一种鼠免疫状态监测试剂及其制备方法

专利名称：：一种鼠免疫状态监测试剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及医用配置品，具体涉及来源于动物材料的医用配置品。技术背景移植排斥反应(transplantationrejection)是由移植抗原诱导的免疫应答所导致的移植物功能丧失或受者机体损害，是临床移植失败的主要原因和移植免疫学所致力克服的关键难题。在同种移植中，即使外科手术十分成功，移植物也会因排斥反应而不能长期存活。因此，移植排斥一直是医学界研究的重点，在移植排斥的研究过程中，受体免疫状态检测是必不可少的环节。但是目前仍然没有一种可靠的试剂/方法可以检测受体免疫状态，现有的受体免疫状态检测的主要是通过检测一些免疫学指标间接反映免疫状态，均存在不同缺陷。常用检测指标有以下几种1、外周血T细胞计数。研究表明，CD4/CD8比值同移植排斥反应有关。排斥反应往往发生于CD4/CD8比值低下的患者中，用单克隆抗体免疫荧光法或流式细胞仪测定T细胞及其亚群，在急性排斥的临床症状出现前，T细胞总数和CD4/CD8比值升高，而巨细胞病毒感染时比值降低；各家报道的比值不同，一般认为当比值大于1.2时，预示急性排斥即将发生；比值小于1.08则感染的可能性很大。如果能进行动态监测，对急性排斥和感染的鉴别诊断会有重要价值。然而，也有一些学者认为，CD4/CD8比值与排斥反应没有直接关系，不同的研究结果争执不下源于CD4和CD8亚群的种型多样性(heterogeneity)。例如CD8可分为抑制型和细胞毒型，还有部分NK细胞亦表达CD8抗原。同样，CD4也可根据CD29和CD45的表达分为成熟型和初始型，既使是区分了各种亚型，CD4、CD8同移植排斥反应的关系仍不明显，还有待于进一步研究。2、杀伤细胞CTL和NK细胞活性测定。移植后因免疫抑制剂的应用，杀伤细胞的活性受抑制，但在急性排斥前会明显增高。目前常用的方法为体外试验，取供者淋巴细胞灭活后作为刺激细胞，分离受者淋巴细胞作反应细胞，将两种细胞混合直接做单向混合淋巴细胞试验，测得的结果是Tc细胞和NK细胞共同作用的结果。3、MHC分子检测。器官移植排斥反应所识别的靶抗原主要是表达于移植物细胞表面的MHC分子。MHC分子可通过直接途径和间接途径被受者T细胞识别，它在器官移植排斥反应中有重要的作用。MHC分子在体内广泛分布，人体中MHC有2种形式一是以膜抗原形式存在于几乎所有组织细胞表面，二是以可溶形式存在于血清、尿液、精液、乳汁、唾液等多种体液与分泌液中。血清可溶性MHC分子检测比较方便，用ELISA检测血清可溶性HLA—抗原水平，可提示排斥反应。目前血清可溶性MHC分子检测在国内应用较多。相对于血清可溶性MHC分子，外周血单个核细胞表面MHC分子受到外界影响较小。外周血单个核细胞在移植术后发生排斥时，表面表达MHC分子水平增高，目前研究的主要是MHC—II分子。细胞表面MHC分子的检测还不成熟，流式细胞术是应用较早的方法，分子生物学方法特别是荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)的应用使细胞表面MHC分子的检测应用日渐广泛。在人类HLA—DR作为T淋巴细胞的活性化标志，排斥反应发生时HLA—DR阳性化T淋巴细胞增加，而近期也有文献指出HLA—叫阳性化单核细胞增加可以作为移植急性排斥反应早期诊断的有效性指标。但人类末梢血中的单核细胞几乎都是HLA—DR、HLA—叫，作为抗原提呈细胞在机能成熟的过程中CD80、CD86、CD40等为先导，HLA—DR表现在细胞表面，所以一部分学者认为以此作为免疫应答初期阶段的指标是比较合理的。4、细胞因子测定。血清IL-2R测定，T细胞激活后可释出IL-2R，在急性排斥和病毒感染时IL-2R的血清含量升高，以巨细胞病毒感染时增高最明显。且个体间血清IL-2R的含量差别显著，无公认的诊断标准，限制了它的临床的应用，动态测定可克服这一缺点。细胞免疫在排异反应中发挥着主要作用，目前研究表明Thl/Th2淋巴细胞的平衡在移植免疫反应中相当重要。移植肾发生急性排斥反应时，抗原递呈细胞识别外来抗原，经信号传递及Th细胞活化。Thl淋巴细胞可通过分泌IFN—y、IL一2、工L一12等细胞因子促使TDTH细胞和Tc细胞的增殖、分化、成熟。从而促发细胞免疫应答，最终导致急性移植物排斥。Th2淋巴细胞可通过释放TL一4，TL一10等细胞因子刺激B细胞增殖并产生特异性抗体，从而在慢性移植物排斥反应中发挥一定的作用。近年来部分动物移植耐受研究提示，增强Th2淋巴细胞功能的同时常可抑制Thl细胞的表达，从而有利于外周耐受的建立。通过对Thl/Th2淋巴细胞相关细胞因子的测定，可以反应免疫状态。目前也是免疫状态监测研究热点之一。5、Perforin、颗粒酶B、CD40L和FasL的测定。细胞毒效应分子的表达正在成为诊断急性排斥反应的敏感而特异的指标。急性排斥反应时在外周血淋巴细胞中或移植物局部组织中的Perforin、颗粒酶B和CD40L基因、表达均明显升高。6、在免疫耐受诱导中嵌合体状态或基因治疗将来有可能成为免疫检测的指标。嵌合现象是指受者体内存在具有移植物抗原活性的细胞，即嵌合体(microchimerism)。Starzl等认为嵌合体可能是维持免疫耐受的原因之一。有资料显示，临床上嵌合体的消失与慢性排斥的发生有关。通过大量的研究，人们发现嵌合在移植后不同的时期及不同的移植器官中均可出现，在急、慢性排斥中也可出现。7、循环抗体检测。群体反应性抗体(PRA)是指器官移植受者体内的抗HLA抗体，由于人类白细胞抗原的多样性，相应的抗体种类也是多种多样的。移植术后2周,受者血清即可出现抗HLA抗体。术前术后的PRA高低同术后急性排斥反应明显相关，因此动态测定PRA水平尤为重要，也是目前广泛被承认和应用的一项监测指标。PRA的应用已有多年，但近来采用酶联免疫吸附法测定抗体的特异性多达40余种。为诊断分析带来困难。其他方法如血清补体测定等也有报道，但其意义不确切。目前常用的检测方法1、51Cr释放试验。检测特异性T淋巴细胞毒性试验目前最常用标准试验方法仍是51Cr释放试验，本法结果准确、重复性好；但也存在以下不足①使用放射性的51Cr有r射线放射性危险，不利于安全操作及废物处置，且需特殊测定仪器；②51Cr自发释放率高，有些细胞标记问题及敏感性低等，常因不同靶细胞标记效率变化差别大而影响结果判定；③51Cr半衰期(27.8天)，无法用于需多次测定的动物试验；细胞共育时间短而试验操作步骤多，不能在单个细胞水平进行测定。因此多年来人们一直试图寻找可以替代51Cr释放法的CTL活性测定方法，如采用荧光标记、流式细胞分析和报告基因等技术的灵敏可靠、简单易行的非同位素测定法。且51Cr释放试验为体外试验，试验本身只是测定CTL及NK细胞的活性，只在一定程度上反应细胞免疫状况，不能全面反应体内复杂的免疫环境。2、采用ELISA法将受体血清中的细胞因子浓度作为监测指标，以及用RT—PCR法检测移植物活检标本中细胞因子mRNA的方法的有效性得到了一些学者的认可，但是细胞因子是一个复杂的网络，单一细胞因子不能全面反映免疫状态。3、固相酶联免疫斑点试验(Enzyme-linkedImmunospotAssayELISP0T):ELISP0T通过检测抗原诱导的细胞因子(如IFN-y)的分泌，可在体外定量测定病人PBMC中抗原特异性T细胞反应(T细胞受抗原剌激产生并释放IFN-y)。本法在肽特异性分泌IFN-y的T细胞数量与细胞毒活性之间，与标准的51Cr释放法相关良好，是一种在临床试验中监测病人对肿瘤抗原或移植抗原的CTL或Th-细胞反应的灵敏、准确、价廉、的方法。但是仅能通过细胞因子间接反应免疫状态。4、Luminex:是一个多功能的液相芯片分析平台，通常用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究。液相芯片技术，可以同时检测多个细胞因子。5、分子生物学技术近年来，伴随着细胞分子生物学技术的进步，移植物内mRNA的检测成为可能，免疫应答过程的研究提高到了分子水平，免疫指标在诊断中的价值受到关注。6、流式细胞仪技术随着流式细胞仪技术的进步，细胞抗原的研究得到进一步发展。利用CD3、CD4、CD8和细胞内Thl及Th2多重染色的方法发现，应用流式细胞仪技术在急性排斥反应的病例中可监测到活性化初期T淋巴细胞(CD69)、IL一2阳性T淋巴细胞(T)增加，细胞内IL一4/IL一10阳性T淋巴细胞(Th2)减少，排斥反应时Thl/Th2失衡。由于免疫反应的复杂性，虽然各种检测技术有了长足的进步，上述免疫学检测方法虽然检测精确程度不断提高，但是均有其局限性，依靠单一指标不足以判断机体复杂的免疫状态，建立一种在多指标基础上的联合评估模式(pattern/profile)来监测移植后受体免役状态是免疫学家及移植工作者需要解决的难题。目前临床上衡量器官移植后排斥反应及免疫抑制治疗的效能主要通过排斥反应的发生情况(病理活检)和移植物功能情况来进行评估。但是移植物活组织病理检査也有其局限性其一.活检组织检测是一种损伤性检查方法，对移植物的正常存活有一定的影响，不能反复采取样本，另外，采取样本过少又会影响病理切片读片的正确性。其二.活检组织病理学检查是非定量性指标，影响其临床诊断的准确性，病理学检查容易受读片者的主观因素及技术水平的影响，产生偏倚，缺乏客观性。其三.病理切片检查无法对浸润性淋巴细胞做功能性评判，不利于排斥反应的早期诊断.在排斥反应发生的早期或移植物失功能的受者，甚至临床上表现为稳定型的受者，病理活检切片都可看到大量T淋巴细胞浸润，或仅表现为斑点性T细胞浸润。
发明内容本发明提供一种鼠免疫状态监测试剂，可以快速、直观、准确的监测移植手术后鼠的免疫状态。本发明实现上述目的的技术方案是一种鼠免疫状态监测试剂，该试剂是经二乙酰羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯(carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester，CFSE)染色的两种近交系的鼠脾细胞的PBS悬液，其中两种鼠脾细胞的总浓度为0.5lxl()S个/ml，二者的比例为1:1，荧光染色浓度差为1:20。本发明所述的免疫状态监测的悬液的制备方法，该方法由以下步骤组成1)分别取两种近交系的鼠脾细胞，用PBS悬浮并调整细胞浓度，得到两种浓度均为107+/niL的细胞悬液；2)将浓度为10mM的CFSE的二甲亚砜溶液以50倍的PBS稀释后得200nMCFSE工作液；3)往步骤1所得的一种细胞悬液中加入步骤2所得的CFSE工作液，使CFSE的终浓度为0.3nM，往步骤1所得的另一种细胞悬液中加入步骤2所得的CFSE工作液，使CFSE终浓度为6pM，然后在温度为37t:下孵育染色1520分钟；4)分别收集步骤3所得的细胞悬液中的染色细胞，用0.01M的4"CPBS洗涤23次后重悬于PBS;5)按细胞数1:1的比例混合步骤4所的两种染色细胞悬液，并用PBS调整细胞总浓度为0.51X108个/fflL，即可。在实际生产过程中，需要对本发明所述的免疫状态监测的悬液抽样检测与监控。具体检测方法如下-取本发明试剂混匀后取0.5ml加入试管，再加入O.5ml0.4°/。台盼兰染液，混匀，静置1-2分钟。同时，准备好血细胞计数板及盖玻片。将本发明试剂吸出少许，适量滴加在盖片边缘，使本发明试剂充满盖片和计数板之间。静置0.5分钟后，用倒置光学显微镜镜下观察计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的；然后按下式计算细胞数/ml二4大格细胞总数/4X10000，分别统计细胞总浓度，以及死细胞(深蓝色)浓度，用细胞总浓度减去死细胞浓度即为本发明所述悬液的浓度。用流式细胞术检测本发明试剂的染色率，PBS处理的细胞为阴性参照，将本发明试剂样本上流式细胞仪，设定488run激发/525nm滤过，测定染色阳性细胞比例需大于95%。本发明所述的两种近交系的鼠脾细胞，其中一种为测试细胞，来自于和移植供体同一近交系的鼠个体，该细胞与移植物同基因，抗原性与移植物完全相同，能被因移植产生的免疫反应特异性杀伤，准确地反映移植物所受的免疫攻击；另一种为内参照细胞，来自于和移植受体同一近交系的鼠个体，与受体同基因，作为免疫状态监测的内参，用于消除由于细胞破碎、死亡、归巢等一系列细胞在体外染色处理及体内自然死亡等非特异性损失带来的误差。在本发明中，并没有特别规定哪一种细胞是测试细胞，哪一种细胞是内参照细胞，这是由移植手术的受体和供体的选择所决定的与受体同一近交系的鼠细胞为内参照细胞，与供体同一近交系的鼠细胞为供体细胞。当将本发明试剂通过静脉注射到移植模型鼠后，可通过抽血检测不同时间段本发明试剂中两种细胞的比例变化来判断移植模型鼠的免疫状态。一般情况下，若注射后24小时两种细胞的比例即表现出明显差异(测试细胞急剧下降，内参照细胞则变化微小)，说明受体鼠机体免疫系统对移植物处于高排斥状态。由于本发明试剂中的两种细胞均经过同种荧光染料不同浓度的染色，可通过流式细胞仪方便直观地检测出受体内两种荧光细胞的比例变化。本发明所述的鼠免疫状态检测试剂，能直观地，准确的，全面的监测移植后免疫状态(1)通过与内参照受体细胞的直接对比，比较测试细胞与内参照细胞的流式细胞仪检测峰的峰下面积的大小能快速直观的知道检测结果，不需要再做复杂的计算即能了解受体对移植物的免疫情况；(2)流式细胞测试可准确到单个细胞水平，结果可靠；(3)测试细胞的抗原性与移植物完全相同，结果能准确的反映移植物所受的免疫攻击；内参照的设立消除了细胞由于破碎、死亡、归巢等一系列细胞在体外染色处理及体内自然死亡等非特异性损失带来的误差；(4)通过测试细胞的特异性损失来反映免疫状态，而不是片面的依靠某一个细胞因子的升高或降低，或者某一群细胞的多少，活性高低来判断，其结果更全面、准确。下面将通过动物实验证明本发明所述的免疫状态监测试剂能有效地检测移植后受体的免疫反应状态。一实验材料(一)实验动物健康、清洁级、近交系C57BL/6j(C57;H-2b)雌性小鼠，68周龄，体重1622g(实验动物质量合格证号:SCXK2006-0015，2006B008,2005A044),作为供体。BALB/c(BALB;H-2d)雌性小鼠68周龄，体重16~22g(实验动物质量合格证号SCXK2006-0015，2006B008,2005A046),作为受体。购自南方医科大学实验动物中心。SPF级饲养。实验前观察1周，标准饲料喂养，饮水随意。(二)主要试剂1、CFDA-SECellTracerKit:Molecularprobes公司(美国)2、二甲亚砜(DMSO):Sigma3、多聚甲醛广州化学试剂厂4、0.5%台盼蓝溶液广州化学试剂厂5、双蒸水本院制剂中心6、氯化铵广州化学试剂厂7、红细胞裂解液精密称取NH4C10.83g、KHC030.lg和EDTA2Na0.004g溶于1000ml三蒸水。8、PBS缓冲液(O.1M):精密称取NaCl8.00g,KC10.20g，Na2HP042.08g，KH2P040.20g溶于1000ml三蒸水。(三)主要实验仪器1、电子分析天平ER120A美国2、台式高速离心机TDL-50B上海3、超净工作台ThermoForma美国4、CCM哮箱SL-JC-2323美国5、OLYMPUS相差显微镜CK-2日本6、OLYMPUS照相系统PM-CBAD日本7、低温离心机Eppendorf德国8、微量加样器Eppendorf德国9、恒温水浴箱Grant美国10、流氏细胞仪EPICSEUTEBeckman-Coulter公司11、荧光倒置显微镜LEICA德国12、pH酸度计pHS-25型上海二、实验方法1、试验分组建立C57—BALB/c小鼠皮肤移植排斥模型后，尾静脉注射本发明试剂(制备方法见实施例l)，按输注后不同时间点分为7组，分别为lh、2h、4h、10h、ld、2d、6d组，每组5只模型鼠，另设同系移植BALB/c—BALB/c对照组。2、皮肤移植模型的建立按近交系小鼠皮肤移植国家标准，并根据试验观察需要进行了适当改良，步骤如下1)将试验材料置于高压锅内121'C、40min高压灭菌。2)随机取近交系C57小鼠10只，BALB/c小鼠35只。3)每只动物分别编号并称取体重，详细记录品系名称、性别、出生年月日、谱系及其他特征。4)用无菌生理盐水配制0.7%戊巴比妥钠溶液。5)采用腹腔注射麻醉动物。小鼠每10g体重注射0.1mL。6)首先麻醉C57供皮鼠，待动物麻醉失去知觉后，将其背部朝上放在固定板上，固定动物，备皮后并用3%碘酒棉球和75%酒精棉球消毒。7)在背部剪下直径5mm10mm的皮肤左右各一块。8)将剪好的皮片翻转过来放入带少量生理盐水的培养皿中，用眼科剪刀，轻轻地切去皮下组织至真皮，然后用无菌生理盐水冲洗后备用。9)麻醉受体BALB/c鼠。10)于背部逆毛方向移植C57皮片，并用5—0无创伤缝合线固定皮缘。11)覆盖涂过凡士林和青霉素G钠的纱布块，34层，用lcm宽橡皮膏固定，松紧适度。12)手术结束待动物苏醒后，把动物放入鼠盒内，并挂上标记卡片。13)同法进行对照组皮肤移植，供者皮肤为同一近交系BALB/c鼠。3、本发明试剂输注1)将小鼠固定鼠笼置中，仅鼠尾显露；2)温水浸泡鼠尾使尾静脉扩张；3)75%酒精消毒后，用4号头皮针穿刺成功后注射本发明试剂总量约0.5mL/只，每只小鼠注射细胞总数约为510乂107个。注射数量可以适当减少到1乂107个。4、流式细胞术分析小鼠外周血淋巴细胞中阳性细胞比例1)标本采集用消菌毛细管穿剌小鼠内眦取血，每次约200uL。2)流式细胞样品制备全血红细胞溶解法操作步骤如下a.取全血100ul，放入5ml试管。b.用2ml氯化铵液在室温下溶解红血球，约5min。若红细胞完全被溶解，溶液由混浊变到透明。注意溶解程度的掌握十分重要若溶解过分，则导致白细胞上抗原被破坏，或者某些敏感的细胞死亡而导致比例的改变。若溶解不彻底，大量红细胞会影响对淋巴细胞的分析。这是因为淋巴细胞在分析图像上与红细胞群接近，在框出淋巴细胞群时，会把部分红细胞框定于淋巴细胞内。而红细胞溶解不足或过度在很大程度上影响着分析结果。，c.红细胞被彻底溶解，加入lmlPBS稀释的0.5%甲醛，立即离心，用34ml冷BPS清洗。离心250Xg(约每分钟1500转)，5min;洗3次。注意每次用吸管将上清吸出，不能倾倒去液。d.将处理完成的细胞悬浮于0.5lml的0.1%甲醛溶液内。置4。C，蔽光，等待分析。经固定后的细胞在冰箱内可保存一周。若立即检测可不固定。e.上机检测上机打开流式细胞仪及氩离子激光源(488nm)，预热20min，仪器自动初始化，用标准荧光微球进行光路与流路标准，所有荧光信号的变异系数(cv)均小于2%，在前向散射光(FS)和侧向散射光(SS)散点图中圈定细胞群，选择淋巴细胞为分析对象，去除细胞碎片，用阴性对照确定荧光阴性范围及PMT电压标准，颜色补偿，每份标本测定10000个细胞，全部数据用流式细胞仪和软件SYSTEMII获取和分析。f.杀伤率计算特异性杀伤率(R)=1—donorcells/recipientcellsX100%5、统计学分析所有数据示为均数±标准差。应用SPSS13.0进行统计学分析，组间杀伤率均数比较用t检验，pO.05认为有统计学意义。三、实验结果1.皮肤移植模型观察1.1移植后一周后，发现由于急性排斥C57皮片周边而开始干瘪、脱落，皮肤移植后两周(13天)移植皮肤完全脱落，C57—BALB/c皮肤移植排斥模型建立。1.2对照组BALB/c同系皮肤移植，皮片脱痂，手术部位平整、有新毛长出。2.流式结果2.1两组的杀伤率情况如图1所示1)两种细胞输注后在模型组和对照组的比例变化不同，模型组与对照组输注本发明试剂lh、2h、4h、10h、1d、2d后对荧光染色C57小鼠脾细胞的特异性杀伤率有显著差异(t=39.5,41.1，26.2,27.4，15.8,5.5，所有P<0.01)。输注后一小时和两小时模型组中荧光染色C57小鼠脾细胞的杀伤率分别高达87.4%±4.5%、92.2%±3.9%。2)同系皮肤移植对照组小鼠在注射本发明试剂后14个小时外周血流式检测结果显示C57/BALB比例仍保持在注射时的细胞比例1:l左右，BALB/c小鼠未表现出对异基因C57脾细胞有特异性杀伤作用，而10小时才表现出对C57脾细胞又有轻度杀伤，然后随着时间的推移杀伤作用明显增强，到注射后三天C57细胞被全部杀灭。体内细胞毒性实验表明同系皮肤移植BALB/c小鼠对异基因C57细胞由开始的不杀伤，随着在体内时间的延长三天后才被全部杀伤，是一个逐渐杀灭的过程。3)皮肤移植模型体内杀伤过程与对照组则不同，注射后1个小时即表现出明显的杀伤，C57/BALB比例降低，C57细胞明显被杀灭，注射后2小时C57细胞就基本被完全清除，BALB表现出对供体细胞猛烈的杀伤特性。2.2两组动物实验流式图可直观反应的BALB/c小鼠免疫状态变化过程如图217所示1)同系皮肤移植对照组BALB/c小鼠在注射异基因C57脾细胞后10小时以内特异性细胞融解排斥反应弱，10小时外周血C57脾细胞仍然剩余83%。随着时间的延长BALB/c小鼠开始对C57脾细胞排斥反应逐渐增强，C57脾细胞在一天时后快速被裂解64%。脾细胞注射后第三天，异基因C57脾细胞基本被清除，仅剩余5%。2)而同基因的BALB/c脾细胞到灌注后第6天仍然较高水平存在，且亮度没有降低。3)模型组C57脾细胞在输注后1小时就只剩7%，在24小时剩余5%，基本被完全排斥，而同基因BALB/c脾细胞同对照组一样仅缓慢下降。4)两组结果表明体内细胞毒性实验在注射本发明试剂后2—4小时即表现出明显差异，选择这一时间点可以准确判定两组小鼠所处的免疫状态，两小时模型组小鼠杀伤率达到95%，说明小鼠机体免疫系统对供体特异性脾细胞处于高排斥状态，而同系皮肤移植对照组小鼠注射本发明试剂两小时后体内细胞杀伤率仅为5%,表明短期内对异基因细胞没有明显的特异性杀伤作用。因此本发明试剂可以准确的判断体内免疫系统的特异性免疫状态，即对某一供体是排斥还是耐受状态，选用本发明试剂注射后2小时作为监测点为最佳时间点，能满足临床快速检测的要求。2.3为进一步研究本发明试剂的稳定性我们进行了自身对照实验，由于同一只小鼠取血次数限制，每只小鼠取血时间点最多只能设定5次，试验动物采用未行皮肤移植空白对照BALB/c鼠及C57-BALB/C皮肤移植排斥模型，流式结果如下-2.3.1未行皮肤移植空白对照BALB/c鼠体内细胞毒性检测流式结果1)鼠l.不同时间点混合细胞比例变化如表1所示，(l)同基因BALB/c脾细胞能够在BALB/c小鼠外周血中长期存在，从输注后六天从占外周血淋巴细胞的3.2%降到1.8%，并且下降速度有减慢趋势，同时说明CFSE细胞毒性较小；较高浓度的CFSE(6yM)染色对脾细胞的活性影响小。同基因细胞减少的速度较慢可能是由于基本没有排斥作用，细胞是自然衰老死亡，开始下降速度快可能与细胞经过外机械处理破坏有关；(2)同BALB/c脾细胞相比，异基因的C57脾细胞在2小时仍表现出没有特异性灭活细胞比例仍在h1，而一天以后就快速消失，1天时己经从2小时的3.3%降到1.8%，三天是降到0.1%基本上全部消失，两种细胞除了MHC不同以外，在体外细胞获取、染色、体内免疫环境及检测时处理均相同，快速灭活只能时特异性抗原所致体内特异杀伤所致。但是由于BALB/c小鼠体内没有预存C57特异性抗体或特异性CTL细胞，所以对杀伤C57脾细胞的特异性杀伤在1天以后才明显的表现出来。(3)CFSE染色后自发性漏出少六天CFSE染色的脾细胞荧光强度没有减弱，仍然和两小时流式检测结果一样在103区域，说明CFSE自发性漏出少，是一种很好的体内细胞示踪的荧光燃料。(4)单染设计直方图的结果形式比双色更为简单、直观且能消除双染误差。表1鼠1不同时间点混合细胞比例变化的流式细胞仪检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2)鼠2体内细胞毒性检测流式结果如表2所示，鼠3体内细胞毒性检测流式结果如表3所示，其结果与鼠l基本一致，异基因C57细胞灭活在两天以后增快，而同基因BALB/c脾细胞消失在外周血中长期存在，灭失缓慢，六天时仍然大量存在，且CSFE荧光强度在一周内未见减弱，说明本方法试验结果可重复性强。表2鼠1不同时间点混合细胞比例变化的流式细胞仪检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3鼠1不同时间点混合细胞比例变化的流式细胞仪检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.3.2皮肤移植模型自身对照流式结果同一只皮肤移植模型小鼠注射混合细胞悬液后不同时间点外周血两种细胞比例变化情况如表4所示1)模型在两小时异基因C57细胞即只剩0.3%，而同基因对照BALB/c脾细胞高达5.7%;1天时异基因C57细胞即只剩0.1%，而同基因对照BALB/c脾细胞高达3.4%，6天时同基因BALB/c脾细胞仍有2.5%，与未行皮肤移植的正常BALB/c小鼠结果相比，同基因细胞在外周血中存在的时间一致，而移植模型对供体C57脾细胞有强大的杀伤作用；2)异基因C57脾细胞的快速灭活可能与移植致敏有关系，移植后体内存在大量供体特异性抗体及特异行CTL细胞，当与本发明试剂中的荧光染色C57细胞相遇时即对其发起猛烈的免疫攻击，使其迅速发生溶细胞效应而消失；3)本试验能够直观的看到两种细胞在模型小鼠体内的遭遇，异基因供体细胞迅速消失，而同基因细胞能长期存活，同基因细胞作为内参照细胞可以通过流式直方图直观的看出细胞比例变化，从而了解小鼠的免疫状态。表4同一只皮肤移植模型小鼠注射混合细胞悬液后不同时间点外周血两种细胞比例变化情况<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>图1是模型组和对照组对荧光染色C57细胞杀伤率随时间变化曲线，+表示对照组，一表示模型组。图2是注射本发明试剂后1小时模型组小鼠体内细胞特异性杀伤情况，Ml为荧光染色C57细胞的流式峰面积，M2为荧光染色BALB/c细胞的流式峰面积。图3是注射本发明试剂后1小时对照组小鼠体内细胞特异性杀伤情况，Ml为荧光染色C57细胞的流式峰面积，M2为荧光染色BALB/c细胞的流式峰面积。图4是注射本发明试剂后2小时模型组小鼠体内细胞特异性杀伤情况，Ml为荧光染色C57细胞的流式峰面积，M2为荧光染色BALB/c细胞的流式峰面积。图5是注射本发明试剂后2小时对照组小鼠体内细胞特异性杀伤情况，Ml为荧光染色C57细胞的流式峰面积，M2为荧光染色BALB/c细胞的流式峰面积。图6是注射本发明试剂后4小时模型组小鼠体内细胞特异性杀伤情况，Ml为荧光染色C57细胞的流式峰面积，M2为荧光染色BALB/c细胞的流式峰面积。图7是注射本发明试剂后4小时对照组小鼠体内细胞特异性杀伤情况，Ml为荧光染色C57细胞的流式峰面积，M2为荧光染色BALB/c细胞的流式峰面积。图8是注射本发明试剂后10小时模型组小鼠体内细胞特异性杀伤情况，Ml为荧光染色C57细胞的流式峰面积，M2为荧光染色BALB/c细胞的流式峰面积。图9是注射本发明试剂后10小时对照组小鼠体内细胞特异性杀伤情况，Ml为荧光染色C57细胞的流式峰面积，M2为荧光染色BALB/c细胞的流式峰面积。图IO是注射本发明试剂后1天模型组小鼠体内细胞特异性杀伤情况，Ml为荧光染色C57细胞的流式峰面积，M2为荧光染色BALB/c细胞的流式峰面积。图11是注射本发明试剂后1天对照组小鼠体内细胞特异性杀伤情况，Ml为荧光染色C57细胞的流式峰面积，M2为荧光染色BALB/c细胞的流式峰面积。图12是注射本发明试剂后2天模型组小鼠体内细胞特异性杀伤情况，Ml为荧光染色C57细胞的流式峰面积，M2为荧光染色BALB/c细胞的流式峰面积。图13是注射本发明试剂后2天对照组小鼠体内细胞特异性杀伤情况，Ml为荧光染色C57细胞的流式峰面积，M2为荧光染色BALB/c细胞的流式峰面积。图14是注射本发明试剂后3天模型组小鼠体内细胞特异性杀伤情况，Ml为荧光染色C57细胞的流式峰面积，M2为荧光染色BALB/c细胞的流式峰面积。图15是注射本发明试剂后3天对照组小鼠体内细胞特异性杀伤情况，Ml为荧光染色C57细胞的流式峰面积，M2为荧光染色BALB/c细胞的流式峰面积。图16是注射本发明试剂后6天模型组小鼠体内细胞特异性杀伤情况，Ml为荧光染色C57细胞的流式峰面积，M2为荧光染色BALB/c细胞的流式峰面积。图17是注射本发明试剂后6天对照组小鼠体内细胞特异性杀伤情况，Ml为荧光染色C57细胞的流式峰面积，M2为荧光染色BALB/c细胞的流式峰面积。具体实施方式例11)从C57小鼠和BALB/c小鼠中取出脾细胞，分别用PBS悬浮并调整细胞浓度为107个/mL;2)将浓度为10mM的CFSE的二甲亚砜溶液以50倍的PBS稀释后得200nMCFSE工作液；3)往C57小鼠脾细胞悬液中加入CFSE工作液染色使CFSE的终浓度为0.3uM，往BALB/c小鼠脾细胞悬液中加入CFSE工作液使CFSE终浓度为6yM，然后在温度为37°C，孵育染色15分钟；4)染色细胞用0.01M的4'CPBS洗涤2次后重悬于PBS;5)按细胞数1:1的比例混合两种荧光染色细胞，并调整细胞总浓度为5X107个/mL，即可。细胞活力检测适量细胞混合悬液稀释后，取一滴稀释液和一滴0.5%台盼蓝溶液混合，静置3min，加至细胞计数板，倒置显微镜下观察，活细胞不着色，死细胞核成蓝色，计数活细胞和死细胞数量，按下式计算百分比，活细胞比例达95%以上细胞存活率-O.5《台盼蓝染色阴性细胞/100个细胞/HPX100。流式细胞术分析CFSE标记细胞以PBS对照处理淋巴细胞为阴性参照，将CFSE标记淋巴细胞样本上流式细胞仪，设定488mn激发/525mn滤过，测定阳性细胞比例为大于95%。1)从C57小鼠和BALB/c小鼠中取出脾细胞，分别用PBS悬浮并调整细胞浓度为107个/mL;2)将浓度为10raM的CFSE的二甲亚砜溶液以50倍的PBS稀释后得200nMCFSE工作液；3)往C57小鼠脾细胞悬液中加入CFSE工作液染色使CFSE的终浓度为0.3yM,往BALB/c小鼠脾细胞悬液中加入CFSE工作液使CFSE终浓度为6uM，然后在温度为37'C，孵育染色17分钟；4)染色细胞用0.01M的4°CPBS洗涤3次后重悬于PBS;5)按细胞数1:1的比例混合两种荧光染色细胞，并调整细胞总浓度为8X107个/mL，即可。例31)从C57小鼠和BALB/c小鼠中取出脾细胞，分别用PBS悬浮并调整细胞浓度为107个/mL;2)将浓度为10mM的CFSE的二甲亚砜溶液以50倍的PBS稀释后得200uMCFSE工作液；3)往C57小鼠脾细胞悬液中加入CFSE工作液染色使CFSE的终浓度为0.3"M，往BALB/c小鼠脾细胞悬液中加入CFSE工作液使CFSE终浓度为M，然后在温度为37t)，孵育染色20分钟；4)染色细胞用0.01M的4。CPBS洗涤3次后重悬于PBS;5)按细胞数1:1的比例混合两种荧光染色细胞，并调整细胞总浓度为1X108个/mL，即可。权利要求1、一种鼠免疫状态监测试剂，该试剂是经CFSE染色的两种近交系的鼠脾细胞的PBS悬液，其中两种鼠脾细胞的总浓度为0.5～1×108个/ml，二者的比例为1∶1，荧光染色浓度差为1∶20。2、权利要求1所述的免疫状态监测试剂的制备方法，该方法由以下步骤组成1)分别取两种近交系的鼠脾细胞，用PBS悬浮并调整细胞浓度，得到两种浓度均为107+/mL的细胞悬液；2)将浓度为10mM的CFSE的二甲亚砜溶液以50倍的PBS稀释后得200^iMCFSE工作液；3)往步骤1所得的一种细胞悬液中加入步骤2所得的CFSE工作液，使CFSE的终浓度为0.3pM，往步骤1所得的另一种细胞悬液中加入步骤2所得的CFSE工作液，使CFSE终浓度为6pM，然后在温度为37"下孵育染色1520分钟；4)分别收集步骤3所得的细胞悬液中的染色细胞，用0.01M的4'CPBS洗涤23次后重悬于PBS;5)按细胞数1:1的比例混合步骤4所的两种染色细胞悬液，并用PBS调整细胞总浓度为0.51X108个/mL，即可。全文摘要本发明提供了一种鼠免疫状态监测试剂，该试剂是经CFSE染色的两种近交系的鼠脾细胞的PBS悬液，其中两种鼠脾细胞的总浓度为0.5～1×10⁸个/ml，二者的比例为1∶1，荧光染色浓度差为1∶20。将本发明试剂通过静脉注射到移植模型鼠，可通过抽血检测不同时间段本发明试剂中两种细胞的比例变化来判断移植模型鼠所处的免疫状态。文档编号G01N33/49GK101149371SQ20071003107公开日2008年3月26日申请日期2007年10月26日优先权日2007年10月26日发明者孙尔维,潘明新,王海澜,蒋泽生,袁小澎,聪马,毅高申请人:南方医科大学珠江医院