺类药物抗原稀释液为磷酸盐缓冲溶液，pH7.4，使用时用二次水按1∶5稀释；(4)底物显色剂A液凹孔其底物显色剂A液为含过氧化氢脲的醋酸钠缓冲液；(5)底物显色剂B液凹孔其底物显色剂B液为含3，3′，5，5′-四甲基对二氨基联苯(TMB)的二甲基亚砜溶液；(6)终止液凹孔其终止液为1.25mol/LH2SO4；(7)浓缩洗涤液凹孔其浓缩洗涤液为1％吐温的磷酸盐缓冲液。2.根据权利要求1所述的动物源性食品中磺胺类药物多残留检测试剂盒，其特征在于所述的包被板为96孔抗磺胺类药物多克隆抗体预包被板，并且其由微孔条组成，其制备是由含多抗的磷酸盐缓冲液(pH9.6)，包被22~26小时，加入封闭液封闭、冻千、真空包装。3.根据权利要求1所述的动物源性食品中磺胺类药物多残留检测试剂盒，其特征在于所述的封闭液为含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。4.根据权利要求2所述的动物源性食品中磺胺类药物多残留检测试剂盒，其特征在于所述的多克隆抗体是选用雌性大白兔进行五次免疫后，由兔子的耳缘静脉采集血液进行效价检测，并离心获得抗血清，使用G-Sephamse蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化。5.根据权利要求1所述的动物源性食品中磺胺类药物多残留检测试剂盒，其特征在于所述的托架为泡沫塑料材质或者纸制材质。6.—种动物源性食品中磺胺类药物多残留检测试剂盒的检测方法包括以下步骤(1).室温下样品的前处理；(2).所有试剂及标本在检测实验前必须置室温(2(TC士5'C左右)，将试剂盒打开，平衡12小时；(3).将酶标记的磺胺类药物抗原工作液用酶标记的磺胺类药物抗原稀释液l:200稀释(1份加199份稀释液)，再将PBS加入空白孔，对磺胺类药物标准溶液及待测样品进行双孔平行加样，同时加入稀释后的酶标记的磺胺类药物抗原工作液，封板振荡混匀1~3分钟，室温孵育0.5~1.5小时；(4).洗板机洗包被板4次，将孔内液体甩掉，用吸水纸扣干，每孔加入底物显色剂A液和底物显色剂B液按14.6:0.45比例的混合液，室温显色25~35分钟；(5).向孔中加入终止液，轻轻振荡混匀，读取450nm吸光值。全文摘要本发明属于食品检测分析
技术领域：
，尤其是一种动物源性食品中磺胺类药物多残留检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒由盒体、包被板以及托架构成，包被板和托架固装在盒体内，其中该托架上设置有(1)磺胺类药物标准溶液凹孔；(2)酶标记的磺胺类药物抗原工作液凹孔；(3)酶标记的磺胺类药物抗原稀释液凹孔；(4)底物显色剂A液凹孔；(5)底物显色剂B液凹孔；(6)终止液凹孔；(7)浓缩洗涤液凹孔。本发明具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点，而且适用范围较广，检测效率高，操作简便，既有经济效益又有社会效益。文档编号G01N33/543GK101221172SQ20071005643公开日2008年7月16日申请日期2007年1月11日优先权日2007年1月11日发明者燕张,张鸿雁,硕王,磊王,郑文杰申请人:天津科技大学